生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之凝膠回收基礎(chǔ)及操作

1、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之凝膠回收基礎(chǔ)及操作 膠回收基礎(chǔ)知識(shí)一一目 錄2 試劑耗材與設(shè)備三三 操作流程四四 常見(jiàn)問(wèn)題解答五五 方法及應(yīng)用二二 膠回收基礎(chǔ)知識(shí)一一目 錄3 試劑耗材與設(shè)備三三 操作流程四四 常見(jiàn)問(wèn)題解答五五 方法及應(yīng)用二二1.膠回收的概念2.膠回收的原理1.1 膠回收概念從電泳后的凝膠中回收目的DNA的過(guò)程，其目的是將目標(biāo)DNA重新利用。Lane M:1kb DNA MarkerLane 1:膠回收前的2.7kb DNA段Lane 2:膠回收后的2.7kb DNA段切割Lane 1后，經(jīng)處理回收DNA，經(jīng)電泳得到Lane 2。切割回收41.2 膠回收原理利用核酸在裂解液下與硅膠膜吸附柱特異性結(jié)

2、合，在洗脫液條件下被洗脫，從而達(dá)到核酸純化回收的目的。電泳后 ，切下凝膠稱(chēng)重后，加入等體積溶膠液上柱吸附DNA除膠脫鹽洗脫5 膠回收基礎(chǔ)知識(shí)一一目 錄6 試劑耗材與設(shè)備三三 操作流程四四 常見(jiàn)問(wèn)題解答五五 方法及應(yīng)用二二1.分類(lèi)2.應(yīng)用2.1 分類(lèi)1硅膠柱法2玻璃奶/純化填料法3低熔點(diǎn)瓊脂糖法4透析帶電洗脫法5DEAE纖維素膜紙片法72.1.1 硅膠柱法采用可以高效、專(zhuān)一結(jié)合DNA的硅基質(zhì)材料和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，從凝膠中回收DNA片段，同時(shí)除去蛋白質(zhì)、其它有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)鹽離子等雜質(zhì)。最簡(jiǎn)單快速的回收方法。不適合用于大片斷的回收。82.1.2 玻璃奶/純化填料法利用特殊玻璃微珠吸附DNA的特性

3、，根據(jù)每次回收實(shí)驗(yàn)時(shí)預(yù)期回收量來(lái)調(diào)整純化填料的量，使得實(shí)驗(yàn)不受限于柱子的載量，也不會(huì)造成浪費(fèi)。適合各種不同大小的片斷，特別是大片斷的回收。玻璃奶/純化填料法92.1.3 低熔點(diǎn)瓊脂糖法傳統(tǒng)手工操作方法之一，低熔點(diǎn)瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在TE溶液中65保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這個(gè)方法需要用到酚氯仿等有機(jī)試劑，由于乙醇沉淀需時(shí)較長(zhǎng)，現(xiàn)已較少使用。102.1.4 透析帶電洗脫法切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中電泳，讓 DNA跑出凝膠，跑向溶液中，再通過(guò)反向電泳，將附在透析帶上的DNA趕回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統(tǒng)方法酚抽沉淀。再次電泳后的膠

4、通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶很難操作，只有在回收非常大的片斷時(shí)才會(huì)考慮的。丙烯酰胺電泳凝膠產(chǎn)物回收的方法之一。112.1.5 DEAE纖維素膜紙片法將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE 纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳，條帶上的DNA被膜片截留，取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65保溫洗脫，直到膜上DNA被完全洗脫，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。 早期實(shí)驗(yàn)室最常用方法之一。這個(gè)方法不適合做較大的DNA，因?yàn)橄疵摫容^困難。122.2 應(yīng)用13 膠回收基礎(chǔ)知識(shí)一一目 錄14 試劑耗材與設(shè)備三三 操作流程四四 常見(jiàn)問(wèn)題解答五五 方法及應(yīng)用二二

5、1.試劑2.耗材3.設(shè)備3.1 試劑產(chǎn)品組成產(chǎn)品組成平衡液BL（Buffer BL）溶膠液PN（Buffer PN）漂洗液PW（Buffer PW)洗脫緩沖液EB（Buffer EB）吸附柱CA2（Spin Columns CA2）收集管（2mL）（Collection Tubes 2mL)153.2 耗材各種規(guī)格移液槍、槍頭 離心管163.3 設(shè)備離心機(jī)17 水浴鍋3.3 設(shè)備凝膠成像系統(tǒng) 水平電泳儀18 膠回收基礎(chǔ)知識(shí)一一目 錄19 試劑耗材與設(shè)備三三 操作流程四四 常見(jiàn)問(wèn)題解答五五 方法及應(yīng)用二二1.實(shí)驗(yàn)流程2.注意事項(xiàng)4.1 實(shí)驗(yàn)流程 向吸附柱CA2柱加入500L平衡液BL1 1200

6、0rpm,離心1min2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中3204.1 實(shí)驗(yàn)流程 將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下1放入干凈的離心管中2 稱(chēng)取重量3214.1 實(shí)驗(yàn)流程向膠塊中加入等體積溶液PN1 50水浴，不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，確保膠塊充分溶膠。2224.1 實(shí)驗(yàn)流程 將所得溶液加入 一個(gè)吸附柱CA2中，室溫放置2min1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中3234.1 實(shí)驗(yàn)流程 向吸附柱CA2中加入L漂洗液PW1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。重復(fù)操作1,2,33244.1 實(shí)驗(yàn)流程 將吸附柱CA2放回收集

7、管中1 12000rpm,離心2min2 將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，晾干3254.1 實(shí)驗(yàn)流程 將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈離心管中1 向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min2 12000rpm,離心2min收集DNA溶液326原理：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)稱(chēng)為電泳。 利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱(chēng)為電泳技術(shù)。4.1 實(shí)驗(yàn)流程27不同濃度大小瓊脂糖的有效分離范圍瓊脂糖濃度（）DNA有效分離范圍（Kb）0.53010.7120.81.0100.51.270.41.530.24.1 實(shí)驗(yàn)流程28在錐形瓶中加入1mL 50 xT

8、AE 、49mL蒸餾水、0.4g瓊脂糖，混勻；放入微波爐中加熱，約煮沸三次，冷卻至不燙手；加入2.5LNuclleic Acid Stain核酸染料，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，倒入已垂直插好梳子的鋪膠版中，待凝固。瓊脂糖凝膠制作上樣電泳取1L上樣緩沖 液 與5 L產(chǎn)物混勻垂 直 加 入 上 樣孔中。電泳條件：140V，20min。4.1 實(shí)驗(yàn)流程294.2 結(jié)果分析瓊脂糖凝膠電泳將電泳結(jié)束后的凝膠放在凝膠成像 系統(tǒng)中拍照保存。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析：看有無(wú)目的帶看是否存在非特異帶看條帶亮度切割回收304.2 注意事項(xiàng)1.洗脫體積不應(yīng)小于30L，體積過(guò)少影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。

9、若后續(xù)做測(cè)序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其pH值在7.08.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。314.2 注意事項(xiàng)2.平衡液BL的加入能夠改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和穩(wěn)定性，消除高溫/潮濕或其他不良環(huán)境因素對(duì)吸附柱造成的影響。使用前請(qǐng)先檢查平衡液BL是否出現(xiàn)渾濁，如有渾濁現(xiàn)象，可在37水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。324.2 注意事項(xiàng)3.電泳時(shí)最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。4.如下一步實(shí)驗(yàn)要求較高，則應(yīng)盡量使用TAE電泳緩沖液。.如果回收率較低，可在膠充分溶解后檢測(cè)pH值，如pH值大于7.5，可向含有DNA的膠溶液中加1030L3M醋酸鈉（pH5

10、.2)將pH值調(diào)制57之間。334.2 注意事項(xiàng).切膠是，紫外照射時(shí)間應(yīng)盡量短，以免對(duì)DNA造成損傷。7.回收10kb的DNA片段時(shí)，應(yīng)加大溶膠液的體積，延長(zhǎng)吸附和洗脫的時(shí)間。8.回收率與初始DNA量和洗脫體積有關(guān)，初始量越少、洗脫體積越少，回收率越低。34 膠回收基礎(chǔ)知識(shí)一一目 錄35 試劑耗材與設(shè)備三三 操作流程四四 常見(jiàn)問(wèn)題解答五五 方法及應(yīng)用二二5 常見(jiàn)問(wèn)題解答3636問(wèn)題問(wèn)題可能原因可能原因 用膠回收試劑 盒從凝膠中回 收DNA得率低 是什么原因？ 膠溶解不完全，可適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間和上下顛倒的次數(shù)以及增加溶膠液的比例 膠體積太大，可用槍頭搗碎，若不能充分溶解則先將其切為小塊，分多次回

11、收 紫外燈下切膠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致DNA部分降解，應(yīng)盡量把切膠時(shí)間控制 在30s以?xún)?nèi) 洗滌液使用后未及時(shí)蓋嚴(yán)瓶蓋，乙醇揮發(fā)，影響回收效率 TAE電泳緩沖液不新鮮，失去了緩沖能力，導(dǎo)致pH值升高，降低DNA和膜的吸 附力，應(yīng)及時(shí)更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液，效果更好 回收前的樣品量太少，加大點(diǎn)樣量 洗脫前，預(yù)先65預(yù)熱洗脫液、延長(zhǎng)室溫靜置時(shí)間、增加洗脫次數(shù)可 以有效提高回收率30%以上5 常見(jiàn)問(wèn)題解答37問(wèn)題解決方法加入溶膠液溫浴后，液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象？膠塊溶解不充分，可再補(bǔ)加一些溶膠液或延長(zhǎng)水浴時(shí)間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠膠塊體積過(guò)大，應(yīng)盡量切除多余部分，并將其切

12、為小碎塊，分幾次回收水浴溫度是否達(dá)到規(guī)定溫度65，用溫度計(jì)檢測(cè)瓊脂糖凝膠塊不溶？瓊脂糖質(zhì)量不好含目的片斷的凝膠在空氣中放置過(guò)久，使膠塊失水干躁，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存于4 或-20制膠的電泳緩沖液濃度過(guò)高或陳舊38膠回收標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程試劑耗材與設(shè)備試劑產(chǎn)品組成試劑產(chǎn)品組成平衡液BL（Buffer BL）溶膠液PN（Buffer PN）漂洗液PW（Buffer PW)洗脫緩沖液EB（Buffer EB）吸附柱CA2（Spin Columns CA2）收集管（2mL）（Collection Tubes 2mL)耗材耗材移液槍槍頭離心管設(shè)備設(shè)備凝膠成像系統(tǒng)離心機(jī)水浴鍋水平電泳儀39膠回收標(biāo)

13、準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程 向吸附柱CA2柱加入500L平衡液BL1 12000rpm,離心1min2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中3 將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下1放入干凈的離心管中2 稱(chēng)取重量340膠回收標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程向膠塊中加入等體積溶液PN1 50水浴，不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，確保膠塊充分溶膠。2 將所得溶液加入 一個(gè)吸附柱CA2中，室溫放置2min1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中341膠回收標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程 向吸附柱CA2中加入L漂洗液PW1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。重復(fù)操作1,2,33 將吸附柱CA2放回收集管中1 12000rpm,離心2min2 將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，晾干342膠回收標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程 將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈離心管中1 向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min2 12