病原生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用及細(xì)菌的觀察

1、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 接觸到病原菌，一定要堅(jiān)持無菌操作 進(jìn)實(shí)驗(yàn)室穿上白大衣，離開時(shí)反折 嚴(yán)禁飲食，也不要以手撫摸頭、面等部位 若發(fā)生吸入菌液，割破手指等事故，必須報(bào)告老師 接觸過菌液的吸管、玻片等器材，投入含有23%來蘇兒的容器內(nèi) 實(shí)驗(yàn)完畢，整理桌面微生物實(shí)驗(yàn)要求 做實(shí)驗(yàn)后要認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，所得結(jié)果必須真實(shí)記錄浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱： 實(shí)驗(yàn)類型： 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱： 學(xué)生姓名： 專業(yè)： 學(xué)號(hào)： 同組學(xué)生姓名： 指導(dǎo)老師： 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)日期： 年 月 日實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）主要儀器設(shè)備操作方法與實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）討論、心得實(shí)驗(yàn)一 顯

2、微鏡的使用及細(xì)菌的觀察實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 操作：油鏡的使用細(xì)菌材料玻片標(biāo)本制備革蘭染色法（Gram Stain ） 示教 細(xì)菌的基本形態(tài) 鏈球菌 螺形菌 - 弧菌（霍亂弧菌）細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu) 鞭毛（變形桿菌） 莢膜（肺炎鏈球菌） 芽胞（破傷風(fēng)梭菌） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握油鏡的使用和保護(hù) 熟悉細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的鏡下特點(diǎn) 掌握無菌操作 掌握革蘭染色法顯微鏡的使用和保護(hù) - 原理 油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)稱為油浸系。這種油常選用香柏油 如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，稱為干燥系，當(dāng)光線通過載玻片后，受折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這就降低了視野的照明度

3、香柏油的折射率n1.515，與玻璃n1.52相近。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射油浸沒物鏡油浸沒物鏡 介質(zhì)：空氣；香柏油油鏡的識(shí)別 油鏡的鏡筒最長(zhǎng)，透鏡直徑最小，上面刻有90倍或100倍或Oil等油鏡的使用 先按低倍鏡到高倍鏡的操作步驟找到物像，并將觀察部分移至視野的中央。 轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使高倍鏡移向一側(cè)，在蓋玻片上滴一滴香柏油，然后將油鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，使油鏡下端與香柏油接觸使油鏡下端與香柏油接觸(注意操作動(dòng)作要慢，以免壓碎玻片或損壞鏡頭)。 從目鏡內(nèi)觀察，微微上下轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，至視野內(nèi)出現(xiàn)清晰的物像時(shí)為止。 油鏡使用完畢后，必須用拭鏡紙沾少許二甲苯將油鏡上的香柏油擦凈，

4、并用干的拭鏡紙檫去二甲苯。 顯微鏡用畢后，升高鏡簡(jiǎn)，取下玻片標(biāo)本，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使每個(gè)物鏡都不對(duì)準(zhǔn)通光孔，再下降鏡筒，使物鏡接近載物臺(tái)，將聚光鏡降下，最后放回櫥內(nèi)。 細(xì)菌材料玻片標(biāo)本制備 涂片-干燥-固定 涂片：涂片：先取一接種環(huán)生理鹽水放于載玻片的一端，左手持菌液試管，右手持接種環(huán)，用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中挑取少許大腸桿菌或葡萄球菌大腸桿菌或葡萄球菌培養(yǎng)物與鹽水混勻，涂成直徑約1厘米的涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。 干燥：干燥：涂片最好放置室溫中，待其自然干燥。 固定：固定：手執(zhí)玻片的一端標(biāo)本面向上，在火焰外層較快地來回通過三次，約23秒，以玻片反面觸及皮膚，以不覺過分地燙為度。待放置冷卻后，進(jìn)行染色。

5、 掌握無菌操作掌握無菌操作 拔或塞試管帽時(shí)，應(yīng)將試管口通過火焰略加燒灼；拔或塞試管帽時(shí)，應(yīng)將試管口通過火焰略加燒灼； 接種環(huán)使用前后應(yīng)在火焰上燒灼滅菌接種環(huán)使用前后應(yīng)在火焰上燒灼滅菌固定的目的固定的目的 殺死微生物，固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu)殺死微生物，固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu) 保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免水洗時(shí)被水沖掉水洗時(shí)被水沖掉 改變菌體對(duì)染料的通透性，一般死細(xì)胞原改變菌體對(duì)染料的通透性，一般死細(xì)胞原生質(zhì)容易著色。生質(zhì)容易著色。革蘭染色法 由丹麥C.Gram于1884年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色法，通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G

6、-）兩大類 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)革蘭染色法原理 G菌菌胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入。同時(shí)乙醇使細(xì)胞壁脫水形成一道屏障，阻止結(jié)晶紫碘復(fù)合物從胞內(nèi)滲出，故細(xì)菌仍保留初染時(shí)的紫色。紫色。 G菌菌胞壁結(jié)構(gòu)較為疏松，肽聚糖層很薄，外膜含大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，致使細(xì)胞壁通透性變大，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被乙醇溶解析出而脫色，故細(xì)菌呈復(fù)染時(shí)的紅色紅色革蘭染色方法 初染：滴加結(jié)晶紫結(jié)晶紫染液,染1分鐘,水洗. 媒染：滴加盧戈氏碘液盧戈氏碘液,作用1分鐘后,水洗. 脫色：加95%酒精酒精23滴于涂片上,頻頻搖晃35秒鐘后,斜持玻片,使酒精流去;再滴加酒精,如此反復(fù)23次,直至流下的酒精無色或稍呈

7、淡紫色時(shí)為止,約半分鐘。水洗 復(fù)染：滴加稀釋石炭酸復(fù)紅稀釋石炭酸復(fù)紅染1/21分鐘,水洗,待干,油鏡檢查. （紫碘紫碘酒酒紅紅、分分半半）、分分半半）革蘭染色結(jié)果 - 陽紫陽紫陰紅陰紅 凡能固定結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物,而不易被酒精脫色,仍保留紫色,稱為革蘭陽性菌革蘭陽性菌. 凡易能被酒精脫色,再經(jīng)復(fù)染成紅色的細(xì)菌,稱為革蘭陰性菌革蘭陰性菌 陽球陽球陰桿陰桿，腦、淋、白、胞、抗例外，腦、淋、白、胞、抗例外仔細(xì)觀察（染色性，形態(tài)，排列），繪圖革蘭染色的意義 鑒別細(xì)菌：鑒別細(xì)菌：鑒別G+, G-,初篩標(biāo)本 選擇用藥選擇用藥 致病物質(zhì)致病物質(zhì) 大多 G+外毒素，G- 內(nèi)毒素示教 - 細(xì)菌的基本形態(tài) 細(xì)菌從形態(tài)上分，主要有球菌、桿菌、螺形菌三種。 鏈球菌的示教片 霍亂弧菌的示教片示教 - 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu) 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)：芽胞、莢膜、鞭毛，另一種菌毛在電鏡下才可以見到。 芽胞增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)不良環(huán)境的抗性； 莢膜抗吞噬、抗損傷