加壓篩選試劑

1、MTX加壓方法簡介誕生于70年代末的基因工程藥物因其具有其他藥物無法比擬的優(yōu)點，己迅速成為制藥工業(yè)中一個引人注目的領(lǐng)域。1995年美國基因工程藥物銷售額約為48億美元，1997年超過60億美元，年增長率達20%以上。各國政府將其視為新的經(jīng)濟增長熱點而給予了大力支持?；蚬こ趟幬镅邪l(fā)的主要環(huán)節(jié)包括：基因克隆和工程菌構(gòu)造；重組細(xì)胞培養(yǎng)；目的產(chǎn)物分離純化等。針對以上主要環(huán)節(jié)，研究人員正致力于高效表達、培養(yǎng)工藝及下游分離純化等方面的研究。目前已有多種表達系統(tǒng)應(yīng)用于表達具有醫(yī)療價值的蛋白質(zhì)，如大腸桿菌、酵母、昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞等表達系統(tǒng)。大多數(shù)藥用蛋白都是糖蛋白，中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）是

2、目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達，部分藥物已投放市場，例如EPO、G-CSF、組織型纖溶酶原激活劑t-PA、CD受體、單克隆抗體、乙型肝炎表面抗原、白介素、干擾素等。 影響重組蛋白在CHO細(xì)胞中表達的因素很多，層次也很廣泛，涉及CHO細(xì)胞表達體系、表達載體系統(tǒng)、外源基因、表達細(xì)胞株的加壓擴增與篩選、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)等。轉(zhuǎn)錄是真核基因表達調(diào)節(jié)的基本控制點，研究表明：所有提高轉(zhuǎn)錄水平的策略主要通過載體構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)染方法和選擇不同標(biāo)記來調(diào)控；CHO細(xì)胞表達體系和外源基因影響mRNA的翻譯；表達細(xì)胞株的加壓擴增，目的在于擴增外源基因的拷貝數(shù)，從而提高表達量；篩選

3、表達細(xì)胞株，可獲得穩(wěn)定的、高表達的單克隆細(xì)胞株；大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，血清、溶氧、二氧化碳、氨、乳酸的濃度以及剪切力影響細(xì)胞的生長、外源蛋白的表達和純化。深入了解和靈活運用各種影響因素，有助于重組蛋白在CHO細(xì)胞中的高效表達。 （一）CHO表達系統(tǒng) 1. CHO細(xì)胞表達體系 常用的CHO細(xì)胞系有兩種：CHO和CHO-dhfr-。CHO表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達系統(tǒng)之一，與其它表達系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點：準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子；表達產(chǎn)物胞外分泌，便于分離純化；具有重組基因的高效擴增和表達能力；貼壁生長，有較高的耐受剪

4、切力和滲透壓能力，可進行懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度，培養(yǎng)體積能達到1000L以上；CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。 改造CHO細(xì)胞，可更好地表達外源蛋白。為減少大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程中凋亡的發(fā)生，將bcl-2基因（細(xì)胞凋亡抑制基因）導(dǎo)入細(xì)胞，bcl-2基因的過量表達能抑制Gln或氧缺乏引起的細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞特定營養(yǎng)成分的消耗，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入p21、p27基因，可使細(xì)胞G1期延長（細(xì)胞靜止），改造后細(xì)胞活力正常，營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物含量有效降低，從而減少細(xì)胞凋亡、死亡，外源蛋白表達量提高，產(chǎn)品成本降低。2. 載體系統(tǒng)

5、借助真核基因表達調(diào)控的理論，可將較強的順式作用元件集中到一個載體中，使其方便高效地表達外源基因。目前，已經(jīng)構(gòu)建了許多真核表達載體，它們包含適當(dāng)?shù)捻樖阶饔迷瓦x擇標(biāo)記。順式作用元件主要有啟動子增強子元件、轉(zhuǎn)錄剪切和Poly A信號等；CHO細(xì)胞表達載體中主要有兩類選擇標(biāo)記：非擴增基因和共擴增基因。 2.1啟動子和增強子 啟動子是影響外源基因表達效率的關(guān)鍵因素。作為表達載體元件之一，啟動子既需強的轉(zhuǎn)錄活性，又應(yīng)具備較廣的應(yīng)用范圍。 細(xì)菌的主要啟動子和增強子在動物細(xì)胞中不起作用，所以大多從啟動效率高且生物背景清楚的病毒基因組中分離得到。SV40、LTR和CMV啟動子在CHO細(xì)胞中效果良好。有研究表

6、明：在CHO細(xì)胞中，CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動子和LTR啟動子的10倍和30倍左右。來源于噬菌體的一些啟動子，如T7啟動子也可用于動物細(xì)胞。除了病毒來源的啟動子，現(xiàn)在熱衷于尋找細(xì)胞內(nèi)源性的啟動子，如肽鏈延長因子基因的啟動子（EF-1）、雞胞漿肌動蛋白啟動子等。EF-1啟動子是迄今應(yīng)用中最強的啟動子之一。目前商業(yè)化的表達載體中主要使用SV40、CMV和EF-1啟動子。 外源基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達受許多因素的影響，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面，其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細(xì)胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作

7、用來實現(xiàn)，由于在特定的細(xì)胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。對外源基因而言，也就是決定于特定的表達載體中的啟動子，一個合適的啟動子可將外源基因的表達水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細(xì)胞，各啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別，因此我們認(rèn)為在進行外源基因的表達研究中，應(yīng)考慮選用幾種不同的強啟動子，才有可能獲得較為理想的表達效果。與啟動子相連的是增強子元件，具種、組織特異性，CHO細(xì)胞中一般采用SV40和CMV增強子。2.2選擇標(biāo)記和基因擴增 CHO細(xì)胞表達載體主要有兩類選擇標(biāo)記。一類是neo等非擴增基因，它對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，用于

8、構(gòu)建瞬時表達載體。另一類具有基因擴增的功能，也稱共擴增基因，如二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。 外源基因在CHO細(xì)胞中擴增是提高表達水平的重要策略之一。dhfr基因擴增系統(tǒng)最常用，當(dāng)攜帶dhfr基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，或攜帶dhfr基因的標(biāo)志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞后，可以得到在選擇培養(yǎng)基生長的細(xì)胞克隆，dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不斷提高MTX濃度，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞

9、中，dhfr基因均得以擴增。進行性選擇抗氨甲喋呤的細(xì)胞系，結(jié)果會導(dǎo)致與dhfr串聯(lián)在一起的外源基因的共擴增，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴增的區(qū)域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。但它也有缺陷，表達細(xì)胞僅限dhfr缺陷型細(xì)胞，重復(fù)篩選抗性細(xì)胞費時費力，去除選擇壓力后，擴增基因不穩(wěn)定。細(xì)胞遺傳學(xué)表明，在選擇壓力下，擴增基因的大小和結(jié)構(gòu)處在不斷變化之中。在細(xì)胞分裂的不同時間，不同的宿主細(xì)胞和選擇藥物使基因的擴增范圍處于不斷變化之中，從1001000kb。即使是同一種細(xì)胞，選擇過程不同，基因擴增的范圍

10、也不同。谷氨酰胺合成酶（GS）擴增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴增效率，但細(xì)胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳，DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細(xì)胞生長穩(wěn)定。 基因擴增還可通過弱化選擇標(biāo)記基因表達來達到。弱化選擇標(biāo)記基因的表達，在使用與常規(guī)的表達載體相同的選擇壓力時，dhfr基因拷貝數(shù)更高，外源基因的表達水平也得到提高。如一種雙順反子載體將dhfr基因連在外源基因的3端，從而位于外源基因3端下游的dhfr基因的翻譯起始效率大大降低，dhfr基因表達被弱化。另一種載體將dhfr基因插入人工合成的內(nèi)含子內(nèi)部，兩邊為剪接供體SD和剪接受體SA，外源基因在內(nèi)含子的下游，mRNA剪切時，9

11、5%的dhfr mRNA被剪切掉。也有一些表達質(zhì)粒不含選擇基因，則必須共轉(zhuǎn)染一個可表達選擇基因的標(biāo)志質(zhì)粒，如pSV dhfr,該質(zhì)粒由Psv2 dhfr去除SV40的增強子構(gòu)建而成，起到弱化dhfr基因表達的作用。 2.3其它 表達載體引入天然或人工合成的內(nèi)含子序列，有利于外源基因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA剪接內(nèi)含子，增加穩(wěn)定性，提高翻譯效率，許多真核表達載體帶有SV40的內(nèi)含子。但因大多數(shù)插入的外源基因是cDNA，所以一般也用不著剪接信號。真核基因的mRNA加工需要多聚腺苷酸加尾信號（pA），實驗表明，除去pA后，外源蛋白表達量降低90%。目前多采用SV40的晚期及早期pA、牛生長素基因的pA和

12、人工合成的pA。3. 外源基因 啟動子之后是克隆的基因組DNA或cDNA?；蚪MDNA比cDNA表達量要高，應(yīng)盡量使用基因組DNA。除此之外，可以通過下列方法增加外源基因的表達量：(1)在基因起始密碼子的前后設(shè)置Kozak序列，即GCCGCCA-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的嘌呤。具有Kozak序列與否，翻譯起始強弱會有一個數(shù)量級的差異；(2)盡量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低轉(zhuǎn)錄、翻譯時不必要的能量消耗，另一方面減少5未翻譯前導(dǎo)區(qū)和克隆中的GC尾部對表達水平的不良影響，以及減少3未翻譯區(qū)對mRNA穩(wěn)定性的不良影響； (3)拼接一個重組蛋白的信號前

13、導(dǎo)肽，它可以有效地指導(dǎo)合成、分泌蛋白的輸出等；(4)在不改變蛋白氨基酸序列的前提下，修飾個別基因的編碼序列，解決密碼偏性問題。實際表達中，可根據(jù)表達效果，對基因加以改造，以提高表達量。 4. 表達克隆的篩選 不同的細(xì)胞克隆，外源蛋白表達水平高低不同，原因可能有二方面，一是外源質(zhì)粒片段整合入細(xì)胞染色體的位置不同，有的區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性高，有的轉(zhuǎn)錄活性低；二是不同的細(xì)胞克隆，質(zhì)粒的拷貝數(shù)是不同的。挑選高表達的單克隆細(xì)胞株一般采用兩種流程：第一種方案首先通過檢測外源基因的表達，逐一篩選dhfr陽性單克隆，再轉(zhuǎn)到濃度持續(xù)升高的MTX之下生長，分別進行擴增；另一種方法先把dhfr陽性單克隆合并，在不斷升高的M

14、TX之下加壓擴增外源基因的表達，最后挑出穩(wěn)定的、高表達的單克隆細(xì)胞株。加壓擴增外源基因表達，除了單純使用dhfr擴增系統(tǒng)或GS擴增系統(tǒng)外，也可采用G418與MTX聯(lián)合作用細(xì)胞，G418與MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）聯(lián)合作用細(xì)胞，或者利用dhfr擴增系統(tǒng)與GS擴增系統(tǒng)共加壓。 混合克隆的表達水平遠趕不上表達較高的單個克隆，這是因為轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中存在不表達或低表達的非生產(chǎn)細(xì)胞，并可在長期生存，甚至MTX加壓時占生長優(yōu)勢，排斥其它高表達細(xì)胞，成為細(xì)胞群體中的主要部分，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降，并對MTX加壓無反應(yīng)。當(dāng)撤除MTX，會發(fā)生外源蛋白表達量下降的情況，原因也

15、可能在此。 5. 工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點，一是研究對象是活的細(xì)胞，可長時期地監(jiān)控、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動等；二是可以人為地嚴(yán)格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生物等外界因素對細(xì)胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達到比較均一性。常用的細(xì)胞系均是性質(zhì)均一的細(xì)胞，需要時還可采用克隆化等方法使細(xì)胞進一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細(xì)胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經(jīng)濟等優(yōu)點。 然而，細(xì)胞培養(yǎng)也有其局限性。

16、由于培養(yǎng)的細(xì)胞脫離了機體復(fù)雜的環(huán)境條件，其細(xì)胞形態(tài)和功能都會發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)的細(xì)胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細(xì)胞視為一種既保持動物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體。 由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是其他實驗方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對于分子生物學(xué)家及細(xì)胞生物學(xué)家而言，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)對感興趣的基因產(chǎn)物進行定位、運動及功能研究變得越來越重要。在克隆一個基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細(xì)胞，以分析其表達，測

17、定表達對細(xì)胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_的基因產(chǎn)物純化。 5.1 血清 利用含血清培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白制品有許多不利，如增加培養(yǎng)成本和污染機會，增加純化難度和成本，增加產(chǎn)品質(zhì)控指標(biāo)。因此，大規(guī)模生產(chǎn)臨床使用的生物制品，應(yīng)盡量減少血清的用量，最好用無血清培養(yǎng)基取代。為此，應(yīng)盡可能增加大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的接種密度，以縮短生長延滯期，提高細(xì)胞比生長速率。如果接種密度較低時，在培養(yǎng)開始階段，可使用含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達到一定濃度(如>106/ml)，細(xì)胞進入對數(shù)生長期，再降低血清濃度或使用無血清培養(yǎng)基。外源蛋白的實際產(chǎn)量無明顯下降。許多實驗表明，細(xì)胞的比生長速度相對降低時，產(chǎn)物的比生長速率提高，原因可能是用

18、于細(xì)胞增殖的能量減少，有利于外源蛋白的生產(chǎn)。 使用無血清培養(yǎng)墓代替含血清培養(yǎng)基，可克服血清帶來的弊端。但失去血清中的促細(xì)胞生長因子，細(xì)胞生長減慢，密度降低，生存周期縮短，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)最下降。因此，往往通過增加無血清培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，以優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)，提高蛋白表達。用作血清替代成份的種類很多，大致可分為激素和生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子及低分子量營養(yǎng)因子四類。有研究報道，添加BSA對促進細(xì)胞生長作用顯著，丙酮酸鈉、腐胺、丁酸鈉有利于表達目的產(chǎn)物。不同的CHO工程細(xì)胞的培養(yǎng)基添加成份可能存在差異，一般需要自己進行摸索最優(yōu)條件。 5.2 氧氣和二氧化碳 一般認(rèn)為動物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溶氧在10%60

19、%之間，過高可損傷細(xì)胞膜甚至DNA，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而溶氧過低又會改變細(xì)胞的代謝，降低細(xì)胞蛋白表達水平，甚至因缺氧而導(dǎo)致細(xì)胞逐漸死亡。胡顯文等在利用多孔微載體大規(guī)模培養(yǎng)CHO細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，溶氧維持在20%45%時，對細(xì)胞表達產(chǎn)物和葡萄糖代謝無明顯影響，但溶氧降至7%9%時，細(xì)胞表達水平明顯降低，葡萄糖代謝轉(zhuǎn)化為乳酸 的比例上升，培養(yǎng)基的有效利用率明顯降低。 隨著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和密度的增大，可導(dǎo)致CO2積聚，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中，最適CO2水平為4%10%。當(dāng)達到14%時便會阻礙細(xì)胞生長。高CO2分壓使重組CHO細(xì)胞系的生長和組織型纖溶酶原

20、激活劑(t-PA)產(chǎn)率均受到抑制，而且t-PA糖鏈中包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的唾液酸比例稍下降。 5.3 氮和乳酸 氨和乳酸是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的主要代謝副產(chǎn)品。與乳酸相比，較低濃度的氨就會對重組CHO細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，最終的細(xì)胞密度隨著氨濃度的提高而降低。氨來源于兩方面：一是直接來源于培養(yǎng)基，一是細(xì)胞代謝產(chǎn)生。二者都涉及谷氨酸胺，因此需要防止培養(yǎng)基中Gln自然分解，限制Gln用量，并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。乳酸是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物，高濃度的乳酸也會抑制細(xì)胞的生長。氨和乳酸對細(xì)胞的毒性作用在多種不同的細(xì)胞系均存在，不同細(xì)胞系對于這兩種代謝產(chǎn)物的耐受性差別很大，原因可能是不同細(xì)胞系葡萄糖和谷氨酰胺代

21、謝過程中關(guān)鍵酶的敏感性不同，或者在不良的生長環(huán)境下，氨基酸代謝發(fā)生改變。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，因此降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以及減少乳酸產(chǎn)生的同時，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。 6. 問題和展望 外源蛋白在CHO細(xì)胞中表達的影響因素非常復(fù)雜，建立穩(wěn)定、高效表達的重組CHO細(xì)胞系并非易事。目前主要存在問題如下：重組CHO細(xì)胞生產(chǎn)效率低；某些糖基化表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化；重組CHO細(xì)胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)為上游構(gòu)建時著重考慮它的高效表達，而對產(chǎn)物的分離純化過程考慮較少；重組細(xì)胞培養(yǎng)費用昂貴，自動化水平低下。 重組蛋白在CHO細(xì)胞中高效表達是一個涉及多學(xué)科的問題，需多個研

22、究領(lǐng)域的共同合作探討?？蒲腥藛T可能把以下問題作為今后的主攻方向：提高表達水平，如尋找一些新的強啟動子和合適的增強子、在載體上裝配適合基因高效表達的必要元件、根據(jù)CHO細(xì)胞翻譯特點，調(diào)整外源基因密碼子等；注重分離純化的問題，如改變DNA中的個別序列，使表達產(chǎn)物在不影響生物活性的前提下，攜帶有利于分離純化的基因；細(xì)胞培養(yǎng)的低成本、高密度、高產(chǎn)量和培養(yǎng)設(shè)備的大型化，自動化、精巧化；分離純化的低成本和高活性回收率等方面。（二）CHO-dhfr-/MTX表達系統(tǒng)的應(yīng)用1. 表達重組人促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞的篩選人促紅細(xì)胞生成素（EPO）是人腎（成年）和肝（胎兒）合成的一種糖蛋白，是調(diào)節(jié)和維持紅細(xì)胞生理循環(huán)的

23、重要激素。它特異刺激骨髓紅系細(xì)胞增殖，使機體內(nèi)紅細(xì)胞維持在一個正常水平。由于糖基化對EPO體內(nèi)活性必不可少，因此重組EPO只能在哺乳動物細(xì)胞中表達，才能進行糖基化等翻譯后修飾，從而生產(chǎn)有體內(nèi)活性的EPO。構(gòu)建表達質(zhì)粒，取10g純化后的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染含5ml F12的25cm2培養(yǎng)皿中的CHO-dhfr-細(xì)胞，48h后，經(jīng)胰蛋白酶消化后進行細(xì)胞計數(shù)，用F12培養(yǎng)液將其稀釋成1×104cells/ml，置37 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常后，換用DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，約15d后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆。此時可用彎頭吸管挑取細(xì)胞克隆至 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，同時

24、在培養(yǎng)液中添加MTX，其初濃度為1×10-7mol/L，細(xì)胞充分適應(yīng)并恢復(fù)正常生長后，提高MTX的濃度為4×10-7mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)，至16×10-7mol/L、 64×10-7mol/L，依次 4×遞增。為提高EPO的表達效率，在MTX加壓的過程中選擇條件培養(yǎng)基-MEM代替DMEM。在加壓過程中，不能耐受MTX高壓的細(xì)胞逐漸死亡，能耐受MTX高壓的細(xì)胞存活下來。隨著加壓的進行，細(xì)胞表現(xiàn)出比正常生長速度慢一些的生長趨勢，但能在2-3d內(nèi)恢復(fù)正常，并且傳代后繼續(xù)正常生長。在適當(dāng)?shù)臅r候?qū)?6孔板內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后再轉(zhuǎn)入30ml

25、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，至此細(xì)胞克隆工作即告完成。在挑選克隆的過程中，應(yīng)挑取加壓后表達水平提高較明顯的細(xì)胞株，而非一開始表達量較高的細(xì)胞。在收集培養(yǎng)液的前2d，改用無血清培養(yǎng)液維持。2. 表達人組織型纖溶酶原激活劑t-PA細(xì)胞的篩選人組織型纖溶酶原激活劑t-PA在人體凝血與纖溶平衡中發(fā)揮著重要的作用，它與血栓主要成分纖維蛋白有較強的親和力，可選擇性的溶解血栓。但t-PA在自然界含量甚微，難以大量制備，基因工程手段在哺乳動物細(xì)胞中高效表達t-PA是大量獲得的一種有效途徑。第一個由重組哺乳動物細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白就是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）。同樣采用dhfr-

26、MTX系統(tǒng)表達，受體細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。 采用電擊介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞系，混合加壓篩選高表達克隆株。流程如下：  CHO-dhfr-細(xì)胞2×107個+表達質(zhì)粒200g+鮭精DNA 200g電擊（電容760F、電壓250V、放電時間1000ms）完全培養(yǎng)基（細(xì)胞恢復(fù)2d后1：5傳代）選擇培養(yǎng)基 (選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞 4 5d)1×10-9mol/L MTX加壓約14后克隆出現(xiàn)胰酶消化混合克隆，逐步提高MTX濃度到2×10-8mol/L30d用5×10-8mol/L MTX選擇培養(yǎng)基逐級稀釋傳代14d挑選單克隆細(xì)胞，測表達水平將高表達陽性克隆

27、株擴展，在1×10-7mol/L MTX下再亞克隆獲得高效穩(wěn)定表達克隆株以往表達研究中，dhfr標(biāo)記基因的SV40早期啟動子上游含有SV40 enhancer，dhfr基因表達良好，MTX濃度一般要提高到1×10-6mol/L才能得到t-PA較高水平表達，細(xì)胞常會產(chǎn)生抗MTX的突變，限制了進一步提高MTX濃度來實現(xiàn)外源基因的高效表達。去掉促進dhfr基因轉(zhuǎn)錄enhancer，dhfr表達能力減弱，在較低MTX濃度下，就能迫使dhfr與外源基因共擴增，獲得較高水平的t-PA表達，且提高表達水平的潛能較大。本研究在1×10-7mol/L MTX較低濃度下獲得了FrGG

28、I較高水平的表達，得到了預(yù)期目的。3. 重組人干擾素rhIFN-在CHO細(xì)胞上的表達重組人干擾素rhIFN-是具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用的重要細(xì)胞因子，主要由成纖維細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白。CHO細(xì)胞與大腸桿菌表達的IFN-相比，具有較高的抗病毒比活性，較小的副作用以及較長的半衰期。據(jù)報道，IFN-的基因與SV40早期啟動子融合，與選擇性dhfr標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶基因缺陷的CHO細(xì)胞，通過增加MTX濃度，挑選抗性CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體，目的基因和選擇標(biāo)記基因被擴增。建立的CHO細(xì)胞系，每24h可分泌IFN-200,000300,000IU/ml，并且不需要誘導(dǎo)，表達量10

29、倍于人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的量。該細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-經(jīng)過純化后，與人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-具有相同的理化特性和抗病毒比活性。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，擴大培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒用紫外分光光度計定量消化并計數(shù)CHO細(xì)胞，取1.0×1053.0×105cells孔于24孔板的各孔中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞能長滿90%95%，加0.5ml無抗生素血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。每孔轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，稀釋0.81.0g DNA于50l無血清培養(yǎng)基中；稀釋13l LF2000試劑于OPTI MEMI培養(yǎng)基中，室溫孵育5min。LF2000試劑稀釋后，30min內(nèi)與DNA合并，室溫孵育20min形成DNA LF

30、2000試劑復(fù)合物。DNA LF2000試劑復(fù)合物（100l）直接加到各孔中，前后輕搖細(xì)胞板以混合。37、CO2孵箱內(nèi)孵育2448h直到轉(zhuǎn)移基因表達，不必除去復(fù)合物和換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24h，以110或更高的稀釋度傳細(xì)胞到新鮮的培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染后23d，抗生素加壓，使用400g/ml的G418濃度，用含抗生素的選擇培養(yǎng)基換液，每周2次。1014d后，可見抗性克隆。待克隆長至合適大小時，用Costar毛細(xì)管挑取單克隆到 96孔板，逐漸轉(zhuǎn)移到24孔板、6孔板，直到小方瓶。并用抗病毒活性測定篩選陽性克隆，將表達量較高的細(xì)胞株，傳代擴增凍存。在小方瓶中培養(yǎng)挑選細(xì)胞，逐步增加MTX濃度，從1.0×

31、10-8、5.0×10-8、1.0×10-7、3.0×10-7及6.0×10-7mol/L。每一濃度至少維持兩代，以防止抗MTX細(xì)胞系產(chǎn)生，而dhfr及外源基因并沒有得到擴增。每個濃度細(xì)胞的適應(yīng)時間約為2周，適應(yīng)后繼續(xù)傳代2次，凍存2管種子細(xì)胞，留2管繼續(xù)加壓。并留取細(xì)胞培養(yǎng)上清以檢測IFN-的表達。最終選擇生長狀態(tài)良好、穩(wěn)定高產(chǎn)的細(xì)胞株作為生產(chǎn)備選細(xì)胞株。4. 嵌合抗CD-20抗體分子在CHO細(xì)胞中的表達抗CD-20 單克隆抗體Rituximab在治療B淋巴細(xì)胞瘤方面已表現(xiàn)出顯著的臨床效果。CHO-dhfr-細(xì)胞的轉(zhuǎn)染采用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染法，將表達載體共轉(zhuǎn)染

32、CHO-dhfr-細(xì)胞，細(xì)胞被轉(zhuǎn)染24小時后換新鮮的IMDM選擇培養(yǎng)基（含10%的透析胎牛血清，500mg/L的G418），每4天換一次液，直至細(xì)胞克隆形成。將生長穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，在選擇培養(yǎng)基中加入10-8mol/L MTX，培養(yǎng)23周后繼續(xù)以10倍的MTX濃度梯度加壓培養(yǎng)，直至MTX濃度達到10-6mol/L。5. 抗HBsAg人IgG（重組乙肝疫苗）在CHO細(xì)胞中的表達多年來，對CHO細(xì)胞疫苗的研究已取得很大進展。CHO細(xì)胞疫苗已取代乙肝疫苗大量用于人體。CHO細(xì)胞缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），經(jīng)轉(zhuǎn)染可將dhfr重組到CHO細(xì)胞中，含有dhfr表達載體的重組CHO細(xì)胞，經(jīng)過MTX培養(yǎng)篩

33、選可克隆出表達乙肝細(xì)胞疫苗的重組CHO細(xì)胞，該細(xì)胞生長快，易于單層或懸浮培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染完成后的CHO細(xì)胞按15密度接種于含10%小牛血清，700g/ml G418的DMEM培養(yǎng)基，約2周后將篩選到的陽性克隆用胰酶消化，接種到10%小牛血清和0.005M MTX的DMEM培養(yǎng)基中進行基因擴增，待細(xì)胞在該濃度的MTX環(huán)境中充分適應(yīng)后，按0.02M，0.1M，0.5M，2.0M的順序依次增加MTX的濃度，利用夾心ELISA法檢測抗體的表達情況。選取2個高效表達克隆株進行加壓培養(yǎng)。加壓期間不斷用夾心ELISA檢測嵌合抗體的表達情況來決定MTX的濃度改變時間。6. 表達人粒細(xì)胞集落刺激因子（hG-CSF）

34、的CHO細(xì)胞的篩選人粒細(xì)胞集落刺激因子（hG-CSF）是一種造血生長因子，對粒細(xì)胞減少癥具有顯著功效，天然hG-CSF cDNA由于其本身的結(jié)構(gòu)特點，很難在大腸桿菌中高效表達，基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)藥用重組hG-CSF（rG-CSF）。將G-CSF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一周的CHO細(xì)胞經(jīng)過0.05%胰蛋白酶消化，用CHO選擇培養(yǎng)基將細(xì)胞配成1.0×105cells/ml，置24孔培養(yǎng)板中進行篩選培養(yǎng)，每隔34天更換一次新鮮培養(yǎng)液，經(jīng)過34周的選擇性培養(yǎng)，取長滿2/3細(xì)胞孔的上清，測定其中G-CSF含量，篩選出表達G-CSF的CHO細(xì)胞

35、。采用MTX加壓系統(tǒng)繼續(xù)篩選高表達G-CSF的CHO細(xì)胞。MTX濃度依次為0.02，0.08，0.32，1.28，5.12M 4倍遞增，獲得高表達G-CSF的CHO細(xì)胞。當(dāng)MTX濃度到達1.0M時，G-CSF含量達到最高峰10.52×104IU/ml。7. 嵌合抗體在CHO細(xì)胞中的表達嵌合抗體是利用DNA重組技術(shù)將鼠單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達出人鼠嵌合抗體，其人源化程度達到70%左右，完整地保留了異源單抗的可變區(qū)，最大限度地保持了其親和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗體仍然保留了30%的鼠源性，可誘發(fā)人抗小鼠反應(yīng)HAMA（人抗

36、鼠抗體）。因此需要構(gòu)建新型的嵌合抗體真核高效表達載體。為此我們采用基因工程技術(shù)對鼠單抗進行人源化改造，利用二氫葉酸還原酶基因 （dhfr）在氨甲喋呤加壓下擴增而使其鄰近的基因隨之?dāng)U增的原理，將單抗的可變區(qū)基因克隆到含有弱化啟動子驅(qū)動選擇標(biāo)志基因的真核高效表達載體中，構(gòu)建抗人/鼠嵌合抗體基因，并在CHO細(xì)胞中實現(xiàn)了穩(wěn)定高產(chǎn)量表達。將1×106個CHO-dhfr-細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加IMDM完全培養(yǎng)基于50ml/L，CO2 37培養(yǎng)36h。采用Lipofectin誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染，同時轉(zhuǎn)染空載體作為對照。轉(zhuǎn)染用的DNA為4g，Lip為10ml。轉(zhuǎn)染后6h，換含100ml/L的透析血清

37、的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)（不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶）。3d后換液，用300nmol/L MTX進行加壓篩選，待2星期左右出現(xiàn)陽性細(xì)胞克隆時，擴大培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。8. 其它（1）    EpsteinBarr病毒膜抗原在CHO細(xì)胞的表達（2）    人白細(xì)胞介素在CHO細(xì)胞表達（3）    表達人防御素細(xì)胞株篩選（4）    豬瘟病毒E0基因在CHO細(xì)胞中的表達CHO-dhfr-/MTX表達體系在真核表達系統(tǒng)中應(yīng)用十分廣泛。這幾個方面的應(yīng)用在重組載體構(gòu)建、CHO-dhfr-細(xì)胞轉(zhuǎn)染

38、、高效表達細(xì)胞株的篩選和重組蛋白的誘導(dǎo)表達等方面與另7個應(yīng)用均有相似之處。不做另行介紹。（三）討論有些天然的具有生物活性的蛋白類物質(zhì)，在人類疾病的治療中發(fā)揮著巨大的作用。但是這些活性物質(zhì)，有些在自然界中含量很少，滿足不了人們的需要；有些含異源蛋白太多，純化難度大等缺點，基因工程藥物的產(chǎn)生解決了這些難題，具有跨時代的意義，是生物技術(shù)水平發(fā)展的重要標(biāo)志之一。重組蛋白質(zhì)藥物具有活性高、用量少、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，是國內(nèi)外生物藥物開發(fā)的重點。 細(xì)胞表達源蛋白最重要的是要保持其天然結(jié)構(gòu)及活性。而早期的原核表達系統(tǒng)不能分泌有活性的蛋白，都是以內(nèi)涵體的形式存在的，真核表達系統(tǒng)因為具有轉(zhuǎn)錄后的修飾加工功能，

39、包括蛋白折疊、二硫鍵形成、亞基多聚化、肚鏈裂解、蛋白磷酸化以及N型和O型糖基化等，因而表達的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面更接近于天然的蛋白分子，具有生物活性，可分泌胞外。CHO細(xì)胞是外源蛋白表達運用得較為成功的哺乳動物細(xì)胞，其用于外源基因表達也具有很多優(yōu)點，如外源基因能夠穩(wěn)定整合于細(xì)胞染色體內(nèi)，易于規(guī)?；囵B(yǎng)等。由于CHO-dhfr-細(xì)胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過目的基因與dhfr基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細(xì)胞克隆，

40、更為重要的是由于dhfr可被葉酸類似物MTX所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因必須擴增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細(xì)胞系；又由于與dhfr基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細(xì)胞染色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著dhfr基因的擴增而擴增，我們就得到了能大量表達外源蛋白的細(xì)胞克隆，這在基因工程抗體及各種基因工程蛋白的表達中是可行度很高的一種措施。上面也提到影響重組蛋白在CHO細(xì)胞中表達的因素很多，涉及CHO細(xì)胞表達體系、表達載體系統(tǒng)、外源基因、表達細(xì)胞株的加壓擴增與篩選、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)等。我認(rèn)為表達載體的構(gòu)建是影響細(xì)胞能否表達的關(guān)鍵問題，因為dhfr基因及鄰近區(qū)段染色體DNA拷貝數(shù)是共擴增的關(guān)系，因此必須將外源基因片段整合到dhfr基因的上游或者下游，位置不能太遠，否則無論如何篩選也得不到表達外源基因產(chǎn)物的細(xì)胞，因此說它是能否表達的關(guān)鍵，當(dāng)然其它步驟也不能忽略，如CHO-dhfr-細(xì)胞轉(zhuǎn)染、使用強啟動子等。如果構(gòu)建成功可以產(chǎn)生外源蛋白，那么篩選高表達的細(xì)胞株等操作就是提高外源蛋白表達量的問題，使外源蛋白高效表達