原生質(zhì)體的培養(yǎng)與融合

1、第十一章第十一章 原生質(zhì)體的培養(yǎng)與融合原生質(zhì)體的培養(yǎng)與融合原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（Protoplast）l含義：含義：去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。具有生活力的裸露細(xì)胞。微微 絲絲葉綠體葉綠體線粒體線粒體質(zhì)質(zhì) 膜膜細(xì)胞核細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微微 管管細(xì)胞壁細(xì)胞壁高爾基體高爾基體液液 泡泡第一節(jié)第一節(jié) 原生質(zhì)體分離及純化原生質(zhì)體分離及純化l一、原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體分離雙子葉外植體雙子葉外植體胚性細(xì)胞胚性細(xì)胞l多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料多數(shù)植物分離

2、原生質(zhì)體的經(jīng)典材料- -葉肉細(xì)胞。葉肉細(xì)胞。（一）材料來源（一）材料來源l禾本科植物：禾本科植物： 愈傷組織或懸浮細(xì)胞。愈傷組織或懸浮細(xì)胞。（二）（二） 分離方法分離方法機(jī)械分離法機(jī)械分離法酶法分離法酶法分離法1、機(jī)械分離法（、機(jī)械分離法（Machanical isolation）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）能排除酶的有害影響能排除酶的有害影響；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；（2）方法繁瑣費(fèi)力；）方法繁瑣費(fèi)力；（3）局限性大）局限性大（1 1）酶的種類）酶的種類l纖維素酶類（纖維素酶類（CellulaseCellulase） l果膠酶類（果膠酶類（PectolyasePectol

3、yase）l半纖維素酶類（半纖維素酶類（HemicellulaseHemicellulase）l崩潰酶崩潰酶l蝸牛酶蝸牛酶2、酶法分離（酶法分離（Enzymatic isolation）（2 2）酶液的配制）酶液的配制滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑及及pH酶的配比及濃酶的配比及濃度度果膠酶：濃度不宜超過果膠酶：濃度不宜超過2%, 纖維素酶纖維素酶(1-2%)滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑:（500600mmol/L甘露醇甘露醇)（3 3）分離原生質(zhì)體）分離原生質(zhì)體兩步分離法兩步分離法一步分離法一步分離法方法有二：方法有二：葉肉原生質(zhì)體分離提純?nèi)~肉原生質(zhì)體分離提純圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）圖示原生質(zhì)

4、體分離過程（以葉片為例）過濾、離心過濾、離心加果膠酶加果膠酶和纖維素酶和纖維素酶葉片葉片愈傷組織愈傷組織二、二、 原生質(zhì)體純化與活力測定原生質(zhì)體純化與活力測定（一）原生質(zhì)體純化（一）原生質(zhì)體純化方法三種方法三種離心沉淀法離心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法1、 離心沉淀法l原理原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。原生質(zhì)體沉于底部。l步驟步驟：l第一步原生質(zhì)體溶液用第一步原生質(zhì)體溶液用400400目網(wǎng)篩過濾。目網(wǎng)篩過濾。l第二步離心（第二步離心（500-1000r/min500-1000r/min，離心，離心5-6min5-6min）。）。

5、l第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此沉淀。如此2-32-3次。次。l第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1 1次，收集原生質(zhì)次，收集原生質(zhì)體。體。2、漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。浮在液體的表面。l步驟步驟：l第一步：第一步：400400目網(wǎng)篩過濾。目網(wǎng)篩過濾。l第二步：濾液和高滲溶液混合，離心。第二步：濾液和高滲溶液混合，離心。l第三步：小心吸取上層原生質(zhì)體，洗滌液重復(fù)洗第三步：小心吸取上層原生質(zhì)體，洗滌液重復(fù)洗2-32-3次。次。l第四步：收集

6、溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1 1次。次。 3 、 界面法界面法25%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液原理：原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。（二）（二） 原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體活力測定1、形態(tài)識別：、形態(tài)識別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識別、染色識別l1 1）0.1%0.

7、1%酚番紅染色：有活力的不被染色，死亡酚番紅染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。的被染上色。l2 2）0.025%Evans0.025%Evans藍(lán)染色：藍(lán)染色：有活力但受損傷的細(xì)胞有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取 l2 2）雙醋酸鹽熒光素）雙醋酸鹽熒光素(FDA)(FDA)染色法：在熒光顯微鏡染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。第二節(jié)第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基pH滲透壓滲透壓鈣源鈣源生長物質(zhì)生長物質(zhì)氮源氮源碳源碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)基二、培養(yǎng)方法二、培養(yǎng)方法培

8、養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法肉眼可見細(xì)胞團(tuán)肉眼可見細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織器官發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑植株植株植株再生途徑植株再生途徑定義：定義：原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合也叫做也叫做體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交，使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。第三節(jié)第三節(jié) 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合一、原生質(zhì)體融合意義一

9、、原生質(zhì)體融合意義克服雜交不親合克服雜交不親合克服生殖器官敗育克服生殖器官敗育克服多胚現(xiàn)象克服多胚現(xiàn)象番茄番茄+ +馬鈴薯馬鈴薯二、融合方法二、融合方法 無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合 高高pH-高高Ca離子離子 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)法法 PEG結(jié)合高鈣結(jié)合高鈣-高高pH誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法 電融合技術(shù)電融合技術(shù)(一一)無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合: NaNO3法法l1972年：年： Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不

10、再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。不足：誘導(dǎo)頻率不高。 19731973年：年：KellerKeller用用pH10.5pH10.5的的50 mM CaCl50 mM CaCl2 2溶溶液在液在3737時，誘發(fā)煙草葉肉原時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。生質(zhì)體融合。優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高。優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高。不足：高不足：高pHpH值對細(xì)胞有毒害作用。值對細(xì)胞有毒害作用。（二）高（二）高pH-高高Ca離子法離子法PEG法法特點(diǎn)：特點(diǎn)：融合頻率高融合頻率高可重復(fù)性強(qiáng)可重復(fù)性強(qiáng)誘發(fā)融合無特異性誘發(fā)融合無特異性毒性較低毒性較低植物植物+ +植物植物植物植物+ +

11、動物動物動物動物+ +酵母酵母Polyethylene Glycol（聚乙二醇）（聚乙二醇）（三）PEG法PEG法法原理原理PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生重排導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。質(zhì)體的正性電荷部位

12、相連而導(dǎo)致融合。PEGPEG法法示意圖示意圖-+-橋梁橋梁+-PEG被洗掉被洗掉+-+-電荷重排電荷重排+-+-+-+-膜接觸膜接觸最為常用。最為常用。具體做法具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體- -滴加滴加PEGPEG溶液，搖勻，靜置溶液，搖勻，靜置-滴加高鈣滴加高鈣- -高高pHpH溶液，搖勻，靜置溶液，搖勻，靜置-滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次數(shù)次-離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)-篩選篩選-再再生雜合細(xì)胞生雜合細(xì)胞（四）（四）PEG結(jié)合高鈣結(jié)合高鈣-高高pH誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法(五五)電融合技術(shù)電融合技術(shù)Senda 首先用此方法實(shí)

13、現(xiàn)原生質(zhì)體融合首先用此方法實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合儀細(xì)胞融合儀電融合法原理電融合法原理 交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠?；刂姌O排列，形成串珠。+-負(fù)極負(fù)極正極正極+-+-+-+-+-+-+-+-施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-原生質(zhì)體的融合過程：原生質(zhì)體的融合過程：三、體細(xì)胞雜種細(xì)胞篩選與鑒定三、體細(xì)胞雜種細(xì)胞篩選與鑒定1 1互補(bǔ)選擇法互補(bǔ)選擇法2、機(jī)械分離雜種細(xì)胞法、機(jī)械分離雜種細(xì)

14、胞法3. 雙熒光標(biāo)記選擇法雙熒光標(biāo)記選擇法異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色）：綠色異硫氰酸羅丹明（異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色）：紅色3. 3. 雙熒光標(biāo)記選擇法雙熒光標(biāo)記選擇法四、體細(xì)胞雜種植株的鑒定四、體細(xì)胞雜種植株的鑒定q 形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)鑒定q 細(xì)胞學(xué)觀察細(xì)胞學(xué)觀察q DNA多態(tài)性分析多態(tài)性分析q 同工酶分析同工酶分析4-1、形態(tài)學(xué)鑒定、形態(tài)學(xué)鑒定4-2、細(xì)胞學(xué)觀察、細(xì)胞學(xué)觀察染色體形態(tài)和數(shù)目的比較染色體形態(tài)和數(shù)目的比較18條染色體條染色體36條染色體條染色體4-3 DNA多態(tài)性分析多態(tài)性分析RAPD帶型帶型（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA） 4-4 同功

15、酶鑒定同功酶鑒定l根據(jù)親本和雜種同功酶根據(jù)親本和雜種同功酶譜的差異來鑒別雜種。譜的差異來鑒別雜種。有的呈雙親譜帶的總和、有的呈雙親譜帶的總和、有的出現(xiàn)新譜帶或丟失有的出現(xiàn)新譜帶或丟失部分親本譜帶。常用的部分親本譜帶。常用的鑒定酶為：乙醇脫氫酶、鑒定酶為：乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、過氧化物乳酸脫氫酶、過氧化物酶、酯酶等。酶、酯酶等。l(1) 原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：l(2) 原生質(zhì)體分離方法：機(jī)械分離法、酶法分離。原生質(zhì)體分離方法：機(jī)械分離法、酶法分離。 l(3) 原生質(zhì)體的純化方法：離心沉淀法；漂浮法；原生質(zhì)體的純化方法：離心沉淀法；漂浮法；界面法。界面法。l(4)原生質(zhì)體活力的測定：形態(tài)識別；染色識別。原生質(zhì)體活力的測定：形態(tài)識別；染色識別。l(5)原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：液體淺層培養(yǎng)；平板法原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：液體淺層培養(yǎng)；平板法培養(yǎng)；懸滴法培養(yǎng)；雙層培養(yǎng)法；飼喂層培養(yǎng)培養(yǎng)；懸滴法培養(yǎng)；雙層培養(yǎng)法；飼喂層培