虎眼萬年青總皂苷對大鼠肝癌變過程中Ki67及Flt-1表達(dá)的影響

1、虎眼萬年青總皂苷對大鼠肝癌變過程中虎眼萬年青總皂苷對大鼠肝癌變過程中 Ki67Ki67 及及 Flt-Flt-1 1 表達(dá)的影響表達(dá)的影響作者：千昌石，金星林，杜希臣，樸東明，金京順，吳艷玲【摘要】【摘要】目的動態(tài)檢測虎眼萬年青總皂苷對二乙基亞硝胺誘發(fā)的大鼠肝癌變過程中肝組織中 Ki67、血管內(nèi)皮生長因子受體（Flt-1）表達(dá)的影響。方法二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌變，虎眼萬年青總皂苷干預(yù)，運(yùn)用免疫組化方法觀察并分析第 12 周末、14 周末、18 周末肝組織標(biāo)本中 Ki67、Flt-1 的表達(dá)。結(jié)果肝癌變過程中以 12 周模型組 Ki67 LI 表達(dá)最高，14 周及 18 周模型組 Ki67 L

2、I逐漸降低，與 12 周模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。虎眼萬年青總皂苷作用的 12 周預(yù)防組 Ki67 LI 較低且與相應(yīng) 12 周模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。誘癌 14 周模型組Flt-1 LI 表達(dá)最高， 12 周及 18 周模型組 Flt-1 LI 相對低下，與 14 周模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。虎眼萬年青總皂苷作用的 14 周預(yù)防組、治療組 Flt-1 LI降低，且與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第一論文范文網(wǎng) 編輯。結(jié)論二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌變過程中以肝損傷、硬化階段肝細(xì)胞增生活躍，而虎眼萬年青總皂苷干預(yù)此階段的肝細(xì)胞增生。二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌變過程中在肝癌發(fā)生階段 Flt-1 表達(dá)較高，虎眼萬年青總皂苷干

3、預(yù)此階段 Flt-1 表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】虎眼萬年青總皂苷； 二乙基亞硝胺； 肝； 實(shí)驗(yàn)； Ki67；Flt-1Abstract：ObjectiveTo study the dynamic expression of Ki67 andFlt-1 in the hepatic tissue in diethylnitrosamine(DEN)_inducedhepatocarcinogenesis and the effect interfered with Ornithogalumcaudatum Ait total saponin(OCA-TS). MethodsKi67 and Fl

4、t-1 wereobserved with immunohistochemical staining in DEN_inducedhepatocarcinogenesis after 12 weeks,14 weeks and 18 weeksrespectively.ResultsThe expression of Ki67 labeling index (LI) weresignificantly higher in the group of experiment than the normal group.The expression of Ki67 LI were the highes

5、t in the 12 weeks modelgroup, the OCA-TS interfered the expression of Ki67 LI in thisperiods significantly. And the Ki67 LI decreased gradually in the 14weeks and 18 weeks model group, there had significant correlationbetween the 12 weeks model group respectively. And in these periodsthe OCA-TS inte

6、rfered the expression of Ki67 LI not too much. We alsofound the expression of Flt-1 labeling index (LI) were significantlyhigher in the group of experiment than the normal group. Theexpression of Flt-1 LI were the highest in the 14 weeks model group,the OCA-TS interfered the expression of Flt-1 LI i

7、n this periodssignificantly. And the Flt-1 LI decreased in the 12 weeks and 18weeks model group relatively, there had significant correlation between the 14 weeks model group respectively. And in theseperiods the OCA-TS interfered the expression of Flt-1 LI not toomuch.ConclusionThe hepatocellular e

8、xist hyperplasia in the periods ofhepatic trauma and hepatic cirrhosis with DEN inducedhepatocarcinogenesis, and the OCA-TS interfered the hepatocellularhyperplasia. The expression of Flt-1 is significantly high in thehepatocellular carcinoma occuring periods, and the OCA-TS interferedthe expression

9、 of Flt-1 in this periods.Key words：Ornithogalum caudatum Ait total saponin(OCA-TS);Hepaticcancer;Diethylnitrosamine(DEN);Experimental;Ki67;Flt-1虎眼萬年青 Ornithogalum caudatum Ait 為百合科多年生球根植物，原產(chǎn)于非洲南部，民間全草入藥，用于抗炎癥、抗腫瘤等治療。第一論文范文網(wǎng)WWW.11665.COM 整理。虎眼萬年青球莖中含有大量的生物堿及化學(xué)成分，其中虎眼萬年青皂苷（OSW-1）抗 P338 淋巴細(xì)胞白血病活性，是常見抗

10、癌藥物喜樹堿、阿霉索、紫杉醇抗癌活性的 10100 倍，而對正常細(xì)胞沒有毒性1。由于 OSW-1 提取、合成工藝復(fù)雜且較昂貴，給廣泛的實(shí)驗(yàn)、應(yīng)用研究工作帶來一定困難。為了進(jìn)一步開發(fā)和利用虎眼萬年青植物，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用虎眼萬年青總皂苷動態(tài)檢測對二乙基亞硝胺誘發(fā)的大鼠肝癌變過程中肝組織中 Ki67、血管內(nèi)皮生長因子受體（Flt-1）表達(dá)的影響。1 1材料與方法材料與方法1.1藥物提取取植物虎眼萬年青，在自然條件下干燥，粉碎成粉。加入95%的乙醇浸泡 24 h，紗布、濾紙過濾后，收集濾液，濾渣繼續(xù)加入乙醇浸泡，同上方法循環(huán) 3 次，收集濾液，將 3 次所得濾液合并。濾液經(jīng)減壓濃縮為原來體積的 1/5，再

11、用 1/3 體積的石油醚萃取脫脂，保留水相，再次減壓蒸餾后，加水稀釋上 AB-8 柱吸附，反復(fù)吸附 3 次，68 倍柱體積水洗掉糖后用 5倍柱體積 95乙醇洗脫皂苷。所得皂苷洗脫液，經(jīng) D-280 柱脫色后，減壓濃縮后蒸干，即為虎眼萬年青總皂苷。1.2實(shí)驗(yàn)動物及設(shè)計(jì)雄性 Wistar 清潔級大鼠 76 只，體質(zhì)量 130150g，購自延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心。動物適應(yīng) 3 d 后開始實(shí)驗(yàn)。正常組：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均飲用滅菌自來水及基礎(chǔ)飼料，并于 18 周末宰殺 6 只。模型組：每日給予基礎(chǔ)飼料同時(shí)，用滅菌自來水配制濃度為 95 g/ml 的二乙基亞硝胺(DEN)溶液（美國 Sigma 公司，避

12、光保存，新鮮配制)，供大鼠自由飲用，每天更換 1 次。連續(xù)飲用 4 周后，改飲一般的滅菌自來水 4 周，再繼續(xù)飲含 95g/ml 的 DEN 溶液。并分別于飼養(yǎng)第 12 周末、14 周末、18 周末分別宰殺各 6只。肝硬化預(yù)防組：于實(shí)驗(yàn)開始在肝癌模型建立的同時(shí), 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠虎眼萬年青總皂苷的 LD50 為 3.2 g/kg, 以接近于 LD50 之 1/30 的劑量，即相當(dāng)于100 mg/kg 的給藥濃度，以蒸餾水制成所需濃度的混懸液,每日灌胃并分別于第12 周末、14 周末各宰殺 6 只。肝硬化治療組：第 10 周后從模型組中隨機(jī)選出8 只，按模型組飼養(yǎng)同時(shí)給予虎眼萬年青總皂苷 100

13、mg/kg，并于第 14 周末宰殺。肝癌治療組：第 14 周后從模型組中隨機(jī)選出 8 只，按模型組飼養(yǎng)同時(shí)給予虎眼萬年青總皂苷 100 mg/kg，并于第 18 周末宰殺。1.3取材及處理各組大鼠宰殺前禁食 12 h，稱體質(zhì)量,乙醚麻醉后, 解剖腹腔，完整分離各組大鼠之肝臟，固定于 10%甲醛溶液中，石蠟包埋，制備成 5 m 厚的切片。1.4試劑與方法兔抗多克隆抗體 Ki67 Ab (NeoMarkers 公司，濃縮型)，即用型快捷免疫組化 MaxVision 試劑盒(KIT-5400，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。采用免疫組化二步法，Ki67 抗體稀釋倍數(shù)為 1300，進(jìn)行Ki67 免疫組

14、化染色并觀察結(jié)果。采用 SP 法進(jìn)行 Ki-67 的染色, DAB 顯色, 以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，以 PBS 代替一抗作陰性對照。Ki-67 抗原陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)（LI）：每例選擇染色均勻的 5 個(gè)視野,在 200物鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù), 取平均值。兔抗多克隆抗體 VEGFR1（Flt-1）(NeoMarkers 公司，濃縮型)，即用型快捷免疫組化 MaxVision 試劑盒(KIT-5400，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。采用免疫組化二步法，F(xiàn)lt-1 抗體稀釋倍數(shù)為1200，進(jìn)行 Flt-1 免疫組化染色并觀察結(jié)果。采用 SP 法進(jìn)行 Flt-1 的染色,DAB 顯色, 以

15、細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，以 PBS 代替一抗作陰性對照。Flt-1 抗原陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)（LI）：每例選擇染色均勻的 5 個(gè)視野,在200物鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù), 取平均值。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)采用 SPSS14 for Windows 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，t 檢驗(yàn)、方差分析。2 2結(jié)果結(jié)果2.1各實(shí)驗(yàn)組光鏡下形態(tài)學(xué)改變2.1.1Ki67 正常組肝細(xì)胞（圖 1a）；12 周模型組以增生結(jié)節(jié)著色顯著（圖 1b）；12 周預(yù)防組陽性細(xì)胞稀疏（圖 1c）14 周預(yù)防組、治療組以水變性肝細(xì)胞著色顯著（圖 1d），肝硬化細(xì)胞著色深度強(qiáng)于肝癌細(xì)胞（圖 1e）；14周模型組以肝癌細(xì)胞與肝硬化

16、細(xì)胞著色相似（圖 1f）；18 周治療組肝癌細(xì)胞與肝硬化細(xì)胞著色強(qiáng)度弱，深度相似（圖 1g）。第一論文范文網(wǎng) 整理。18 周模型組肝硬化與肝癌細(xì)胞著色相似（圖 1h）。2.1.2Flt-1 正常組肝細(xì)胞無著色（圖 2a）；12 周模型組水變性細(xì)胞著色（圖 2b）或增生結(jié)節(jié)細(xì)胞著色（圖 2c）；12 周預(yù)防組匯管區(qū)肝細(xì)胞著色（圖 2d）；14 周預(yù)防組、治療組肝硬化細(xì)胞灶狀著色（圖 2e）；14 周模型組變性細(xì)胞、匯管區(qū)細(xì)胞著色強(qiáng)（圖 2f）；18 周肝癌治療組著色弱（圖 2g）；18 周模型組肝癌細(xì)胞著色（圖 2h）。圖 2免疫組化染色結(jié)果（SP100）Flt-1 的表達(dá)2.2各實(shí)驗(yàn)組 Ki6

17、7 及 Flt-1 的指數(shù) LI 差異2.2.1Ki67 中各實(shí)驗(yàn)組與正常組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）；模型組 12周時(shí) LI 值最高，12 周預(yù)防組顯著抑制 LI 值，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；誘癌 18 周時(shí)模型組與治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；模型14 周、模型 18 周與模型組 12 周間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05，P0.01）。結(jié)果見表 1。2.2.2各實(shí)驗(yàn)組與正常組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；14 周預(yù)防組、治療組與模型組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01，P0.05）；模型組 14 周與模型組 12 周，18 周間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01,P0.05）。詳見表 1

18、。表 1大鼠肝癌變過程中肝組織中 Ki-67 LI 與 Flt-1 LI 檢測結(jié)果(略)Ki67 中各實(shí)驗(yàn)組與正常組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）；*與模型組 12 周間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；#與模型組 12 周間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）。Flt-1中各實(shí)驗(yàn)組與正常組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）；與模型組 14 周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；與模型組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）3 3討論討論腫瘤的發(fā)生及其生物學(xué)特性與其異常增殖有著密切關(guān)系。因此，藥物干預(yù)腫瘤細(xì)胞增殖的研究已成為關(guān)注的熱點(diǎn)2。Ki-67 作為增殖細(xì)胞核抗原，是一種敏感而特異的增殖期細(xì)胞標(biāo)志物，在細(xì)胞周期的 G1，G2，M

19、，S 期都表達(dá)，其中 G2、M 期表達(dá)最強(qiáng)，G0 期不表達(dá)，是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性及其生物學(xué)行為的重要參數(shù)3。Ki67 是一種能識別存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，能反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，是判斷腫瘤侵襲力和腫瘤預(yù)后的有效指標(biāo)4。本研究以二乙基亞硝胺作為建立肝癌模型的誘導(dǎo)劑，并以虎眼萬年青總皂苷干預(yù)，動態(tài)檢測肝組織標(biāo)本的 Ki67 的表達(dá)。發(fā)現(xiàn) 12 周模型組以增生結(jié)節(jié)著色顯著，12 周預(yù)防組陽性細(xì)胞稀疏；14 周預(yù)防組、治療組以水變性肝細(xì)胞著色顯著，肝硬化細(xì)胞著色深度強(qiáng)于肝癌細(xì)胞；14 周模型組肝硬化細(xì)胞著色與肝癌細(xì)胞著色相似；18 周治療組肝癌細(xì)胞與肝硬化細(xì)胞著色相似，強(qiáng)度弱

20、。18 周模型組肝硬化與肝癌細(xì)胞著色相似，較強(qiáng)。說明虎眼萬年青皂苷具有抑制肝細(xì)胞異常增生作用。肝癌變過程中以 12 周 Ki67 LI 最高，說明此階段肝細(xì)胞增生活躍，而虎眼萬年青總皂苷干預(yù)此階段的肝細(xì)胞增生。至 14 周及 18 周模型組Ki67 LI 逐漸降低，與 12 周模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；⒀廴f年青總皂苷干預(yù)的 14 周及 18 周 Ki67 LI 與相應(yīng)的模型組間統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異。是否能說明肝細(xì)胞活躍增生主要發(fā)生在肝損傷上硬變期，且進(jìn)一步說明虎眼萬年青總皂苷干預(yù)肝細(xì)胞異常活躍增生。多血供的肝癌結(jié)節(jié) VEGF 及其受體表達(dá)較強(qiáng)，腫瘤的生長，局部浸潤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與 VEGF 及其受體

21、密切相關(guān)，VEGF 首先來源于旁分泌，在后期腫瘤自分泌是 VEGF 高表達(dá)的重要來源，這可能是肝癌阻斷血供后，癌灶能存活，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一5。第一論文范文網(wǎng) 編輯。Kanno et al6發(fā)現(xiàn) VEGF 受體-1(Flt-1)作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移.Flt-1 基因缺陷的小鼠則顯示血管發(fā)育的無序紊亂, 顯示 Flt-1 在胚胎血管發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用. Flt-1 通過一種拮抗 VEGF 信號的可溶形式對血管生成起著調(diào)節(jié)作用, 以確保血管生成期間的正確萌芽, Flt-1 對血管的萌生和生長有正向調(diào)節(jié)作用7。本研究中我們發(fā)現(xiàn) 12 周模型組水變性細(xì)胞或增生結(jié)節(jié)細(xì)胞著色；12 周預(yù)防組匯

22、管區(qū)肝細(xì)胞著色較明顯；14 周預(yù)防組、治療組肝硬化細(xì)胞灶狀著色；14 周模型組變性細(xì)胞、匯管區(qū)細(xì)胞著色強(qiáng)；18 周肝癌治療組著色弱；18 周模型組肝癌細(xì)胞著色。說明虎眼萬年青皂苷具有抑制血管增生，具體著色細(xì)胞規(guī)律，待進(jìn)一步研究。誘癌 14 周模型組 Flt-1 LI 表達(dá)最高，虎眼萬年青總皂苷作用的 14 周預(yù)防組、治療組 Flt-1 LI 降低，且與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明肝癌誘發(fā)過程中以促進(jìn)期（14 周）Flt-1 表達(dá)較高，虎眼萬年青總皂苷在此期干預(yù) Flt-1 表達(dá)，防止肝癌的進(jìn)一步發(fā)展。模型組 12 周，18 周 LI 相對低下，與 14 周模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。是否能說明促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移主要發(fā)生在肝癌變期（14 周）且進(jìn)一步說明虎