第六章 細菌遺傳分析

1、第六章第六章 細菌的遺傳分析細菌的遺傳分析 真核生物基因分離、自由組合及連鎖交換均通真核生物基因分離、自由組合及連鎖交換均通過有性過程過有性過程(減數(shù)分裂減數(shù)分裂受精受精)實現(xiàn)。細菌和實現(xiàn)。細菌和病毒均屬于原核生物不存在嚴格意義上的有性病毒均屬于原核生物不存在嚴格意義上的有性過程。過程。 但細菌細胞內(nèi)除了染色體外還有一些寄生性復(fù)但細菌細胞內(nèi)除了染色體外還有一些寄生性復(fù)制因子制因子(如噬菌體和質(zhì)粒，也被稱為核外或染如噬菌體和質(zhì)粒，也被稱為核外或染色體外因子色體外因子)，它們可以在細胞間傳遞，并且，它們可以在細胞間傳遞，并且形成細菌染色體間以及細菌染色體與核外遺傳形成細菌染色體間以及細菌染色體與核

2、外遺傳因子間的重組體。因子間的重組體。 這種重組體結(jié)構(gòu)類似于真核生物減數(shù)分裂過程中形這種重組體結(jié)構(gòu)類似于真核生物減數(shù)分裂過程中形成的重組體結(jié)構(gòu)。成的重組體結(jié)構(gòu)。第一節(jié)第一節(jié) 細菌的細胞和染色體細菌的細胞和染色體 一、細菌細胞一、細菌細胞 細胞比較小，僅含有細胞比較小，僅含有1-2條染色體，每條附著在細胞膜條染色體，每條附著在細胞膜上的一定區(qū)域，無核膜，稱擬核。細菌每上的一定區(qū)域，無核膜，稱擬核。細菌每20分鐘繁殖分鐘繁殖一代一代 二、細菌染色體二、細菌染色體 大都是雙鏈大都是雙鏈DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長度從環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長度從2535000不等，裸不等，裸露，無蛋白質(zhì)結(jié)合，也不形成核小體，所以其染色體露

3、，無蛋白質(zhì)結(jié)合，也不形成核小體，所以其染色體的顯著特點是：易于接受帶有相同或不同物種的基因的顯著特點是：易于接受帶有相同或不同物種的基因或或DNA片段的插入。片段的插入。 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體DNA以折疊或螺旋狀態(tài)存在，且依賴以折疊或螺旋狀態(tài)存在，且依賴于于RNA分子的作用。（分子的作用。（P156） 第二節(jié)第二節(jié) 大腸桿菌的突變型及篩選大腸桿菌的突變型及篩選 一、大腸桿菌的突變類型一、大腸桿菌的突變類型（一）合成代謝功能的突變型（一）合成代謝功能的突變型（anabolic functional mutants) : 合成代謝功能合成代謝功能(anabolic function):野生

4、型（原養(yǎng)野生型（原養(yǎng)型）品系在基本培養(yǎng)基上具有合成所有代謝和型）品系在基本培養(yǎng)基上具有合成所有代謝和生長所必須的復(fù)雜有機物的功能。生長所必須的復(fù)雜有機物的功能。 營養(yǎng)缺陷型：營養(yǎng)缺陷型：一個必需的基因發(fā)生了突變不能一個必需的基因發(fā)生了突變不能進行一個特定的生化反應(yīng)，從而阻礙整個合成進行一個特定的生化反應(yīng)，從而阻礙整個合成代謝功能的實現(xiàn)。代謝功能的實現(xiàn)。 條件致死突變條件致死突變 （二）分解代謝功能的突變型（二）分解代謝功能的突變型（catabolic functional mutants):條件致死突變型。條件致死突變型。 分解代謝功能（分解代謝功能（ anabolic function）：野

5、生型：野生型大腸桿菌能利用比葡萄糖復(fù)雜的不同碳源，因大腸桿菌能利用比葡萄糖復(fù)雜的不同碳源，因為它能把復(fù)雜的糖類轉(zhuǎn)化成葡萄糖或其他簡單為它能把復(fù)雜的糖類轉(zhuǎn)化成葡萄糖或其他簡單的糖類，也能把復(fù)雜分子如氨基酸或脂肪酸降的糖類，也能把復(fù)雜分子如氨基酸或脂肪酸降解為乙酸或三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。這些降解解為乙酸或三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。這些降解功能稱功能稱。 同樣，一系列降解功能的實現(xiàn)也需要許多基因同樣，一系列降解功能的實現(xiàn)也需要許多基因的表達，其中任何一個基因突變都會影響降解的表達，其中任何一個基因突變都會影響降解功能的實現(xiàn)。功能的實現(xiàn)。 （三）抗性突變型：細菌由于某基因的突變而（三）抗性突變型：細菌由于

6、某基因的突變而對某些噬菌體或抗生素產(chǎn)生抗性。對某些噬菌體或抗生素產(chǎn)生抗性。 二、突變型的篩選二、突變型的篩選 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型的篩選、鑒定：的篩選、鑒定： 選擇培養(yǎng)法是根據(jù)菌株在基本培養(yǎng)基和營養(yǎng)（補充）選擇培養(yǎng)法是根據(jù)菌株在基本培養(yǎng)基和營養(yǎng)（補充）培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)將菌株分為原養(yǎng)型培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)將菌株分為原養(yǎng)型(也稱為原生也稱為原生營養(yǎng)型營養(yǎng)型)與營養(yǎng)缺陷型與營養(yǎng)缺陷型(在基本培養(yǎng)基上不能正常生在基本培養(yǎng)基上不能正常生長，只能在相應(yīng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長長，只能在相應(yīng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長)。 其它突變類型其它突變類型的篩選、鑒定：的篩選、鑒定： 對于其它的突變類型對于其它的突變類型(如溫度敏

7、感型如溫度敏感型)，也可以通過，也可以通過培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)來篩選與鑒定。培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)來篩選與鑒定。 選擇培養(yǎng)法一次可鑒定、篩選一種突變型，但選擇培養(yǎng)法一次可鑒定、篩選一種突變型，但要檢測分離含有多種突變型的混和菌株，僅采要檢測分離含有多種突變型的混和菌株，僅采用選擇培養(yǎng)法要進行多次試驗才能夠達到目的、用選擇培養(yǎng)法要進行多次試驗才能夠達到目的、效率太低。效率太低。 為高效檢測、分離混和群體中不同突變型，黎為高效檢測、分離混和群體中不同突變型，黎德伯格夫婦設(shè)計了德伯格夫婦設(shè)計了影印培養(yǎng)法影印培養(yǎng)法。 該方法原理與選擇培養(yǎng)法一致，但是采用影該方法原理與選擇培養(yǎng)法一致，但是采用影印法將在印法將

8、在完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基上單菌落同時接種到不上單菌落同時接種到不同選擇培養(yǎng)基上同時對所有菌落進行選擇培同選擇培養(yǎng)基上同時對所有菌落進行選擇培養(yǎng)，鑒定效率大大提高。養(yǎng)，鑒定效率大大提高。 注意：注意： (1)最初的培養(yǎng)基必須是非選擇性的，最初的培養(yǎng)基必須是非選擇性的，即各種突變型都能夠在其上生長；即各種突變型都能夠在其上生長； (2)必須采用適當?shù)姆椒ㄈ缤坎蓟騽澗€必須采用適當?shù)姆椒ㄈ缤坎蓟騽澗€法，以使培養(yǎng)物菌落之間要分開。法，以使培養(yǎng)物菌落之間要分開。影印培養(yǎng)法：影印培養(yǎng)法：例如：例如： 營養(yǎng)缺陷型的篩選營養(yǎng)缺陷型的篩選: u.v : u.v 野生型細菌野生型細菌 完全培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基： 影印培

9、養(yǎng)影印培養(yǎng)基本培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基： 補充培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基 ： 氨基酸類氨基酸類 維生素類維生素類 系列氨基酸系列氨基酸補充培養(yǎng)基：賴氨酸補充培養(yǎng)基：賴氨酸 脯氨酸脯氨酸 精氨酸精氨酸. .補充知識補充知識 基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基：凡能滿足某一菌種野生型：凡能滿足某一菌種野生型和原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的組和原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的組合培養(yǎng)基。合培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入一些：在基本培養(yǎng)基中加入一些富含生長因子的物質(zhì)，以滿足該微生物富含生長因子的物質(zhì)，以滿足該微生物各種營養(yǎng)缺陷型要求。各種營養(yǎng)缺陷型要求。 補充培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中有針對性：在基本培養(yǎng)基

10、中有針對性地加上某一種或幾種其自身不能合成的地加上某一種或幾種其自身不能合成的成分，以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型生長的培成分，以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基。養(yǎng)基。 限量補充培養(yǎng)法： 把誘變處理后的細胞接種在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細胞就迅速長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則緩慢生長成小菌落。若需獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。 在基本培養(yǎng)基中加入抗生素，野生型菌株被殺死，營養(yǎng)缺陷型不能在基本培養(yǎng)基中生長而被保留下來。蛋白胨蛋白胨:是一種外觀呈淡黃色的粉劑，具是一種外觀呈淡黃色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。它作為微生物培養(yǎng)有肉香的特殊氣息。它作為

11、微生物培養(yǎng)基的主要原料，在抗生素，醫(yī)藥工業(yè)，基的主要原料，在抗生素，醫(yī)藥工業(yè)，發(fā)酵工業(yè)，生化制品及微生物學(xué)科研等發(fā)酵工業(yè)，生化制品及微生物學(xué)科研等領(lǐng)域中的用量均很大；不同的生物體需領(lǐng)域中的用量均很大；不同的生物體需要特定的氨基酸和多肽，因此存在各種要特定的氨基酸和多肽，因此存在各種蛋白胨，一般來說，用于蛋白胨生產(chǎn)的蛋白胨，一般來說，用于蛋白胨生產(chǎn)的蛋白包括動物蛋白（酪蛋白、肉類）和蛋白包括動物蛋白（酪蛋白、肉類）和植物蛋白（豆類）兩種。植物蛋白（豆類）兩種。第三節(jié)第三節(jié) 細菌的接合與染色體作圖細菌的接合與染色體作圖 一一 、大腸桿菌性別的發(fā)現(xiàn)、大腸桿菌性別的發(fā)現(xiàn)大腸桿菌大腸桿菌12中有兩個這樣

12、的菌株：中有兩個這樣的菌株： A菌株：菌株：met-bio-thr+leu+thi+ B菌株：菌株：met+bio+thr-leu-thi- A strs菌株菌株 B strr菌株菌株 A strr菌株菌株 B strs菌株菌株 基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 產(chǎn)生原養(yǎng)型產(chǎn)生原養(yǎng)型 產(chǎn)生原養(yǎng)型產(chǎn)生原養(yǎng)型 A strs菌株菌株 B strr菌株菌株 A strr菌株菌株 B strs菌株菌株 鏈霉素培養(yǎng)基鏈霉素培養(yǎng)基 鏈霉素培養(yǎng)基鏈霉素培養(yǎng)基 產(chǎn)生原養(yǎng)型產(chǎn)生原養(yǎng)型 不產(chǎn)生原養(yǎng)型不產(chǎn)生原養(yǎng)型 原因解釋：原因解釋：菌株菌株A相當于雄性，是遺傳物質(zhì)相當于雄性，是遺傳物質(zhì)的供體（的供體（do

13、nor) ，而菌株，而菌株B相當于雌性，是遺相當于雌性，是遺傳物質(zhì)的受體。所以在含有鏈霉素的培養(yǎng)基中，傳物質(zhì)的受體。所以在含有鏈霉素的培養(yǎng)基中， Astrs菌株菌株 Bstrr菌株這一雜交組合可以得到原菌株這一雜交組合可以得到原養(yǎng)型，原因是供體雖然對鏈霉素敏感，細胞不養(yǎng)型，原因是供體雖然對鏈霉素敏感，細胞不能分裂，但并不影響供體的基因轉(zhuǎn)移；受體對能分裂，但并不影響供體的基因轉(zhuǎn)移；受體對鏈霉素有抗性，所以不影響細胞分裂，也不影鏈霉素有抗性，所以不影響細胞分裂，也不影響接受外源遺傳物質(zhì)發(fā)生重組，從而出現(xiàn)原養(yǎng)響接受外源遺傳物質(zhì)發(fā)生重組，從而出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。而反交（型菌落。而反交（A strr菌株菌株

14、 B strs菌株）就菌株）就不能得到原養(yǎng)型，因為受體對鏈霉素敏感，雖不能得到原養(yǎng)型，因為受體對鏈霉素敏感，雖然供體轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)，但受體細胞不能分裂，然供體轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)，但受體細胞不能分裂，所以不能重組成原養(yǎng)型菌落。所以不能重組成原養(yǎng)型菌落。 二、二、F因子與高頻重組因子與高頻重組 大腸桿菌中供體與受體的區(qū)別：是否具有一種大腸桿菌中供體與受體的區(qū)別：是否具有一種微小的質(zhì)粒微小的質(zhì)粒-F因子（因子（F factor或或 F element)，又稱性因子或致育因子。供體含有又稱性因子或致育因子。供體含有F因子，此因子，此菌株就稱為菌株就稱為F+，受體不含，受體不含F(xiàn)因子，此菌株就稱因子，此菌株就稱

15、為為F- 。原點致育基因配對區(qū)域使它具有感染性，其中一些編碼F纖毛（性馓毛）轉(zhuǎn)移起始點與受體染色體上同源序列配對，交換整合到受體菌中，成為受體染色體的一部分F因子及其在雜交中的行為因子及其在雜交中的行為 F+品系稱為低頻重組（品系稱為低頻重組（low frequency recombination，Lfr)：F因子轉(zhuǎn)移頻率很高，因子轉(zhuǎn)移頻率很高，但兩者染色體之間重組頻率很低，大約是每百但兩者染色體之間重組頻率很低，大約是每百萬個細胞發(fā)生一次重組。萬個細胞發(fā)生一次重組。 Hfr品系稱為高頻重組（品系稱為高頻重組（ high frequency recombination，Hfr）：因為）：因為H

16、fr細胞與細胞與F-細胞細胞接合后可以將供體染色體的一部分或全部傳遞接合后可以將供體染色體的一部分或全部傳遞給受體給受體F-，當供體和受體的等位基因帶有不同，當供體和受體的等位基因帶有不同標記時，在她們之間就可以發(fā)生重組，重組頻標記時，在她們之間就可以發(fā)生重組，重組頻率可達到率可達到0.01以上。以上。 三、細菌重組的特點三、細菌重組的特點 Hfr細胞和細胞和F- 細胞之間的接合管常會自發(fā)斷裂，進入的細胞之間的接合管常會自發(fā)斷裂，進入的Hfr染色體也隨之斷裂，一般說很少有整條染色體也隨之斷裂，一般說很少有整條Hfr染色體染色體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入F- 細胞的，因此：細胞的，因此：（一）（一） F- 細胞得

17、到的只是細胞得到的只是F因子的一部分，因子的一部分，F(xiàn)因子其余部因子其余部分依賴于整條分依賴于整條Hfr染色體的轉(zhuǎn)移，這樣染色體的轉(zhuǎn)移，這樣Hfr F- 雜交中雜交中選出的大多數(shù)重組子仍為選出的大多數(shù)重組子仍為F-。（二）（二） F- 受體細胞只接受部分的供體染色體，這樣的細受體細胞只接受部分的供體染色體，這樣的細胞就稱為部分二倍體（胞就稱為部分二倍體（partial diploid)或稱為半合子或稱為半合子(merozygote)。供體與受體的重組是內(nèi)基因子（。供體與受體的重組是內(nèi)基因子（ F- 染染色體色體DNA）與外基因子（）與外基因子（ Hfr部分染色體部分染色體DNA）的同）的同源部

18、分配對、交換，產(chǎn)生重組子。其中單交換產(chǎn)生的源部分配對、交換，產(chǎn)生重組子。其中單交換產(chǎn)生的是不平衡的部分二倍體線性染色體，而雙交換產(chǎn)生的是不平衡的部分二倍體線性染色體，而雙交換產(chǎn)生的是有活性的環(huán)狀重組子和片段。是有活性的環(huán)狀重組子和片段。細菌重組的特點細菌重組的特點（a）：接合后形成的部分二倍體，包括外基因子和內(nèi)基因子；）：接合后形成的部分二倍體，包括外基因子和內(nèi)基因子；（b）：內(nèi)基因子和外基因子之間單交換形成一個線性染色體；）：內(nèi)基因子和外基因子之間單交換形成一個線性染色體；（c）：雙交換形成一個完整的重組染色體和一個游離片段，這一）：雙交換形成一個完整的重組染色體和一個游離片段，這一片段隨以

19、后的分裂而丟失。片段隨以后的分裂而丟失。- 可見：可見：原核類中的交換并不像真核生物那樣原核類中的交換并不像真核生物那樣在兩整套基因組間進行，而是在一完整的基因在兩整套基因組間進行，而是在一完整的基因組（組（ F-內(nèi)基因子）與一不完整的基因組（內(nèi)基因子）與一不完整的基因組（ Hfr外基因子）間進行，即在部分二倍體間進行。外基因子）間進行，即在部分二倍體間進行。因此，在細菌的重組中有下列兩個特點：因此，在細菌的重組中有下列兩個特點：1、只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡的重組子、只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡的重組子2、不出現(xiàn)相反的重組子，所以在選擇培養(yǎng)基上、不出現(xiàn)相反的重組子，所以在選擇培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一種

20、重組子。只出現(xiàn)一種重組子。第四節(jié)第四節(jié) 中斷雜交與重組作圖中斷雜交與重組作圖 一、中斷雜交實驗原理一、中斷雜交實驗原理 基因從基因從Hfr 細胞按次序轉(zhuǎn)入細胞按次序轉(zhuǎn)入F-細胞，可根據(jù)基因進入細胞，可根據(jù)基因進入F-細胞的時間和次序制作基因圖譜。細胞的時間和次序制作基因圖譜。 Wollman和和Jacob于于1954年在大腸桿菌中曾進行了以下雜交實驗：年在大腸桿菌中曾進行了以下雜交實驗： Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把接合中的細菌在不同時間取樣，并把樣品把接合中的細菌在不同時間取樣，并把樣品猛烈攪拌以中

21、斷接合中的細菌，然后分析受體猛烈攪拌以中斷接合中的細菌，然后分析受體菌的基因型，這是在大腸桿菌等細菌中用來測菌的基因型，這是在大腸桿菌等細菌中用來測定基因位置的一種方法。定基因位置的一種方法。 中斷雜交試驗中斷雜交試驗（interrupted mating experiment）研究細菌接合過程中基因轉(zhuǎn)移狀況的一種遺傳學(xué)實驗方法。將接合中的細菌按不同時間取樣，并將樣品放入攪拌器內(nèi)猛烈攪拌，以打斷細菌的接合管，終止接合。由于接合時間不同，不同長度的細菌染色體（基因組）從供體轉(zhuǎn)移到受體，分析受體的基因型即可知細菌染色體的基因轉(zhuǎn)移順序，以確定細菌染色體上基因位置（包括基因順序和距離）。 二、中斷雜交

22、作圖中斷雜交實驗結(jié)果基因 轉(zhuǎn)入時間（ min） 頻率 thr+ 8 100 leu+ 8.5 100 azs 9 90 Tis 11 70 lac+ 18 40 gal+ 25 25不同基因在F-中出現(xiàn)的時間和達到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移頻率不同，表明它們同轉(zhuǎn)移起始點之間，以及它們之間的順序和距離不同。 0 5 10 15 20 25 min O az Ti lac gal E.coli中斷雜交作圖 基因距離以分鐘為單位 同一個Hfr菌株的轉(zhuǎn)移的起始點在以及轉(zhuǎn)移順序在不同實驗中都是相同的。但一個F+品系可產(chǎn)生許多Hfr品系，這是因為F因子在細菌染色體上有許多插入位點而且其插入取向不同而形成的。用這些不同Hf

23、r菌株進行中斷雜交實驗，則它們的轉(zhuǎn)移起點、基因轉(zhuǎn)移順序以及轉(zhuǎn)移方向都不相同。 三、重組作圖 如果2個基因間的轉(zhuǎn)移時間2min則用中斷雜交作圖不可靠，應(yīng)采用傳統(tǒng)的重組作圖法。 雜交 Hfr lac+ade + F-lac- ade- lac -乳糖不發(fā)酵 ade-腺嘌呤缺陷型 用完全培養(yǎng)基但不加腺嘌呤，可選出F-ade+的菌落 由于lac+ ade +近，兩者相繼進入時間相距很短，難以準確界定，所以只能根據(jù)產(chǎn)物確定。（已知兩基因緊密連鎖，且lac+ 先進入F- 受體） 如果選出ade+同時也選出lac+ ，說明lac- ade 間沒有發(fā)生過交換；如果是lac-ade+說明發(fā)生交換。 Hfr la

24、c+ ade+ F- lac- ade- F- lac- ade- Hfr lac+ ade+ F- lac+ ade+ F- lac- ade- Hfr lac+ ade+ F- lac- ade+ F- lac- ade- A：外基因子與內(nèi)基因子之間未發(fā)生重組；：外基因子與內(nèi)基因子之間未發(fā)生重組；B： lac- ade 兩基因之兩基因之外發(fā)生雙交換；外發(fā)生雙交換；C： lac- ade 兩基因間發(fā)生交換產(chǎn)生重組子。兩基因間發(fā)生交換產(chǎn)生重組子。重組率重組率=lac-ade+/(lac+ ade+)+(lac- ade+)100% =22% 兩個位點之間的時間單位約為兩個位點之間的時間單位約為

25、1min，可見，可見1個時間單位（分鐘）個時間單位（分鐘）大約相當于大約相當于20%的重組值的重組值 。 用重組率與中斷雜交法測的基因距離大致符合的，根據(jù)接合的用重組率與中斷雜交法測的基因距離大致符合的，根據(jù)接合的實驗，用中斷雜交法基因重組等方法已繪制出大腸桿菌實驗，用中斷雜交法基因重組等方法已繪制出大腸桿菌K12環(huán)狀環(huán)狀遺傳圖（圖遺傳圖（圖7-10C）。）。 A:B:C:第五節(jié)第五節(jié) F因子與性導(dǎo)因子與性導(dǎo)一一 F因子與因子與F菌株菌株 Hfr F+因子的時候，因子的時候，F(xiàn)因子偶爾可能獲得細因子偶爾可能獲得細菌染色體的一部分菌染色體的一部分,而保留著對遺傳地點的而保留著對遺傳地點的“記記憶

26、憶”。這種帶有部分細菌染色體的。這種帶有部分細菌染色體的F因子稱因子稱F因子。當因子。當F因子再整合到細菌染色體時，它就因子再整合到細菌染色體時，它就只能在原來的地點配對、交換而插入其中，而只能在原來的地點配對、交換而插入其中，而不能象不能象F因子那樣可以在任何位點整合。因子那樣可以在任何位點整合。 F菌株菌株：指帶有指帶有F因子的細菌。因子的細菌。 二、性導(dǎo) F因子轉(zhuǎn)入受體細胞后，由于引入體細胞的部分基因，從而形成部分二倍體，這種利用F因子將供體細胞的基因?qū)胧荏w形成部分二倍體的過程叫性導(dǎo)（sexduction或F-duction ）第六節(jié)第六節(jié) 轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)作圖轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)作圖 一、轉(zhuǎn)化一、轉(zhuǎn)

27、化(transformation) (一一)、細菌轉(zhuǎn)化實驗、細菌轉(zhuǎn)化實驗 (二二)、轉(zhuǎn)化過程、轉(zhuǎn)化過程 *(三三)、共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制、共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制(一一)、細菌轉(zhuǎn)化實驗、細菌轉(zhuǎn)化實驗1. 基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識 野生型肺炎雙球菌野生型肺炎雙球菌(Strep-tococcus pneumoniae)菌落菌落為為光滑型光滑型，一種突變型，一種突變型為為粗糙型粗糙型，兩者根本差，兩者根本差異在于莢膜形成；異在于莢膜形成； 莢膜的主要成分是多糖，莢膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；具特殊的抗原性； 不同抗原型是遺傳的、不同抗原型是遺傳的、穩(wěn)定的，一般情況下不穩(wěn)定的，一般情況下不發(fā)生互變。發(fā)

28、生互變。莢膜莢膜 菌落菌落 毒性毒性類型類型光滑型光滑型S 發(fā)達發(fā)達 光滑光滑有有I, II, III粗糙型粗糙型R無無粗糙粗糙無無I, II2. Griffith轉(zhuǎn)化研究轉(zhuǎn)化研究(1928) Griffith對其試驗結(jié)論及發(fā)展對其試驗結(jié)論及發(fā)展 根據(jù)上述研究結(jié)果根據(jù)上述研究結(jié)果Griffith認為：認為： (有毒有毒)死細菌中的某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到死細菌中的某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到(無毒無毒)活活細菌中，并使之具有毒性，導(dǎo)致小家鼠死亡。細菌中，并使之具有毒性，導(dǎo)致小家鼠死亡。 他將這種細菌遺傳類型的轉(zhuǎn)變稱為轉(zhuǎn)化，并他將這種細菌遺傳類型的轉(zhuǎn)變稱為轉(zhuǎn)化，并將引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)稱為將引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子

29、(tranforming principle)。 但是當時的化學(xué)與生化分析技術(shù)還無法鑒定但是當時的化學(xué)與生化分析技術(shù)還無法鑒定殺死細菌中的成分，因而不知轉(zhuǎn)化因子為何殺死細菌中的成分，因而不知轉(zhuǎn)化因子為何物。物。 以后一些研究者重復(fù)上述試驗，并且加以后一些研究者重復(fù)上述試驗，并且加入了入了體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)試驗，即：將加熱殺死的試驗，即：將加熱殺死的SIII細菌與無毒細菌與無毒RII細菌混合培養(yǎng)，然后細菌混合培養(yǎng)，然后注入小家鼠體內(nèi)，同樣導(dǎo)致家鼠死亡。注入小家鼠體內(nèi)，同樣導(dǎo)致家鼠死亡。表明：表明： 細菌在培養(yǎng)條件下也能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳類細菌在培養(yǎng)條件下也能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳類型間的定向轉(zhuǎn)化。型間的定向轉(zhuǎn)化。 3

30、. 阿維利阿維利(Avery)等的轉(zhuǎn)化實驗等的轉(zhuǎn)化實驗(1944) 實驗結(jié)論實驗結(jié)論 上述實驗結(jié)果表明：來源于加熱殺死的上述實驗結(jié)果表明：來源于加熱殺死的SIII細細菌，并使菌，并使 RII細菌轉(zhuǎn)化成為細菌轉(zhuǎn)化成為SIII型細菌的轉(zhuǎn)化型細菌的轉(zhuǎn)化因子是因子是DNA。 正是在這一認識的基礎(chǔ)上，將正是在這一認識的基礎(chǔ)上，將轉(zhuǎn)化定義為轉(zhuǎn)化定義為：某：某一基因型的細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基一基因型的細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型的因型的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。變化的現(xiàn)象。 Avery等人的實驗實際上也表明：決定細等人的實驗實際上也表明：決定

31、細菌遺傳類型的物質(zhì)是菌遺傳類型的物質(zhì)是DNA，即證明了，即證明了DNA就是遺傳物質(zhì)。就是遺傳物質(zhì)。 但由于他們采用的實驗方法當時不被但由于他們采用的實驗方法當時不被人們廣泛接受，而且得出的結(jié)論與當人們廣泛接受，而且得出的結(jié)論與當時人們的傳統(tǒng)觀念時人們的傳統(tǒng)觀念(認為蛋白質(zhì)是遺傳認為蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)物質(zhì))不符合，而長期沒有得到人們的不符合，而長期沒有得到人們的承認。承認。 (二二)、轉(zhuǎn)化過程、轉(zhuǎn)化過程 轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在細菌中是一種普遍現(xiàn)象。不轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在細菌中是一種普遍現(xiàn)象。不同細菌轉(zhuǎn)化過程有一定差異，但是它們同細菌轉(zhuǎn)化過程有一定差異，但是它們都存在幾個共同特征，即：都存在幾個共同特征，即： 1. 感受

32、態(tài)與感受態(tài)因子：感受態(tài)與感受態(tài)因子： 感受態(tài)感受態(tài)指細菌能夠從周圍環(huán)境中吸收指細菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。分子進行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。 感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)(感受態(tài)因子感受態(tài)因子)影響，感受態(tài)因子可以在細菌間進行影響，感受態(tài)因子可以在細菌間進行轉(zhuǎn)移，從感受態(tài)細菌中傳遞到非感受轉(zhuǎn)移，從感受態(tài)細菌中傳遞到非感受態(tài)細菌中，可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。態(tài)細菌中，可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。 一般認為感受態(tài)出現(xiàn)在細菌對數(shù)生長一般認為感受態(tài)出現(xiàn)在細菌對數(shù)生長后期，并且某些處理過程可以誘導(dǎo)或后期，并且某些處理過程可以誘導(dǎo)或加強感受態(tài)，以大腸桿菌為例，用加強感受態(tài)，以大腸桿菌

33、為例，用Ca2+(如如CaCl2)處理對數(shù)生長后期的大處理對數(shù)生長后期的大腸桿菌可以增強其感受能力。腸桿菌可以增強其感受能力。 2.供體供體(donor)DNA與受體與受體(receptor)細胞結(jié)合細胞結(jié)合(binding)： 結(jié)合發(fā)生在受體細胞特定部位結(jié)合發(fā)生在受體細胞特定部位(結(jié)合點結(jié)合點)； 對供體對供體DNA片段有一定要求片段有一定要求(20000個核苷酸個核苷酸對）；對）； 結(jié)合過程是一個可逆過程。結(jié)合過程是一個可逆過程。 3.DNA攝?。簲z?。?當細菌結(jié)合點飽和之后，細菌開始攝取外源當細菌結(jié)合點飽和之后，細菌開始攝取外源DNA； 往往只有一條往往只有一條DNA單鏈進入細胞單鏈進入

34、細胞(單鏈攝入單鏈攝入)，另一條鏈在膜上降解。另一條鏈在膜上降解。 4.聯(lián)會聯(lián)會(synapsis)與外源與外源DNA片段整合片段整合(integration)： 整合就是指單鏈的轉(zhuǎn)化整合就是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體與受體DNA對應(yīng)位點的置換，從而穩(wěn)定地摻對應(yīng)位點的置換，從而穩(wěn)定地摻入到受體入到受體DNA中的過程。中的過程。 實際上就是一個遺傳重組的過程。因?qū)嶋H上就是一個遺傳重組的過程。因而研究整合的分子機制事實上也為遺而研究整合的分子機制事實上也為遺傳重組的分子機制作出了貢獻。傳重組的分子機制作出了貢獻。*(三三)、共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制、共同轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制 利用利用共同轉(zhuǎn)化共同轉(zhuǎn)化繪制

35、細菌連鎖遺傳圖譜的繪制細菌連鎖遺傳圖譜的基本原理：基本原理： 相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的概率與兩者的相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的概率與兩者的距離間成正向關(guān)系，基因間距離越近，距離間成正向關(guān)系，基因間距離越近，發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越低。發(fā)生共同轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越低。 因此可以通過測定兩基因共同轉(zhuǎn)化的頻因此可以通過測定兩基因共同轉(zhuǎn)化的頻率來指示基因間的相對距離。率來指示基因間的相對距離。(P169)轉(zhuǎn)化基因間重組值的計算轉(zhuǎn)化基因間重組值的計算 轉(zhuǎn)化子數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)( (重組體數(shù)重組體數(shù)) ) 親組合數(shù)親組合數(shù)+ +轉(zhuǎn)化子數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)例例: :供體供體 trptrp2 2+ his+ his2 2+ t

36、yr+ tyr1 1+ + trptrp2 2- his- his2 2- tyr- tyr1 1- - P170 P170 表表7-47-4的重組值的重組值 trptrp2 2hishis2 2的重組值的重組值=34%=34% trp trp2 2tyrtyr1 1的重組值的重組值=40%=40% his his2 2tyrtyr1 1的重組值的重組值=13%=13% 根據(jù)重組值作圖：根據(jù)重組值作圖： trptrp2 2 3434 his his2 2 13 tyr 13 tyr1 1重組值重組值= = = = (+ -)+(- +)(+ -)+(- +)(+ +)+(+ -)+(- +)(

37、+ +)+(+ -)+(- +) 二、轉(zhuǎn)導(dǎo)二、轉(zhuǎn)導(dǎo) 1. 定義：以噬菌體為媒介所進行的細菌遺傳物定義：以噬菌體為媒介所進行的細菌遺傳物質(zhì)重組的過程，稱質(zhì)重組的過程，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2. 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) Lederbery及其研究生及其研究生Zinder（1951）首先）首先在鼠傷寒沙門氏菌（在鼠傷寒沙門氏菌（Salmenella typhimurium）中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。 發(fā)現(xiàn)過程發(fā)現(xiàn)過程 他們用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸營養(yǎng)缺陷他們用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌和甲硫氨酸、組氨酸營養(yǎng)型的鼠傷寒沙門氏菌和甲硫氨酸、組氨酸營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌共同培養(yǎng)，相當讓兩缺

38、陷型的鼠傷寒沙門氏菌共同培養(yǎng)，相當讓兩種不同缺陷型的菌雜交。雜交過程和結(jié)果如下：種不同缺陷型的菌雜交。雜交過程和結(jié)果如下： LT22 phe- trp- tyr- LT2 met- his- （苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸） （甲硫氨酸、組氨酸）（甲硫氨酸、組氨酸） 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型 原養(yǎng)型的菌落（即出現(xiàn)個別正原養(yǎng)型的菌落（即出現(xiàn)個別正常型的細菌）常型的細菌） 那么這些原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)是由接合引起的？那么這些原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)是由接合引起的？ 還是由轉(zhuǎn)化引起的？還是由轉(zhuǎn)化引起的？ 他們先進行他們先進行U形管實驗，形管實驗，結(jié)果在結(jié)果在LT22一臂

39、獲得原養(yǎng)型的菌株，由此推測一臂獲得原養(yǎng)型的菌株，由此推測可能有一種可通過濾膜的過濾性因子（可能有一種可通過濾膜的過濾性因子（FA）在）在起作用。進一步利用起作用。進一步利用DNA酶處理，結(jié)果酶處理，結(jié)果FA不不受受DNA酶影響，從而消除了轉(zhuǎn)化作用的可能性。酶影響，從而消除了轉(zhuǎn)化作用的可能性。最后認為最后認為FA是一種噬菌體是一種噬菌體P22，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)。，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)。 3. 轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制 轉(zhuǎn)導(dǎo)是在噬菌體包裝中因為錯誤將細菌染色轉(zhuǎn)導(dǎo)是在噬菌體包裝中因為錯誤將細菌染色體片段包裝進去成為內(nèi)含細菌染色體片段體片段包裝進去成為內(nèi)含細菌染色體片段“假假噬菌體噬菌體”而發(fā)生的。具體過程如下：而發(fā)生的

40、。具體過程如下： （1）噬菌體侵染細菌。）噬菌體侵染細菌。 （2）噬菌體）噬菌體DNA使細菌染色體形成片段，合使細菌染色體形成片段，合成噬菌體成噬菌體DNA和外殼。和外殼。 （3）新噬菌體包裝，偶爾將細菌染色體片段）新噬菌體包裝，偶爾將細菌染色體片段也包裝進去成為內(nèi)含細菌染色體片段也包裝進去成為內(nèi)含細菌染色體片段“假噬菌假噬菌體體”?！凹偈删w假噬菌體”和真噬菌體一起釋放出來。和真噬菌體一起釋放出來。 （4）“假噬菌體假噬菌體”和真噬菌體一樣可再侵和真噬菌體一樣可再侵染細菌，其中染細菌，其中“假噬菌體假噬菌體”侵染時，就侵染時，就將外來的細菌基因注入，經(jīng)過基因重組將外來的細菌基因注入，經(jīng)過基因

41、重組改變遺傳性狀，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。改變遺傳性狀，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。 目前根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制，已廣泛應(yīng)用在目前根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制，已廣泛應(yīng)用在體外包裝體外包裝“假噬菌體假噬菌體”，即將外源基因，即將外源基因?qū)雽?dǎo)入“假噬菌體假噬菌體”中，再侵染細菌，進中，再侵染細菌，進行基因表達的研究。行基因表達的研究。 （一）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（一）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：指普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：指P1、 P22等可以轉(zhuǎn)導(dǎo)沙門等可以轉(zhuǎn)導(dǎo)沙門氏菌染色體組的任何不同的部分。氏菌染色體組的任何不同的部分。 如果兩個基因始終是一起轉(zhuǎn)導(dǎo)或同時轉(zhuǎn)如果兩個基因始終是一起轉(zhuǎn)導(dǎo)或同時轉(zhuǎn)導(dǎo)（共轉(zhuǎn)導(dǎo)或并發(fā)轉(zhuǎn)導(dǎo)）頻率較高，那導(dǎo)（共轉(zhuǎn)導(dǎo)或并發(fā)轉(zhuǎn)導(dǎo)）頻率較高，那么

42、證明兩基因連鎖，而且頻率越高，則么證明兩基因連鎖，而且頻率越高，則兩基因距離越近。兩基因距離越近。 如：如：a基因和基因和b基因共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率高，基因共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率高， a和和c共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率也高，共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率也高， b和和c共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率低，共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率低，則則3個基因順序為個基因順序為 b a c 若同時觀察若同時觀察3因子轉(zhuǎn)導(dǎo)分析，則只做一次實驗因子轉(zhuǎn)導(dǎo)分析，則只做一次實驗就可推出其次序。就可推出其次序。 舉例：利用普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)測知舉例：利用普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)測知leu，thr，azi三個三個基因順序?；蝽樞?。 方法：方法： （1）用噬菌體）用噬菌體P1侵染帶侵染帶leu+，thr+和和azi+的的大腸桿菌。大腸桿菌。 （2）用從該大腸