實驗-兩對半的檢測

1、 ELISAELISA檢測檢測“乙肝二對半乙肝二對半” (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA) 酶酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)分分類類 酶免疫組化酶免疫組化 酶免疫測定酶免疫測定 固固相相酶酶免免疫疫測測定定 液液相相酶酶免免疫疫測測定定均相酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定ELISAELISA的概念的概念酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzyme-linked immunosorbent assayenzyme-linked immunosorbent assay，ELISAELISA）酶聯(lián)酶聯(lián)：抗原或抗體的酶標(biāo)記。：抗原或抗體的

2、酶標(biāo)記。免疫免疫：以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)。：以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)。吸附吸附：抗原或抗體包被于固相載體表面。：抗原或抗體包被于固相載體表面。 在固相載體表面實現(xiàn)抗原抗體的反應(yīng)，通過酶標(biāo)記的手段，酶催化底在固相載體表面實現(xiàn)抗原抗體的反應(yīng)，通過酶標(biāo)記的手段，酶催化底物形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物質(zhì)，其顏色的深淺與標(biāo)本中的物形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物質(zhì)，其顏色的深淺與標(biāo)本中的抗原或抗體的量直接相關(guān)?？乖蚩贵w的量直接相關(guān)。ELISAELISA技術(shù)特點技術(shù)特點 具有良好的具有良好的靈敏度靈敏度和和特異性特異性，能滿足臨床，能滿足臨床需要，應(yīng)用廣泛。需要，應(yīng)用廣泛。 操作操作簡

3、單簡單、無需昂貴的儀器投入，價格、無需昂貴的儀器投入，價格便便宜宜。 對環(huán)境幾乎對環(huán)境幾乎沒有污染沒有污染。ELISAELISA技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 檢測抗原抗原的方法： 雙抗體夾心法 競爭法 檢測抗體抗體的方法： 雙抗原夾心法 間接法 競爭法 捕獲法實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握掌握ELISAELISA法檢測法檢測“乙肝二對半乙肝二對半” 的的原理、原理、操作步驟及注意事項。操作步驟及注意事項。 掌握檢測掌握檢測“乙肝乙肝二對半二對半”的臨床意義。的臨床意義。 什么是什么是“乙肝二對半乙肝二對半”？“乙肝兩對半乙肝兩對半”是指：是指：表面抗原（表面抗原（HBsAgHBsAg）、）、表面抗體（表面抗體

4、（HBsAbHBsAb）、）、e e抗原（抗原（ HBeAg HBeAg ）、）、e e抗體抗體（HBeAbHBeAb）、核心抗體（）、核心抗體（HBcAbHBcAb） HBsAgHBsAg本身不具有傳染性，只具有抗原性本身不具有傳染性，只具有抗原性 保護性抗體：保護性抗體： HBsAbHBsAb 傳染性指標(biāo)：傳染性指標(biāo)： HBeAg HBeAg ， HBcAgHBcAg HBeAbHBeAb， HBcAbHBcAb不是保護性抗體，而是反映不是保護性抗體，而是反映曾被曾被HBVHBV感染的重要指標(biāo)。感染的重要指標(biāo)。為什么不檢測核心抗原（HBcAg） HBcAgHBcAg主要位于病毒顆粒中，只有

5、少數(shù)游離。主要位于病毒顆粒中，只有少數(shù)游離。 機體免疫系統(tǒng)對機體免疫系統(tǒng)對HBcAgHBcAg很敏感，易產(chǎn)生高滴度的很敏感，易產(chǎn)生高滴度的HBcAb,HBcAb,與與HBcAgHBcAg 形成免疫復(fù)合物。形成免疫復(fù)合物。 血清中，血清中， HBcAgHBcAg可丟失部分氨基酸?？蓙G失部分氨基酸?！耙腋味Π胍腋味Π搿钡臋z測原理的檢測原理 HBsAgHBsAg：雙抗體夾心法雙抗體夾心法 HBsAbHBsAb：雙抗原夾心法雙抗原夾心法 HBeAgHBeAg：雙抗體夾心法雙抗體夾心法 HBeAbHBeAb：中和競爭法中和競爭法（血清中的（血清中的e e抗體與固相抗體與固相e e抗體競爭結(jié)合抗體競爭

6、結(jié)合e e抗原）抗原） HBcAbHBcAb：競爭抑制法競爭抑制法雙抗原（體）夾心法測抗體（原）包被抗原包被抗原酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原待測抗體待測抗體包被抗體包被抗體酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體待測抗原待測抗原Anti-HIV, Anti-HBs雙抗體夾心法雙抗體夾心法雙抗原夾心法雙抗原夾心法HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E競爭抑制法測抗體 包被抗原包被抗原待測抗體待測抗體*酶標(biāo)酶標(biāo)抗體抗體 Anti-HBcAnti-HBe中和競爭法測抗體包被抗體包被抗體中和抗

7、原中和抗原待測抗體待測抗體酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體Anti-HBe試劑盒組成 包被反應(yīng)板：固相的抗原或抗體包被反應(yīng)板：固相的抗原或抗體 酶結(jié)合物：酶標(biāo)記的抗原或抗體酶結(jié)合物：酶標(biāo)記的抗原或抗體 顯色劑：分顯色劑：分A A、B B二瓶二瓶 終止液終止液 對照：陽性對照，陰性對照對照：陽性對照，陰性對照 濃縮濃縮洗滌液洗滌液 中和試劑（中和試劑（只有檢測只有檢測HBeAbHBeAb的試劑盒才有的試劑盒才有）實驗準(zhǔn)備 配制洗滌液：用蒸餾水按配制洗滌液：用蒸餾水按1 1：2020稀釋濃縮洗稀釋濃縮洗滌液。滌液。 為節(jié)省試驗時間，除檢測為節(jié)省試驗時間，除檢測核心抗體（核心抗體（HBcAbHBcAb）組外，其余組

8、可在加樣后的溫育時間中才配組外，其余組可在加樣后的溫育時間中才配制洗滌液。制洗滌液。實驗操作實驗操作1、加樣：第一、二孔為陰、陽對照孔，分別加入陰、陽對加樣：第一、二孔為陰、陽對照孔，分別加入陰、陽對照照50ul50ul。其余各孔為樣品孔，各加入待測標(biāo)本。其余各孔為樣品孔，各加入待測標(biāo)本50ul50ul（檢檢測測HBcAb HBcAb 時，待測標(biāo)本需用稀釋后的洗滌液做時，待測標(biāo)本需用稀釋后的洗滌液做1 1：3030稀稀釋釋）。）。2 2、加中和試劑（、加中和試劑（只有檢測只有檢測HBeAbHBeAb時才需要時才需要）：每孔）：每孔50ul50ul3 3、加酶結(jié)合物：每孔、加酶結(jié)合物：每孔50u

9、l50ul4 4、溫育：封板、溫育：封板充分混勻后置充分混勻后置3737C C水浴水浴3030分鐘分鐘5 5、洗滌：棄去反應(yīng)條孔內(nèi)液體，用洗滌液注満每孔，放置、洗滌：棄去反應(yīng)條孔內(nèi)液體，用洗滌液注満每孔，放置或振蕩或振蕩1 1分鐘，棄去拍干分鐘，棄去拍干反復(fù)反復(fù)5 5次（次（注意：最后一次一注意：最后一次一定要拍干定要拍干）6 6、顯色：每孔先加顯色劑、顯色：每孔先加顯色劑A 50ulA 50ul，再加顯色劑，再加顯色劑B 50ulB 50ul，混，混勻后置勻后置3737C C水浴水浴1010分鐘分鐘7 7、中止顯色：每孔加入中止液、中止顯色：每孔加入中止液50ul50ul8 8、判斷結(jié)果：、

10、判斷結(jié)果：目測法目測法：反應(yīng)孔反應(yīng)孔顏色顏色結(jié)果結(jié)果陰性對照陰性對照透明無色透明無色陰性陰性陽性對照陽性對照黃色黃色陽性陽性樣品樣品黃色黃色？樣品樣品淺黃色淺黃色？樣品樣品透明無色透明無色？HBsAg， HBsAb， HBeAg HBeAb ， HBcAb反應(yīng)孔反應(yīng)孔顏色顏色結(jié)果結(jié)果陰性對照陰性對照黃色黃色陰性陰性陽性對照陽性對照透明無色透明無色陽性陽性樣品樣品黃色黃色？樣品樣品淺黃色淺黃色？樣品樣品透明無色透明無色？比色法：波長比色法：波長450nm450nm讀取各孔讀取各孔ODOD值值HBsAgHBsAg， HBsAbHBsAb， HBeAg HBeAg 樣品樣品ODOD值值/ /陰性對照

11、陰性對照ODOD值值2.1 2.1 HBeAb HBeAb ， HBcAbHBcAb陰性對照陰性對照ODOD值值/ /樣品樣品ODOD值值2.12.1（建議建議雙波長雙波長比色比色（450/630nm450/630nm）；）；臨界值的確定請參考實驗指臨界值的確定請參考實驗指導(dǎo)，不同的試劑盒和檢測原理，臨界值的設(shè)定均不同導(dǎo)，不同的試劑盒和檢測原理，臨界值的設(shè)定均不同）陽性陽性陽性陽性ELISA的注意事項標(biāo)本標(biāo)本：內(nèi)源性（：內(nèi)源性（RFRF、補體、嗜異性抗體等）、補體、嗜異性抗體等） 外源性因素（溶血、細菌污染、保存不當(dāng)、凝集不全、防腐劑外源性因素（溶血、細菌污染、保存不當(dāng)、凝集不全、防腐劑NaN

12、NaN3 3等）（等）（P229P229）試劑試劑：試劑質(zhì)量、批號、是否失效（冰箱溫度）、平衡（：試劑質(zhì)量、批號、是否失效（冰箱溫度）、平衡（3737度度C C3030分鐘）、搖勻分鐘）、搖勻加樣加樣：加樣準(zhǔn)確、不可太快，避免加在上部和產(chǎn)生氣泡。：加樣準(zhǔn)確、不可太快，避免加在上部和產(chǎn)生氣泡。溫育溫育：溫度（定期觀察與登記）、時間、濕度、封片（不可重復(fù)用）：溫度（定期觀察與登記）、時間、濕度、封片（不可重復(fù)用）洗板洗板：洗滌液用蒸餾水或去離子水現(xiàn)配、防止洗板機堵塞、洗完要拍板。：洗滌液用蒸餾水或去離子水現(xiàn)配、防止洗板機堵塞、洗完要拍板。顯色顯色：加試劑時不可重復(fù)加和漏加，或加在兩孔之間，不要產(chǎn)生

13、氣泡，及時終止。：加試劑時不可重復(fù)加和漏加，或加在兩孔之間，不要產(chǎn)生氣泡，及時終止。比色比色：建議用雙波長（可排除標(biāo)本濃度、干擾色、電路干擾、板底部劃痕的影響）。：建議用雙波長（可排除標(biāo)本濃度、干擾色、電路干擾、板底部劃痕的影響）。結(jié)果判定結(jié)果判定：反應(yīng)終止后：反應(yīng)終止后1010分鐘內(nèi)分鐘內(nèi)質(zhì)量控制：質(zhì)量控制：內(nèi)對照、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評等（全程質(zhì)控意識）內(nèi)對照、室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評等（全程質(zhì)控意識）表面抗原陽性結(jié)果表面抗原陽性結(jié)果、灰區(qū)標(biāo)本、矛盾結(jié)果或少見模式灰區(qū)標(biāo)本、矛盾結(jié)果或少見模式均須復(fù)查均須復(fù)查生物安全：生物安全：試劑盒應(yīng)視為有試劑盒應(yīng)視為有傳染性物質(zhì)傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程處理。常見的檢測模式（臨床意義（臨床意義2）模式模式 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 臨床意義臨床意義 1+-+-+急肝、慢肝活動期、有傳染性急肝、慢肝活動期、有傳染性2+-+急肝、慢性急肝、慢性HBsAg攜帶者攜帶者 3+-+急性急性HBV感染趨向恢復(fù)、感染趨向恢復(fù)、 慢性慢性HBsAg攜帶者、傳染性弱攜帶者、傳染性弱 4-+既往感染、急性既往感染、急性HBV