C8 酶免疫技術(shù)

1、定義：定義：酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記抗體或抗原為酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。應(yīng)用：應(yīng)用： 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) 應(yīng)用日益廣泛，是取代應(yīng)用日益廣泛，是取代放射免疫技術(shù)的主要方法之一。放射免疫技術(shù)的主要方法之一。第一節(jié)第一節(jié) 酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)l1.1.酶免疫技術(shù)是：酶免疫技術(shù)是：l酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用；酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用；l高度特異性、敏感性的抗原高度特異性、敏感性的抗原- -抗體反抗體反 應(yīng)的一種檢測方法。應(yīng)的一種檢測方法。l2.2.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：l靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好；靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)

2、確性好；l酶標(biāo)記試劑能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定；酶標(biāo)記試劑能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定；l方法簡單安全易行。方法簡單安全易行。一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物（一）要求（一）要求酶活性高：酶活性高：與抗原、抗體結(jié)合與抗原、抗體結(jié)合, ,不影響抗原抗體的反應(yīng)。不影響抗原抗體的反應(yīng)。酶催化底物后產(chǎn)生的產(chǎn)物易于判定或檢測酶催化底物后產(chǎn)生的產(chǎn)物易于判定或檢測方法簡單、敏感和重復(fù)性好。方法簡單、敏感和重復(fù)性好。酶活性穩(wěn)定；酶活性穩(wěn)定；酶及其底物等對(duì)人體無危害，理化性質(zhì)穩(wěn)酶及其底物等對(duì)人體無危害，理化性質(zhì)穩(wěn)定，且價(jià)廉易得。定，且價(jià)廉易得。 （二）常用酶及其底物（二）常用酶及其底物1.1.辣根過氧化物酶（辣根過氧化物

3、酶（horseradish horseradish peroxidase,HRPperoxidase,HRP）常用的底物有以下幾種：常用的底物有以下幾種：（1 1）鄰苯二胺（）鄰苯二胺（orthophenylenediaminoorthophenylenediamino，OPDOPD）：經(jīng)與酶反應(yīng)后顯橙黃色，作為底物，）：經(jīng)與酶反應(yīng)后顯橙黃色，作為底物，優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比色方便，是：靈敏度高，比色方便，是ELISAELISA中應(yīng)用中應(yīng)用 最早的底物。最早的底物。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：應(yīng)用液穩(wěn)定性差，配制后在：應(yīng)用液穩(wěn)定性差，配制后在1 1小時(shí)內(nèi)使小時(shí)內(nèi)使用，顯色反應(yīng)過程需避光，它還具致癌性。用，顯色反

4、應(yīng)過程需避光，它還具致癌性。24H SO（2 2）四甲基聯(lián)苯胺）四甲基聯(lián)苯胺（3,33,3,5,5,5,5tetramethylbenzidine,TMBtetramethylbenzidine,TMB）: :TMB + TMB + 酶作用后酶作用后藍(lán)色，便于目測觀察結(jié)果。藍(lán)色，便于目測觀察結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，成色反應(yīng)無需避光，無致突變：穩(wěn)定性好，成色反應(yīng)無需避光，無致突變作用等，是目前作用等，是目前ELISAELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。中應(yīng)用最廣泛的底物。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：是水溶性差。：是水溶性差。（3 3）其他：）其他：5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸也是常用之也是常用之HRPHRP底物。底物

5、。 24H SO2.2.堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,APalkaline phosphatase,AP）應(yīng)用應(yīng)用APAP系統(tǒng)的系統(tǒng)的ELISAELISA測定敏感性高于使用測定敏感性高于使用HRPHRP者。者。APAP不易獲得高純制品，穩(wěn)定性及酶不易獲得高純制品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物的吸收率低于標(biāo)記物的吸收率低于HRPHRP，且價(jià)格較高，故，且價(jià)格較高，故應(yīng)用不如應(yīng)用不如HRPHRP普及。普及。3.-3.-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-galactosidase-galactosidase，-GalGal）。）。 因人血中缺乏此酶，不易受到內(nèi)源性酶的因人血中缺乏此酶

6、，不易受到內(nèi)源性酶的干擾，因此也常用于均相酶免疫測定。干擾，因此也常用于均相酶免疫測定。 二、酶標(biāo)記抗體或抗原二、酶標(biāo)記抗體或抗原1 1、酶標(biāo)記的抗體或抗原也稱為、酶標(biāo)記的抗體或抗原也稱為結(jié)合物結(jié)合物（conjugateconjugate）是酶免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑。）是酶免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑。2 2、高質(zhì)量的酶標(biāo)記、高質(zhì)量的酶標(biāo)記AbAb（AgAg）與）與酶、酶、AbAb（AgAg）等原材料的特性及制備方法密切相關(guān)等原材料的特性及制備方法密切相關(guān)。3 3、酶標(biāo)記物的、酶標(biāo)記物的AgAg要求純度高，要求純度高，AgAg性完整（半性完整（半AgAg需先與大分子載體蛋白交聯(lián)）；需先與大分子載體蛋白交聯(lián)）

7、；4 4、AbAb需特異性好、效價(jià)高、親和力強(qiáng)以及比需特異性好、效價(jià)高、親和力強(qiáng)以及比活性較高，還要能批量生產(chǎn)和易于分離純活性較高，還要能批量生產(chǎn)和易于分離純化?；?。5 5、目前根據(jù)要求選用單克隆抗體、多克隆抗、目前根據(jù)要求選用單克隆抗體、多克隆抗體經(jīng)純化的體經(jīng)純化的IgIg組份、組份、IgIg的的FabFab等。等。 制備酶標(biāo)記物時(shí)，所用的方法應(yīng)用：制備酶標(biāo)記物時(shí)，所用的方法應(yīng)用： 方法簡單，且重復(fù)性好方法簡單，且重復(fù)性好 標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗體（抗原）的標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗體（抗原）的 活性活性 應(yīng)避免酶、抗體（抗原）以及酶標(biāo)記應(yīng)避免酶、抗體（抗原）以及酶標(biāo)記 物各自形成集合物物各自形成集

8、合物 標(biāo)記反應(yīng)易于控制等。標(biāo)記反應(yīng)易于控制等。 常用的抗體（抗原）酶標(biāo)記方法有；常用的抗體（抗原）酶標(biāo)記方法有； 交聯(lián)法和直接法兩種。交聯(lián)法和直接法兩種。交聯(lián)法交聯(lián)法是以雙功能交聯(lián)劑為是以雙功能交聯(lián)劑為“橋橋”，酶和抗體，酶和抗體（抗原）連接（抗原）連接結(jié)合物；結(jié)合物；直接法直接法是用過碘酸鈉活化酶蛋白分子是用過碘酸鈉活化酶蛋白分子再與抗體再與抗體（抗原）結(jié)合。（抗原）結(jié)合。 但該法僅適用于含糖蛋白分子的酶（如但該法僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRPHRP）標(biāo)記物制備。標(biāo)記物制備。 以以HRPHRP標(biāo)記抗體為例分別介紹兩種方法的基本原理：標(biāo)記抗體為例分別介紹兩種方法的基本原理：1.1.戊二醛交

9、聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 該法有一步法和兩步法兩種：該法有一步法和兩步法兩種：一步法：一步法：將將HRPHRP和抗體蛋白質(zhì)和抗體蛋白質(zhì) + + 戊二醛同時(shí)反應(yīng)連接而成；戊二醛同時(shí)反應(yīng)連接而成； 二步法：二步法：HRPHRP（有一定比例）（有一定比例）+ +戊二醛反應(yīng)連接戊二醛反應(yīng)連接 HRP-HRP-戊二戊二醛結(jié)合物醛結(jié)合物經(jīng)透析除去多余未結(jié)合的戊二醛經(jīng)透析除去多余未結(jié)合的戊二醛加入抗體蛋加入抗體蛋 + + 戊二醛的另一醛基交聯(lián)反應(yīng)戊二醛的另一醛基交聯(lián)反應(yīng)制制成成HRP-HRP-抗體標(biāo)記物。抗體標(biāo)記物。2.2.過碘酸鈉法過碘酸鈉法 在過碘酸鈉（在過碘酸鈉（NaIO4NaIO4）作用下）作用下多糖羥基多

10、糖羥基被氧化成活潑的醛基被氧化成活潑的醛基即可與抗體蛋白中即可與抗體蛋白中的游離氨基交聯(lián)的游離氨基交聯(lián)再經(jīng)硼氫化鈉還原終止再經(jīng)硼氫化鈉還原終止反應(yīng)反應(yīng)即得到穩(wěn)定的酶標(biāo)結(jié)合物。即得到穩(wěn)定的酶標(biāo)結(jié)合物。3.3.標(biāo)記抗體的純化與鑒定標(biāo)記抗體的純化與鑒定 三、固體載體三、固體載體（一）固相載體的要求（一）固相載體的要求1 1、固相載體應(yīng)與抗體（抗原）有高的結(jié)合容、固相載體應(yīng)與抗體（抗原）有高的結(jié)合容 量，且穩(wěn)定極少脫落；量，且穩(wěn)定極少脫落；2 2、生物大分子固相化后、生物大分子固相化后不影響活性不影響活性反應(yīng)充分。反應(yīng)充分。3 3、固相化方法應(yīng)簡便易行、快速經(jīng)濟(jì)。、固相化方法應(yīng)簡便易行、快速經(jīng)濟(jì)。 （

11、二）固相載體的種類和選擇（二）固相載體的種類和選擇1.1.塑料制品塑料制品 抗體抗體 + + 抗原抗原非共價(jià)或物理吸附機(jī)制非共價(jià)或物理吸附機(jī)制固固相載體表面。相載體表面。常用固相載體：常用固相載體： 聚苯乙烯聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板2.2.微顆粒微顆粒 此類固相載體系由高分子單體聚合成的微此類固相載體系由高分子單體聚合成的微球或顆粒。球或顆粒。 直徑多為微米直徑多為微米(m),(m), 易于抗體易于抗體( (抗原抗原) )形成化學(xué)偶聯(lián)形成化學(xué)偶聯(lián), ,且結(jié)合容量大且結(jié)合容量大. .3.3.膜載體膜載體 硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜(nitrocellul

12、ose NC)(nitrocellulose NC)、玻璃纖、玻璃纖維素膜及等微孔濾膜維素膜及等微孔濾膜. . 它們也是通過非共價(jià)鍵吸附抗體它們也是通過非共價(jià)鍵吸附抗體( (抗原抗原) )但但吸附能力強(qiáng)吸附能力強(qiáng), , 故已廣泛應(yīng)用于定性或半定量斑故已廣泛應(yīng)用于定性或半定量斑點(diǎn)點(diǎn)ELISAELISA的固相載體。的固相載體。 （三）、包被與封閉（三）、包被與封閉將抗原或抗體固相化的過程稱為包被將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating).(coating). 常用的聚苯乙烯固相載體常用的聚苯乙烯固相載體( (如如ELISAELISA板板) )即多采即多采用用吸附方式吸附方式包被抗原或抗體包

13、被抗原或抗體. .第二節(jié) 酶免疫技術(shù)的分類1 1、酶免疫技術(shù)是利用酶的高效催化和放大作用、酶免疫技術(shù)是利用酶的高效催化和放大作用與特異性抗原與特異性抗原- -抗體反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種抗體反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。標(biāo)記免疫技術(shù)。2 2、酶免疫技術(shù)組成：、酶免疫技術(shù)組成：首先是首先是Ag+AbAg+Ab免疫反應(yīng)免疫反應(yīng)復(fù)合物（其中包含復(fù)合物（其中包含有酶標(biāo)抗原或抗體的參與）；有酶標(biāo)抗原或抗體的參與）；加入酶作用底物加入酶作用底物酶標(biāo)中酶標(biāo)中Ag+AbAg+Ab的酶即催化的酶即催化其發(fā)生呈色反應(yīng)。其發(fā)生呈色反應(yīng)。產(chǎn)物的顏色與產(chǎn)物的顏色與Ag+AbAg+Ab復(fù)合物中酶標(biāo)記物的酶復(fù)合物中酶標(biāo)

14、記物的酶活性相關(guān)，活性相關(guān)，因此可以通過測定酶活性來確因此可以通過測定酶活性來確定待檢抗原或抗體的存在或含量。定待檢抗原或抗體的存在或含量。 酶免疫測定（酶免疫測定（EIAEIA）是利用酶標(biāo)記抗原或抗是利用酶標(biāo)記抗原或抗體做標(biāo)記物，用于檢測體做標(biāo)記物，用于檢測液體樣品液體樣品中可溶性中可溶性抗原或抗體含量的微量分析技術(shù)?？乖蚩贵w含量的微量分析技術(shù)。EIAEIA一般一般可分為均相和異相兩大類。可分為均相和異相兩大類。 酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 一、均相酶免疫測定一、均相酶免疫測定 均相酶免疫測定屬于競爭結(jié)合分析方法均相酶免疫測定屬于競爭結(jié)合分析方法. . 其原理是其原理是: : A

15、g Ag* * + Ab + Ab AgAg* *AbAb + + Ag Ag AgAb AgAb 不需分離不需分離, ,直接測定反應(yīng)系統(tǒng)中的總酶活直接測定反應(yīng)系統(tǒng)中的總酶活性的變化性的變化, ,即可推算出被測樣品中的即可推算出被測樣品中的AgAg的含量。的含量。EAb( (一一) )酶放大免疫測定技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù) 酶放大免疫測定技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)(enzyme-mutiplied (enzyme-mutiplied immunoassay technigue, EMIT)immunoassay technigue, EMIT)是最早且應(yīng)用是最早且應(yīng)用最廣的均相最廣的均相EIAEIA

16、，最終測得的酶活性隨著反應(yīng)體系中未最終測得的酶活性隨著反應(yīng)體系中未標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原(Ag)(Ag)濃度的升高而增強(qiáng)。濃度的升高而增強(qiáng)。（二）克隆酶供體免疫分析（二）克隆酶供體免疫分析 克隆酶供體免疫分析（克隆酶供體免疫分析（cloned enzyme donor cloned enzyme donor immunoassayimmunoassay，CEDIACEDIA）的）的基本原理基本原理是：是： DNADNA重組技術(shù)可分別合成某種功能性酶（如重組技術(shù)可分別合成某種功能性酶（如B-D-B-D-半乳糖苷酶）分子的兩個(gè)片段，半乳糖苷酶）分子的兩個(gè)片段，大片段稱為大片段稱為酶受體（酶受體（enzy

17、me acceptorenzyme acceptor，EAEA），小片段稱為酶），小片段稱為酶供體（供體（enzyme donorenzyme donor，EDED）。）。 單獨(dú)的單獨(dú)的EAEA和和EDED均無酶活性，但在一定條件下均無酶活性，但在一定條件下可結(jié)合形成具酶活性的四聚體?？山Y(jié)合形成具酶活性的四聚體。 EDAgEDAg最終測得的酶活力的大小與標(biāo)本抗最終測得的酶活力的大小與標(biāo)本抗原原(Ag)(Ag)含量成正比。含量成正比。 應(yīng)用：應(yīng)用：1 1、用于小分子激素和半抗原、用于小分子激素和半抗原( (如藥物如藥物) )的測的測 定。定。2 2、優(yōu)點(diǎn)：它由于勿需分離，操作簡單、優(yōu)點(diǎn)：它由于勿

18、需分離，操作簡單, ,還還易于自動(dòng)化分析。易于自動(dòng)化分析。3 3、缺點(diǎn)：是易受干擾（、缺點(diǎn)：是易受干擾（樣品中非特異的內(nèi)樣品中非特異的內(nèi)源性酶源性酶, ,酶抑制劑及交叉反應(yīng)物的）酶抑制劑及交叉反應(yīng)物的） 采用競爭性結(jié)合分析原理采用競爭性結(jié)合分析原理, ,靈敏度不靈敏度不及異向酶免疫測定。及異向酶免疫測定。二、異相酶免疫測定二、異相酶免疫測定 異相酶免疫測定是目前應(yīng)用最廣泛的一類標(biāo)記異相酶免疫測定是目前應(yīng)用最廣泛的一類標(biāo)記免疫測定技術(shù)，免疫測定技術(shù)，基本原理：基本原理：1 1、抗原抗體反應(yīng)平衡后、抗原抗體反應(yīng)平衡后需要分離游離和結(jié)合需要分離游離和結(jié)合形成復(fù)合物的酶標(biāo)記物，形成復(fù)合物的酶標(biāo)記物，2

19、 2、然后對(duì)經(jīng)酶催化的底物顯色程度進(jìn)行測定，、然后對(duì)經(jīng)酶催化的底物顯色程度進(jìn)行測定，再推算出樣品中待測抗原再推算出樣品中待測抗原( (或抗體或抗體) )的含量。的含量。 依據(jù)測定方法是否采用固相材料以吸附抗依據(jù)測定方法是否采用固相材料以吸附抗原或抗體，又分為液相和固相酶免疫測定兩原或抗體，又分為液相和固相酶免疫測定兩類類. .。( (一一) ) 異相液相酶免疫測定特點(diǎn)異相液相酶免疫測定特點(diǎn) 用于檢測樣品中極微量的短肽用于檢測樣品中極微量的短肽激素和某些藥物等激素和某些藥物等小分子半抗原小分子半抗原; ; 酶標(biāo)記物具更好的穩(wěn)定性酶標(biāo)記物具更好的穩(wěn)定性, ,且且無放射性污染無放射性污染, ,故近年

20、來有取代放故近年來有取代放射免疫測定的趨勢射免疫測定的趨勢. . 平衡法和非平衡法兩種平衡法和非平衡法兩種( (二二) )固相酶免疫測定固相酶免疫測定固相酶免疫測定特點(diǎn)：固相酶免疫測定特點(diǎn)：(solid phase enzymeimmunoassay(solid phase enzymeimmunoassay，SPEIA),SPEIA),1 1、利用、利用固相支持物作載體固相支持物作載體預(yù)先吸附抗原或預(yù)先吸附抗原或 抗體；抗體；2 2、使測定時(shí)的免疫反應(yīng)在其表面進(jìn)行并形成、使測定時(shí)的免疫反應(yīng)在其表面進(jìn)行并形成 抗原抗體復(fù)合物；抗原抗體復(fù)合物；3 3、洗棄反應(yīng)液中無光物質(zhì)并加入酶底物后、洗棄反應(yīng)

21、液中無光物質(zhì)并加入酶底物后, ,4 4、通過測定固相載體上的酶標(biāo)記物催化底物、通過測定固相載體上的酶標(biāo)記物催化底物 生成的有色產(chǎn)物生成的有色產(chǎn)物, ,確定樣品中抗原或抗體確定樣品中抗原或抗體 的含量。的含量。第三節(jié)第三節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)(ELISA)于于19711971年分別年分別由瑞典學(xué)者由瑞典學(xué)者EngrallEngrall和和Perlman,Perlman,荷蘭學(xué)者荷蘭學(xué)者VanWeemanVanWeeman和和SchuursSchuurs報(bào)道報(bào)道. . 它開創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)它開創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液

22、體標(biāo)本中微量物質(zhì)測定的實(shí)驗(yàn)方法。本中微量物質(zhì)測定的實(shí)驗(yàn)方法。 基本原理：基本原理：1 1、把抗原或抗體預(yù)先結(jié)合到固相載體表面、把抗原或抗體預(yù)先結(jié)合到固相載體表面 ( (在不損壞其免疫活性的條件下在不損壞其免疫活性的條件下););2 2、測定時(shí)、測定時(shí), ,將受檢樣品將受檢樣品( (含帶測抗體或抗原含帶測抗體或抗原) )和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物; ;3 3、反應(yīng)終止時(shí)、反應(yīng)終止時(shí), ,固相載體上的酶標(biāo)抗原或抗固相載體上的酶標(biāo)抗原或抗 體被結(jié)合量體被結(jié)合量(

23、(免疫復(fù)合物免疫復(fù)合物) )即與標(biāo)本中待檢即與標(biāo)本中待檢 抗體或抗原的量成一定比例抗體或抗原的量成一定比例; ;4 4、經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其它物質(zhì)、經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其它物質(zhì), ,加入酶底加入酶底 物后物后, ,5 5、底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)、底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn) 物物, ,6 6、最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可、最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可 確定樣品中待測物質(zhì)含量。確定樣品中待測物質(zhì)含量。二、方法類型二、方法類型以下舉例介紹幾種常用的檢測以下舉例介紹幾種常用的檢測AgAg方法。方法。1 1、雙抗體夾心法、雙抗體夾心法 雙抗體夾心法，屬非競爭結(jié)合測定

24、。雙抗體夾心法，屬非競爭結(jié)合測定。 它是它是檢測抗原檢測抗原最常用的最常用的ELISAELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的適用于檢測分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測 基本工作原理：基本工作原理：1 1、是利用連接于固相載體上的、是利用連接于固相載體上的抗體抗體和和酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體可分別與樣品中被檢測可分別與樣品中被檢測抗原抗原結(jié)合，結(jié)合，形成固相抗形成固相抗體體- -抗原抗原- -酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。2 2、由于固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待檢抗、由于固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待檢抗原

25、是過量的。原是過量的。 因此復(fù)合物的形成量與待檢抗原的含量因此復(fù)合物的形成量與待檢抗原的含量成正比。成正比。3 3、測定復(fù)合物中酶作用于加入的底物后生成的、測定復(fù)合物中酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量有色物質(zhì)量(OD(OD值值) )，即可確定待檢杭原含量，即可確定待檢杭原含量1、已知抗體包 被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體 與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物 不產(chǎn)生顏色雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包 被于載體表面2、加待檢物無抗 原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體 無抗原結(jié)合+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE

26、E2、雙位點(diǎn)一步法、雙位點(diǎn)一步法3.3.競爭法競爭法 特點(diǎn)：特點(diǎn)：酶標(biāo)酶標(biāo)抗原抗原與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記抗原非標(biāo)記抗原與與固固相抗體相抗體有相同結(jié)合的能力有相同結(jié)合的能力反應(yīng)中反應(yīng)中, ,固相抗體和酶標(biāo)抗原是固相抗體和酶標(biāo)抗原是固定限量固定限量反應(yīng)后反應(yīng)后, ,結(jié)合于固相載體上的復(fù)合物中被測定結(jié)合于固相載體上的復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)抗原的量的酶標(biāo)抗原的量( (酶活性酶活性) )與樣品中非標(biāo)記抗原與樣品中非標(biāo)記抗原的濃度成的濃度成反比反比. .競爭法測抗原競爭法測抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待檢物、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗抗原與酶標(biāo)抗原競爭與

27、抗體原競爭與抗體結(jié)合結(jié)合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不顯色的底物不顯色或顯色弱或顯色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色的底物顯色1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面2 2、加待測物、加待測物和酶標(biāo)抗原，和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合體結(jié)合E E以下舉例介紹幾種常用的檢測以下舉例介紹幾種常用的檢測AbAb方法。方法。1.1.間接法間接法 此法是測定抗體最常用的方法，此法是測定抗體最常用的方法，屬非競爭結(jié)合試驗(yàn)。屬非競爭結(jié)合試驗(yàn)。原理：原理：（1 1）將）將抗原抗原聯(lián)接到聯(lián)接到固相載體固相載體上，樣品中待檢

28、上，樣品中待檢抗體與抗體與抗原抗原結(jié)合成結(jié)合成固相抗原固相抗原- -受檢抗體復(fù)合物受檢抗體復(fù)合物；（2 2）再用）再用酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗與固相免疫與固相免疫復(fù)合物中的抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，結(jié)合，形成形成固相抗原固相抗原- -受檢抗體受檢抗體- -酶標(biāo)二抗復(fù)合物酶標(biāo)二抗復(fù)合物；（3 3）測定加底物后的顯色程度，確定待檢抗體含量）測定加底物后的顯色程度，確定待檢抗體含量 間接法：采用的酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球間接法：采用的酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子蛋白分子( (如抗人如抗人IgG),IgG),具有更廣的通用性。具有更廣的通用性。 1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶

29、標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色間接法測抗體間接法測抗體- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E抗原包被抗原包被陽性血清陽性血清(含抗體含抗體)洗滌洗滌加酶作用底物加酶作用底物加終止液加終止液競爭法競爭法原理：原理：類似檢測抗原的競爭法類似檢測抗原的競爭法 應(yīng)用應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)(HBcAb)和乙和乙型肝炎病毒型肝炎病毒e e抗體抗體(HBeAb)(HBeAb)的檢測的檢測 3 3、競爭法測抗體、競爭法測抗體E EE

30、EE E2 2、加待檢抗、加待檢抗體與酶標(biāo)抗體體與酶標(biāo)抗體競爭與抗原競爭與抗原結(jié)合結(jié)合3 3、加酶作、加酶作用的底物，用的底物，顯色強(qiáng)弱與顯色強(qiáng)弱與待測抗體成待測抗體成反比反比3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色，的底物顯色，顯色強(qiáng)弱與顯色強(qiáng)弱與待測抗體成待測抗體成反比反比1 1、已知抗原包、已知抗原包被于載體表面被于載體表面1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面2 2、加待測抗體、加待測抗體和酶標(biāo)抗原，和酶標(biāo)抗原，待測抗體與固待測抗體與固相抗體競爭與相抗體競爭與酶標(biāo)抗原結(jié)合酶標(biāo)抗原結(jié)合E EE EE EE E4.4.捕獲法捕獲法 （亦稱反向間接法）（亦稱反向間接法）ELISA

31、ELISA， 主要用于血清中某種抗體亞型成分主要用于血清中某種抗體亞型成分（如（如IgMIgM）的測定。）的測定。捕獲法原理捕獲法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待測物、加待測物特異性特異性IgMIgM與與非特異性非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結(jié)合性抗體結(jié)合4 4、加酶標(biāo)抗體、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色合，加底物顯色2 2、加待測物、加待測物只有非特異性只有非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性抗、加