DNA甲基化與臨床應(yīng)用

1、DNA甲基化與臨床應(yīng)用甲基化與臨床應(yīng)用目錄目錄甲基化的作用甲基化的作用2 2臨床相關(guān)應(yīng)用臨床相關(guān)應(yīng)用4 4引言及概念引言及概念3 3 1 1甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)3 3 3 3為什么為什么是是的？的？ 同卵雙生的孿生子具有完全相同的基同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們長(zhǎng)大成人后在性格因組。但他們長(zhǎng)大成人后在性格、健康方健康方面往往存在很大差異。面往往存在很大差異。先從表觀遺傳學(xué)談起相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型 ? ? 基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)概念： 基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳可遺傳的表型。

2、表觀遺傳學(xué)的現(xiàn)象（基因表達(dá)的調(diào)控方式）： DNA甲基化甲基化- 組蛋白修飾 MicroRNA Genomic imprinting不同層次表達(dá)調(diào)控不同層次表達(dá)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH DNA甲基化甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶胞嘧啶5碳位以共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基甲基基團(tuán)。DNA甲基化的概念DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶： DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B。nDNMT

3、1- 持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；與甲基化相關(guān)，缺乏引起基因組低甲基化，染色體缺失、重排、突變畸形。nDNMT3A、DNMT3B- 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶；與去甲基化相關(guān)，在胚胎干細(xì)胞和早期胚胎中高度表達(dá)，缺乏引起胚胎死亡，在腫瘤組織中廣泛高表達(dá)。 通常啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過(guò)均值5倍以上，成為鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)。 結(jié)構(gòu)基因組中結(jié)構(gòu)基因組中70% 90% 的獨(dú)立的獨(dú)立CpG 都被甲基化都被甲基化, 未甲未甲基化的基化的CpG 成簇地聚集形成成簇地聚集形成CpG 島島 約有約有60以上基因的啟動(dòng)子含有以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。島。 是結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。是

4、結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。CpG島（島（CpG island）預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/目錄目錄甲基化的作用甲基化的作用2 2臨床相關(guān)應(yīng)用臨床相關(guān)應(yīng)用4 4引言及概念引言及概念3 3 1 1甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)3 3 3 3DNA甲基化的生物學(xué)作用甲基化的生物學(xué)作用u在發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)錄抑制 特征性表型基因的表達(dá)（膚色、毛發(fā)） X染色體的失活（X-inactivation ）

5、 基因印記 堿基突變 腫瘤代謝 DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，在體細(xì)胞增殖過(guò)程中通過(guò)依賴(lài)于DNA復(fù)制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1穩(wěn)定地傳遞給子細(xì)胞。但在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期，基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生劇烈的改變，改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段，甲基化模式在配子形成時(shí)已經(jīng)建立。DNA甲基化與胚胎發(fā)育甲基化與胚胎發(fā)育DNA甲基化在動(dòng)物胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重編程甲基化在動(dòng)物胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重編程CPG island的功能：通過(guò)甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達(dá)的功能：通過(guò)甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達(dá) 基因表達(dá)的調(diào)控開(kāi)關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)

6、錄抑制轉(zhuǎn)錄抑制影響影響基因表達(dá)基因表達(dá) 直接抑制基因表達(dá)或甲基化的 CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族 識(shí)別，而后者可通過(guò)吸引補(bǔ)充組蛋白去乙酞化酶和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶等組蛋白修飾蛋白質(zhì)來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的活性 ，以間接方式影響基因表達(dá)。 IAP: intracisternal A particle 去甲基化：灰鼠基因（agouti）僅微量表達(dá) 甲基化：基因超量表達(dá)特征性表型基因的表達(dá)特征性表型基因的表達(dá)X染色體的失活染色體的失活X染色體的失活（X-inactivation ）：生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，雌性哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中的兩條X染色體其中一條失去活性的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)失活的染色體上DNA序列都呈高度甲基化

7、，導(dǎo)致絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。 避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生雙倍 基因產(chǎn)物，保持和雄性動(dòng)物X染色體 數(shù)量及功能上的一致性?；蚪M印記？組織或細(xì)胞中，基因的表達(dá)具有親本選擇性，即只有一個(gè)親本的等位基因表達(dá)，而另一親本的等位基因不表達(dá)或很少表達(dá)的現(xiàn)象，相應(yīng)的基因則稱(chēng)為印記基因。父系不表達(dá)稱(chēng)父系印記母系不表達(dá)稱(chēng)母系印記基因印記基因印記差異甲基化區(qū)域差異甲基化區(qū)域 差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)，是指染色體上甲基化狀態(tài)具有親本特異性的區(qū)域，即來(lái)源于不同親本的DNA序列甲基化狀態(tài)不同的區(qū)域 差異甲基化主要發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)，少數(shù)在外顯子

8、，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的印記基因大多數(shù)具有DMR或受DMR調(diào)控。堿基堿基C T突變突變堿基突變堿基突變 甲基化 突變 腫瘤細(xì)胞發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化，主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的提高、基因組整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，如染色質(zhì)構(gòu)象異常、轉(zhuǎn)座子激活、原癌基因激活表達(dá)以及抑癌基因被抑制表達(dá)等。DNA甲基化與腫瘤甲基化與腫瘤目錄甲基化的作用甲基化的作用2 2臨床相關(guān)應(yīng)用臨床相關(guān)應(yīng)用4 4引言及概念引言及概念3 3 1 1甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)3 3 3 3A基因組甲基化水平基因組甲基化水平(Methylation Content)的分

9、析的分析1.高效液相色譜高效液相色譜2.高效毛細(xì)管電泳法高效毛細(xì)管電泳法B候選基因候選基因(Candidate Gene)甲基化分析甲基化分析 1.甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶-PCR/Southern法法2.重亞硫酸鹽測(cè)序法重亞硫酸鹽測(cè)序法3.甲基化特異性的甲基化特異性的PCR4.甲基化熒光法甲基化熒光法(MethyLight)5.焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序6. 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性?xún)?nèi)切酶法結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性?xún)?nèi)切酶法甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)C. 基因組范圍的基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分析甲基化模式與甲基化譜分析 1.限制性標(biāo)記基因組掃描限制性標(biāo)記基

10、因組掃描 2.甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增 3.甲基化甲基化CpG島擴(kuò)增島擴(kuò)增 4.差異甲基化雜交差異甲基化雜交 5.由連接子介導(dǎo)由連接子介導(dǎo)PCR出的出的HpaII小片斷富集分析小片斷富集分析 6.甲基化甲基化DNA免疫沉淀法免疫沉淀法 高效液相色譜法高效液相色譜法直接測(cè)序法直接測(cè)序法焦磷酸測(cè)序法焦磷酸測(cè)序法 通過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲入的比例對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化圖譜全基因組甲基化測(cè)序（全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）芯片平臺(tái)芯片平臺(tái) Illumina 850K芯片可檢測(cè)人全基因組約853,307個(gè)

11、CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。850K芯片不但保持了對(duì)CpG島，基因啟動(dòng)子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強(qiáng)了增強(qiáng)子區(qū)以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究，是目前最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。 Illumina 850K芯片技術(shù)流程目錄目錄甲基化的作用甲基化的作用2 2臨床相關(guān)應(yīng)用臨床相關(guān)應(yīng)用4 4引言及概念引言及概念3 3 1 1甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù)3 3 3 3正常生物正常生物DNA甲基化甲基化DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期，隨著組織細(xì)胞分化發(fā)育，基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性的重新甲基化以及組織特異基因選擇性的去甲基化的過(guò)程。

12、最后，這種DNA甲基化模式就相對(duì)穩(wěn)定下來(lái)。腫瘤組織的腫瘤組織的DNADNA甲基化甲基化 腫瘤中普遍存在腫瘤中普遍存在DNADNA甲基化狀態(tài)的改變，其特點(diǎn)是總體的甲基化狀態(tài)的改變，其特點(diǎn)是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。 腫瘤細(xì)胞的特征：腫瘤細(xì)胞的特征：n癌基因癌基因 低甲基化低甲基化 被激活被激活n抑癌基因抑癌基因 高甲基化高甲基化 被沉默被沉默應(yīng)用前景應(yīng)用前景1-1-腫瘤的早期腫瘤的早期診斷診斷抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進(jìn)行的，導(dǎo)致惡性腫瘤表型的表達(dá)而且一直進(jìn)行的，導(dǎo)致惡性腫瘤表型

13、的表達(dá)l優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：DNADNA甲基化檢測(cè)具有早期、無(wú)創(chuàng)、快捷、甲基化檢測(cè)具有早期、無(wú)創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)。（血液、粘膜上皮標(biāo)本）靈敏度高等特點(diǎn)。（血液、粘膜上皮標(biāo)本）l缺點(diǎn)：特異性不足缺點(diǎn)：特異性不足表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記開(kāi)發(fā)表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記開(kāi)發(fā) 2017年3月，張鹍教授團(tuán)隊(duì)在Nature Genetics（NG）雜志發(fā)布了令人振奮的研究成果，利用更靈敏的算法配合組織甲基化模式開(kāi)發(fā)的無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)，可以檢測(cè)并定位腫瘤。通過(guò)比較腫瘤和正常細(xì)胞的DNA甲基化數(shù)據(jù)找到腫瘤特異的甲基化Marker。 燃石醫(yī)學(xué)自主研發(fā)了無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID)，運(yùn)用多層級(jí)甲基化探針設(shè)計(jì)策略，可實(shí)現(xiàn)在檢測(cè)成

14、本可控的情況下同時(shí)檢測(cè)超過(guò)超過(guò)10萬(wàn)個(gè)萬(wàn)個(gè)臨床診斷相關(guān)的甲基化臨床診斷相關(guān)的甲基化CpG位點(diǎn)位點(diǎn)，并通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立分類(lèi)模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本自動(dòng)分型。 cfDNA無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID) 用于用于肺部占位病變（含肺癌）的早篩可實(shí)現(xiàn)肺部占位病變（含肺癌）的早篩可實(shí)現(xiàn)99.6%的敏感的敏感性和性和100%的特異性，用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實(shí)的特異性，用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實(shí)84.8%的敏感性和的敏感性和87.5%的特異性。的特異性。cfDNA甲基化液體活檢技術(shù)甲基化液體活檢技術(shù)應(yīng)用前景應(yīng)用前景2-腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)存在R

15、ECK基因甲基化的患者復(fù)發(fā)率明顯增高甲基化影響生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常甲基化時(shí)，患者存活時(shí)間明顯縮短LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in oral squamous cell carcinomas J . Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058.ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cell - Free Serum DNA Indicates Worse Out

16、come in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.應(yīng)用應(yīng)用前景前景3-腫瘤的去甲基化治療腫瘤的去甲基化治療 DNA甲基化程度依賴(lài)于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3啟動(dòng)CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平（去甲基化） 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望 優(yōu)點(diǎn)：新型抗腫瘤藥物優(yōu)點(diǎn)：新型抗腫瘤藥物 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：n 無(wú)基因特異性無(wú)基因特異性,不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而會(huì)引起整體的低甲基化會(huì)引起整體的低甲基化; n 藥物的活化作用可逆，療效依賴(lài)于藥物的持續(xù)存在藥物的活化作用可逆，療效依賴(lài)于藥物的持續(xù)存在;n 大劑量應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒副作用大劑量應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒副作用 是否會(huì)誘發(fā)第二腫瘤？是否會(huì)誘發(fā)第