已知可瀝濾物測(cè)定方法驗(yàn)證及確認(rèn)

1、已知可瀝濾物測(cè)定方法驗(yàn)證及確認(rèn)技術(shù)審查指導(dǎo)原則一、前言醫(yī)療器械的可瀝濾物（Leachables）是指在臨床使用過(guò)程中，醫(yī)療器械與水或使用中有關(guān)的液體、氣體作用等介質(zhì)作用時(shí)，從該醫(yī)療器械中釋放出的化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)?？蔀r濾物一般包括滅菌殘留劑、工藝殘留物、降解產(chǎn)物以及材料中的單體及添加劑（包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、增塑劑、著色劑等）。在醫(yī)療器械產(chǎn)品與人體接觸并發(fā)揮作用的過(guò)程中，可瀝濾物也在或短期或長(zhǎng)期地對(duì)人體產(chǎn)生安全性方面的危害?？蔀r濾物安全性評(píng)價(jià)首要任務(wù)是建立擬研究物質(zhì)的允許限量（Allowable limit），其次，應(yīng)在臨床模擬最壞使用環(huán)境下測(cè)定其釋放量（Release），并根據(jù)其釋放量是否超過(guò)其

2、在該產(chǎn)品該預(yù)期用途下的允許限量，形成完整的可瀝濾物安全性研究報(bào)告，其中，可瀝濾物的釋放量測(cè)定方法的設(shè)計(jì)和方法學(xué)驗(yàn)證是評(píng)價(jià)可瀝濾物安全性研究報(bào)告質(zhì)量和可靠性的重要依據(jù)。本指導(dǎo)原則是對(duì)醫(yī)療器械已知可瀝濾物測(cè)定方法研究的一般要求，申請(qǐng)者應(yīng)依據(jù)具體產(chǎn)品的特性和擬研究可瀝濾物性質(zhì)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。申請(qǐng)者還應(yīng)依據(jù)具體可瀝濾物的特性和分析方法確定釋放量測(cè)定方法的設(shè)計(jì)和方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。本指導(dǎo)原則旨在幫助和指導(dǎo)申請(qǐng)者對(duì)醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料進(jìn)行準(zhǔn)備，以滿(mǎn)足技術(shù)審評(píng)的基本要求。同時(shí)有助于審評(píng)機(jī)構(gòu)對(duì)該類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行科學(xué)規(guī)范的審評(píng)，提高審評(píng)

3、工作的質(zhì)量和效率。本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)者和審查人員的指導(dǎo)性文件, 但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)的進(jìn)行調(diào)整。二、適用范圍本指導(dǎo)原則適用于醫(yī)療器械注冊(cè)申報(bào)時(shí)對(duì)已知可瀝濾物釋放量的研究和產(chǎn)品技術(shù)審評(píng)的參考。本指導(dǎo)原則僅適用于已知可瀝濾物研究，已知可瀝濾物的信息可以通過(guò)以下途徑獲得：1）從原料供應(yīng)商處獲得材料的組成信息

4、并預(yù)測(cè)潛在的可瀝濾物；2）通過(guò)生產(chǎn)工藝文件獲得額外的加工助劑信息，例如脫模劑、粘合劑；3）通過(guò)已有醫(yī)療器械用材料的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)等資料查閱獲得潛在的可瀝濾物信息；4）通過(guò)浸提試驗(yàn)（Extraction study）獲得信息，預(yù)測(cè)潛在的可瀝濾物。本指導(dǎo)原則不適用于對(duì)未知可瀝濾物的測(cè)定研究，但部分內(nèi)容可參考使用。三、注冊(cè)申報(bào)資料要求1.已知可瀝濾物信息 企業(yè)應(yīng)提供已知可瀝濾物的基本信息，包括：化學(xué)名稱(chēng)、化學(xué)式及結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)（如有）、來(lái)源、最終醫(yī)療器械中的使用及加工方式、用途（適用時(shí)）、添加量（如適用），如可能，還應(yīng)提供可瀝濾物的理化性能，如酸堿性、密度、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、溶解特性及相應(yīng)溶解度、極性特性等

5、。2.已知可瀝濾物安全性研究的基本步驟應(yīng)首先確認(rèn)該已知可瀝濾物是否為原材料或最終醫(yī)療器械生產(chǎn)過(guò)程中添加的添加劑劑，如抗氧化劑、穩(wěn)定劑等成分。如果是，應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)該添加劑在原材料或最終醫(yī)療器械中的添加總量是否超過(guò)該已知可瀝濾物的允許限量，如果未超過(guò)，則一般無(wú)需對(duì)該可瀝濾物本身的安全性做進(jìn)一步的研究，如果超過(guò)了允許限量，則應(yīng)模擬臨床實(shí)際使用最?lèi)毫迎h(huán)境，通過(guò)浸提試驗(yàn)研究，獲得其最大溶出量（可參考附錄1流程圖），并根據(jù)其允許限量形成完整的安全性評(píng)價(jià)報(bào)告。值得注意的是，可瀝濾物來(lái)源可能不僅是器械原材料及工藝信息中提供的添加劑、單體、加工助劑本身，某些情況下，器械及其原材料在生產(chǎn)、制造、貯存及使用等過(guò)程中

6、產(chǎn)生的上述化學(xué)物質(zhì)的水解、降解或反應(yīng)產(chǎn)物等宜同時(shí)納入可瀝濾物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的考慮。3.浸提液制備的論述3.1 浸提方式選擇浸提是通過(guò)最大限度的實(shí)驗(yàn)室模擬獲得醫(yī)療器械臨床實(shí)際使用環(huán)境獲下可瀝濾物釋放的進(jìn)入人體的物質(zhì)的量，然而大部分醫(yī)療器械很難模擬臨床使用條件，特別是長(zhǎng)期植入類(lèi)器械，因此某些情況下可通過(guò)可浸提物（extractables）研究替代可瀝濾物研究，即采用浸提方式制備浸提液進(jìn)行已知可瀝濾物測(cè)定，但是務(wù)必對(duì)浸提方式進(jìn)行論述，證明浸提條件是嚴(yán)于器械臨床使用條件。常用的浸提方式包括模擬浸提、加嚴(yán)浸提、加速浸提和極限浸提（具體可參考GB/T 16886.12部分定義），一般來(lái)說(shuō)模擬浸提最接近于實(shí)際，極

7、限浸提（此處及此后提到的極限浸提均指的是所用溶劑符合下面論述前提下的溶劑）獲得結(jié)果可能大于或等于患者實(shí)際可能接受到的劑量或模擬浸提獲得的結(jié)果。但有些特殊情況下，因?qū)嶋H使用條件很難在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行模擬，則優(yōu)先推薦使用極限浸提法，比如產(chǎn)品屬于持久接觸（接觸時(shí)間>30天）等。需要說(shuō)明的是，某些器械采用模擬浸提法可能會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較大的浸提體積，這種情況下，則可能需要極大地提高對(duì)殘留物測(cè)定的靈敏度以滿(mǎn)足安全性評(píng)價(jià)的要求。極限浸提法排除了時(shí)間對(duì)劑量測(cè)定的影響，不能保證所測(cè)得的可瀝濾物在與器械接觸的第一天或第一個(gè)月完全放給患者，但如果通過(guò)極限浸提法測(cè)定出產(chǎn)品上存在的全部殘留量符合安全性評(píng)價(jià)的要求，則一般不需

8、要再進(jìn)行模擬法研究。除采用前述浸提的方式外，有時(shí)還可以采用其他方式獲得擬研究物質(zhì)。比如分析某些醫(yī)療器械產(chǎn)品上易揮發(fā)性有機(jī)物時(shí)可以采用頂空進(jìn)樣分析，這種分析方法一般更加適用于揮發(fā)性可瀝濾物，并同樣能夠達(dá)到預(yù)期的研究目的。對(duì)于浸提方法，可采用加嚴(yán)方式進(jìn)行浸提，如：循環(huán)、剪碎浸泡、超聲浸提等，如果通過(guò)加嚴(yán)方式溶出量超過(guò)毒理學(xué)評(píng)估閾值時(shí)，可考慮臨床實(shí)際使用情況。制備浸提液需要考慮典型樣品的選擇、浸提介質(zhì)、浸提比例、浸提時(shí)間、浸提溫度、浸提方式等。但所選浸提條件均不應(yīng)引起器械材料和目標(biāo)可瀝濾物發(fā)生化學(xué)變化。3.2 樣品選擇科學(xué)的采樣是獲得代表性樣品的關(guān)鍵，因產(chǎn)品的加工制造過(guò)程會(huì)對(duì)可瀝濾物殘留量產(chǎn)生影響，

9、所以試驗(yàn)樣品優(yōu)先選擇最終產(chǎn)品或取自最終產(chǎn)品中有代表性的樣品或經(jīng)論述的與最終產(chǎn)品相同的工藝過(guò)程制得的材料制備的適合浸提液。但某些情況下，因產(chǎn)品大型和/或復(fù)雜的器械使得無(wú)法在終產(chǎn)品上進(jìn)行浸提時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立完整的采樣操作規(guī)程，特別注意樣品的代表性。一般可選取有代表性的部分進(jìn)行浸提，然后推導(dǎo)出整個(gè)器械的結(jié)果，代表性的部分可采用如下方法：如果含有幾種不同的材料，選取的樣品中每一組分占樣品的比例宜與該組分占被測(cè)器械的比例一致，或選擇經(jīng)評(píng)價(jià)證明是器械上殘留含量最高的一個(gè)組成部分進(jìn)行試驗(yàn)，有時(shí)還可以通過(guò)相同原材料在相同工藝條件下加工成的最終品檢測(cè)等方式進(jìn)行，采樣方法應(yīng)經(jīng)過(guò)確認(rèn)并保留相關(guān)理由、記錄，必要時(shí)，提

10、供相關(guān)支持性資料。值得注意的是，某些產(chǎn)品需要在使用前現(xiàn)場(chǎng)制備，比如某些需要通過(guò)光固化、化學(xué)固化的口腔修復(fù)類(lèi)產(chǎn)品等，該類(lèi)產(chǎn)品的樣品應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的時(shí)間、濃度、劑量等要求制備后獲得試驗(yàn)樣本。3.3 浸提介質(zhì)浸提介質(zhì)的選擇需要考慮以下因素：（1）臨床接觸介質(zhì)性質(zhì)（酸性、堿性、極性、非極性等）。例如對(duì)于一次性使用輸注器具擬輸注的藥物是最佳的提取溶劑，但是輸注器具和擬輸注的藥品種類(lèi)繁多，且不同輸注器械在臨床的應(yīng)用情況有很大的差異。因此對(duì)于無(wú)法按照臨床使用情況制備檢驗(yàn)液的樣品，或者藥品中某些成分對(duì)已知可瀝濾物分析存在干擾時(shí)，可以使用替代溶劑開(kāi)展研究。如對(duì)于聚氯乙烯輸注器具中增塑劑DEHP的

11、研究，可通過(guò)充分的論證或?qū)嶒?yàn)研究分析后一般情況下可采用乙醇/水（=0.9373g/ml 0.9378g/ml）進(jìn)行浸提研究。（2）已知物的溶解特性，結(jié)合臨床接觸介質(zhì)性質(zhì)，初步確定擬采用的替代溶劑。（3）根據(jù)已知物的毒理學(xué)推導(dǎo)TE值及浸提液體積，計(jì)算得到的浸提液中的允許濃度，確認(rèn)該已知物在初步確定的替代溶劑中的溶解度能夠滿(mǎn)足該允許濃度的要求。（4）替代溶劑的選擇，適用時(shí)可采用試驗(yàn)證明替代溶劑的提取能力應(yīng)高于實(shí)際臨床接觸介質(zhì)。如采用替代溶劑獲得的結(jié)果不能滿(mǎn)足毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估要求時(shí)，可采用經(jīng)論述的更加接近臨床實(shí)際的方式進(jìn)行評(píng)估。替代溶劑的選擇應(yīng)綜合考慮上述4個(gè)因素。對(duì)于無(wú)機(jī)物（金屬元素）可選擇水或弱酸

12、性介質(zhì)作為浸提液，但還要考慮實(shí)際使用環(huán)境，比如因酸性飲料等的使用，會(huì)使得口腔內(nèi)醫(yī)療器械常接觸較酸的液體環(huán)境，因此在進(jìn)行口腔產(chǎn)品的金屬離子釋放研究時(shí)，可采用較酸的浸提液，具體可參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及指南規(guī)定。除此之外還應(yīng)注意，在進(jìn)行溶劑選擇時(shí)，還應(yīng)避免所用溶劑是否會(huì)與要研究的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)使得檢測(cè)不出或低于其實(shí)際的量。比如，異氰酸酯是合成一系列性能優(yōu)良的聚氨酯材料的單體，但由于異氰酸酯類(lèi)單體易與水發(fā)生水解反應(yīng)生成胺類(lèi)物質(zhì)，因此當(dāng)對(duì)含聚氨酯材料產(chǎn)品中進(jìn)行異氰酸酯單體殘留研究時(shí)采用含水溶劑，如某些藥物的生理鹽水溶液、乙醇/水混合溶劑等，這種情況下獲得的結(jié)果一般是不被認(rèn)可的。3.4 浸提體積浸提體積的選擇首先應(yīng)

13、保證浸提液能夠完全浸沒(méi)浸提樣品，其次浸提液中可瀝濾物濃度能夠滿(mǎn)足檢測(cè)靈敏度要求，同時(shí)還應(yīng)避免因其濃度過(guò)大影響被浸提物質(zhì)的進(jìn)一步析出。如果供試品溶液中待測(cè)成分濃度超過(guò)線(xiàn)性范圍，一般需通過(guò)稀釋的方法降低待測(cè)成分濃度后再行測(cè)定。3.5 浸提溫度對(duì)于浸提溫度，首先應(yīng)考慮器械臨床實(shí)際的使用溫度，如選擇提高溫度進(jìn)行加速浸提、加嚴(yán)浸提或極限浸提時(shí)應(yīng)注意，浸提溫度不應(yīng)引起器械材料和目標(biāo)可瀝濾物發(fā)生化學(xué)變化。3.6 浸提時(shí)間對(duì)于浸提時(shí)間，應(yīng)按照器械作用于患者的性質(zhì)和接觸時(shí)間來(lái)確定并盡可能模擬產(chǎn)品臨床實(shí)際，特別是臨床最大可能接觸時(shí)間。3.7 其他因素除上述條件外，還應(yīng)考慮是否需要采用動(dòng)態(tài)模擬、浸提液的循環(huán)速度等因

14、素，無(wú)論采取何種浸提條件，均需證明器械所選用的浸提條件代表產(chǎn)品在預(yù)期使用中帶給患者的最大風(fēng)險(xiǎn)。4.分析測(cè)試方法對(duì)于某些已經(jīng)建立起相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的研究物質(zhì)，優(yōu)先選用標(biāo)準(zhǔn)方法，如國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布的方法，或由知名技術(shù)組織或有關(guān)科技文獻(xiàn)或期刊中公布的方法，在使用有關(guān)科技文獻(xiàn)或期刊中公布的方法之前，應(yīng)參照本指南中方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，以確保方法的適用性。如果不能確定方法的適用性，應(yīng)開(kāi)發(fā)合適的新方法。對(duì)于無(wú)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的可瀝濾物，企業(yè)需開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證及確認(rèn)工作。開(kāi)發(fā)新的可瀝濾物檢測(cè)方法應(yīng)根據(jù)擬研究物質(zhì)的理化性質(zhì)（包括極性、穩(wěn)定性、溶解特性、環(huán)境敏感性等）、浸提選用溶劑

15、、法規(guī)或毒理學(xué)評(píng)估所需的精度等合理選擇檢測(cè)儀器及檢測(cè)方法，同時(shí)，應(yīng)進(jìn)行必要的方法學(xué)驗(yàn)證以保證方法的可靠性滿(mǎn)足安全性評(píng)價(jià)要求。對(duì)于無(wú)機(jī)物（元素）檢測(cè)方法有：電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-OES），電感耦合等離子體-質(zhì)譜法（ICP-MS），原子吸收分光光度法（AAS）、離子色譜（IC）等；對(duì)于有機(jī)物的主要檢測(cè)方法有：高效液相色譜/質(zhì)譜（HPLC/MS）、離子色譜法/質(zhì)譜（IC/MS）、氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）、傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）等。對(duì)于浸提液中可瀝濾含量較低的微量或痕量分析，如分析方法足夠靈敏，可采用浸提液直接進(jìn)行分析測(cè)定，無(wú)需富集處理；如直接測(cè)定提取液或模擬提取液，分

16、析方法的靈敏度達(dá)不到檢測(cè)要求時(shí)，常用的檢測(cè)樣本處理方法有：氮吹濃縮（一般適用于有機(jī)溶劑），需要注意的是氮吹的氣流速度和溫度；減壓濃縮富集：采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的方法制備檢測(cè)樣本，但需注意防止溫度過(guò)高影響樣本中待測(cè)物的穩(wěn)定性，避免樣本在富集處理過(guò)程中待測(cè)物進(jìn)一步降解的情況發(fā)生，同時(shí)需考慮待測(cè)物的揮發(fā)性對(duì)測(cè)定準(zhǔn)確性的影響；液相/固相萃取：對(duì)提取液或模擬提取液進(jìn)行液相/固相萃??；但需注意液相萃取溶劑和固相填料及洗脫溶劑的選擇，建議采用加內(nèi)標(biāo)的方法，確保待測(cè)物的有效富集。衍生化：為提高待測(cè)物的可測(cè)性，可選擇適宜的衍生化試劑對(duì)待測(cè)物進(jìn)行衍生化處理。如果采用新開(kāi)發(fā)方法進(jìn)行測(cè)定，需要按照以下項(xiàng)目開(kāi)展方法學(xué)驗(yàn)

17、證，如果修改采用現(xiàn)有文獻(xiàn)方法，則需要根據(jù)修改內(nèi)容，參照選擇以下項(xiàng)目進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并給與說(shuō)明。研究報(bào)告中除包含所采用的詳細(xì)的測(cè)試方法和步驟外，還應(yīng)明確使用的儀器信息及儀器設(shè)置參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)φ掌沸畔ⅰ?.方法學(xué)驗(yàn)證資料定量分析應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，驗(yàn)證的目的是證明采用的方法滿(mǎn)足于檢測(cè)的基本要求，藥典（如中國(guó)藥典、美國(guó)藥典）和人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）指南中均給出了特定定量分析要驗(yàn)證的內(nèi)容，一般包括方法的準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性、線(xiàn)性、靈敏度（檢出限和定量限）等。 需要說(shuō)明的是，在方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中，需要考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，基質(zhì)效應(yīng)指的是在對(duì)分析物的濃度或質(zhì)量測(cè)定過(guò)程中，來(lái)自樣品中其

18、他化合物的一種或幾種綜合的影響。為了測(cè)定可瀝濾物含量時(shí)無(wú)其他成分的存在而對(duì)擬研究物質(zhì)造成干擾。5.1專(zhuān)屬性專(zhuān)屬性是指在一些可能存在的組分，如其它可瀝濾物、降解物、基質(zhì)等存在時(shí)，對(duì)被分析物準(zhǔn)確可靠測(cè)定的能力，是評(píng)價(jià)方法能否正確鑒定、檢測(cè)出被測(cè)物的一種方法。宜采用適宜的方法對(duì)專(zhuān)屬性進(jìn)行驗(yàn)證并排除各種稀釋劑、降解產(chǎn)物等的影響，如色譜方法中，應(yīng)用典型的色譜圖來(lái)證明專(zhuān)屬性。5.2 線(xiàn)性線(xiàn)性是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值與樣品中被測(cè)物濃度（量）成比例關(guān)系的程度，是定量測(cè)量的基礎(chǔ)。線(xiàn)性關(guān)系應(yīng)以信號(hào)對(duì)被分析物的濃度或含量做圖，根據(jù)圖形是否線(xiàn)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果有線(xiàn)性關(guān)系，可用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法估算試驗(yàn)結(jié)果，如最小二乘

19、法。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算，或者采用描述濃度或含量響應(yīng)關(guān)系的非線(xiàn)性模型，并說(shuō)明依據(jù)。為建立線(xiàn)性，可用同一對(duì)照品貯備液經(jīng)精確稀釋?zhuān)蚍謩e精密稱(chēng)取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，建議至少制備5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，同時(shí)應(yīng)給出回歸方程和相關(guān)系數(shù)（一般不小于0.99，在復(fù)雜基質(zhì)或痕量分析時(shí)，接受范圍可適當(dāng)放寬），若用其他方法則應(yīng)證明其合理性。需要說(shuō)明的是，建立方法過(guò)程中并不是線(xiàn)性范圍越寬越好，實(shí)際上過(guò)寬的線(xiàn)性范圍會(huì)讓操作時(shí)不方便，且增加了測(cè)量誤差的可能，可根據(jù)目標(biāo)物濃度確定合適的工作曲線(xiàn)范圍。5.3范圍范圍是指分析方法能達(dá)到一定的精密度、準(zhǔn)確度和線(xiàn)性要求時(shí)的高低

20、濃度或量的區(qū)間。特定的范圍一般是從線(xiàn)性研究中得到的，它依賴(lài)于分析方法應(yīng)用目的。選擇的方法應(yīng)保證實(shí)際樣本中待測(cè)可瀝濾物濃度在其線(xiàn)性范圍內(nèi)，當(dāng)器械中可瀝濾物大于定量限時(shí)，另一個(gè)考慮因素是該可瀝濾物毒理學(xué)評(píng)估數(shù)值。結(jié)合浸提液制備時(shí)的浸提比例、是否進(jìn)行富集等因素，確認(rèn)由毒理學(xué)評(píng)估數(shù)值轉(zhuǎn)化的溶液濃度是否在所設(shè)定的線(xiàn)性范圍內(nèi)。尤其是當(dāng)器械適用于不同的人群，如兒童、嬰兒甚至早產(chǎn)兒等人群，其線(xiàn)性最低點(diǎn)設(shè)置更應(yīng)關(guān)注是否能夠滿(mǎn)足該類(lèi)人群的毒理學(xué)評(píng)估結(jié)果的要求。如果供試品溶液中待測(cè)成分濃度超過(guò)線(xiàn)性范圍，一般需通過(guò)稀釋的方法降低待測(cè)成分濃度后測(cè)定。5.4檢測(cè)限（LOD）檢測(cè)限是指樣品中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量，方法的

21、檢出限必須滿(mǎn)足待測(cè)物的毒理學(xué)評(píng)估數(shù)值要求，即可瀝濾物的限度濃度應(yīng)大于檢測(cè)限。應(yīng)采用適宜的方法考察檢測(cè)限，常用的評(píng)估方法有以下兩種，除了下面所列的方法外其他經(jīng)驗(yàn)證的方法也可被接受。（1）信噪比法該方法僅適用于出現(xiàn)基線(xiàn)噪音的分析方法。信噪比的測(cè)定是通過(guò)比較含已知低濃度被分析物的樣品與空白樣品的測(cè)試信號(hào)，確定被分析物可被確切地檢測(cè)的最小濃度，當(dāng)信噪比在3:1或2:1時(shí)的檢測(cè)限度通常被接受。（2）根據(jù)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差和斜率檢測(cè)限度（DL）表示為：DL=3.3/S：響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差S：校正曲線(xiàn)的斜率斜率 S 可從被分析物的校正曲線(xiàn)來(lái)估算，的值可由多種途徑估算。如通過(guò)對(duì)空白樣品多次分析，然后計(jì)算其響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)

22、差。5.5定量限（LOQ）定量限是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度的要求。常用的評(píng)估方法有以下兩種，除了下面所列的方法外其他經(jīng)驗(yàn)證的方法也可被接受。（1）信噪比法該方法儀適用于出現(xiàn)基線(xiàn)噪音的分析方法。信噪比的測(cè)定是通過(guò)比較含有已知低濃度被分析物的樣品與空白樣品的測(cè)定信號(hào)，來(lái)建立被測(cè)物能夠準(zhǔn)確定量的最小濃度，典型信噪比為10:1。（2）根據(jù)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差和斜率檢測(cè)限度（DL）表示為：DL=10/S：響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差S：校正曲線(xiàn)的斜率斜率 S 可從被分析物的校正曲線(xiàn)來(lái)估算，的值可由多種途徑估算。如通過(guò)對(duì)空白樣品多次分析，然后計(jì)算其響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)差。通常情況下，只有當(dāng)目

23、標(biāo)分析物的含量在接近于“零”的時(shí)候才需要確定方法的檢出限或定量限。當(dāng)分析物濃度遠(yuǎn)大于LOQ時(shí)，沒(méi)有必要評(píng)估方法的LOD和LOQ。但是對(duì)于那些濃度接近于LOD與LOQ的痕量和超痕量檢測(cè)，并且報(bào)告為“未檢出”時(shí)，或需要利用LOD與LOQ進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或法規(guī)決策時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定LOD與LOQ。5.6精密度精密度是指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品檢驗(yàn)液，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，考察方法一般可進(jìn)行重復(fù)性研究。重復(fù)性指由同一個(gè)分析人員在盡可能相同的條件下對(duì)配制的不同份相同濃度供試品溶液進(jìn)行測(cè)試。關(guān)于可瀝濾物測(cè)定一般應(yīng)采用重復(fù)性對(duì)精密度進(jìn)行考察，評(píng)

24、價(jià)方法如下：在方法的規(guī)定線(xiàn)性范圍內(nèi)至少測(cè)定9 次，如分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)高、中、低3 種濃度的供試品溶液重復(fù)測(cè)定3 次。不同含量的可瀝濾物精密度考察可接受范圍可參照下表進(jìn)行考察，在復(fù)雜基質(zhì)或更低濃度分析時(shí)，接受范圍可適當(dāng)放寬。表1精密度考察可接受范圍被測(cè)組分含量重復(fù)性（RSD%）10 g/L151 mg/L810 mg/L6100 mg/L41000 mg/L35.7準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度是指采用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，通常用回收率評(píng)價(jià)。驗(yàn)證時(shí)一般要求對(duì)不同濃度樣品進(jìn)行平行測(cè)定，計(jì)算平均回收率，用于回收率試驗(yàn)的樣品以不含待測(cè)成分的空白樣品為最好?？梢圆捎眉訕?biāo)回收率試驗(yàn)，按樣品的處理步驟分析

25、，得到的結(jié)果與理論值的比值。若采用加標(biāo)回收率試驗(yàn)，加標(biāo)樣品的濃度應(yīng)覆蓋線(xiàn)性范圍的高、中、低濃度，并分別計(jì)算平均回收率。除平均回收率外，還應(yīng)考察不同測(cè)試樣本數(shù)據(jù)的離散程度，一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。一般來(lái)說(shuō)，不同的分析水平的可接受的回收率及RSD范圍也不同。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法回收率偏差范圍評(píng)價(jià)可參見(jiàn)表2，在復(fù)雜基質(zhì)或更低濃度分析時(shí)，接受范圍可適當(dāng)放寬。表2 方法回收率偏差范圍被測(cè)組分含量回收率（%）10 g/L701251 mg/L7512010 mg/L80115100 mg/L851101000 mg/L901086.數(shù)據(jù)要求前述所有取樣、儀器使用、標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)照品信息、色譜柱、儀器的校準(zhǔn)等

26、記錄均應(yīng)被記錄，且應(yīng)通過(guò)各種方式確保其真實(shí)、準(zhǔn)確、完整、可追溯，以確保能夠完整重現(xiàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生的步驟和順序，防止漏記和隨意涂改、偽造或編造數(shù)據(jù)。如適用，帶有審計(jì)追蹤功能的檢驗(yàn)設(shè)備、計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)等記錄數(shù)據(jù)，應(yīng)保證其追蹤功能處于有效工作狀態(tài)，如現(xiàn)有設(shè)備不具備審計(jì)追蹤功能，應(yīng)通過(guò)檢驗(yàn)日志、變更控制、記錄版本控制或原始電子記錄輔以紙質(zhì)記錄來(lái)滿(mǎn)足數(shù)據(jù)可追溯性的要求。同時(shí)，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)能歸屬到人，且應(yīng)保證具有唯一性。7.報(bào)告內(nèi)容應(yīng)報(bào)告上述試驗(yàn)過(guò)程（包括所用設(shè)備及參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品及其他試劑來(lái)源，樣品處理過(guò)程、浸提介質(zhì)、浸提體積等浸提條件確定依據(jù)）、結(jié)果、結(jié)論及典型性圖譜。8.方法學(xué)確認(rèn)建立合適的分析方法并對(duì)方法進(jìn)行

27、驗(yàn)證后，新的實(shí)驗(yàn)室采用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)前還應(yīng)進(jìn)行方法確認(rèn)。方法確認(rèn)是證明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法適用于本次檢驗(yàn)的過(guò)程及被測(cè)樣品,同時(shí)還應(yīng)證明方法使用人員有能力成功地操作國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布的方法或者已建立并驗(yàn)證過(guò)的方法。確認(rèn)內(nèi)容可根據(jù)方法本身的特點(diǎn)和檢驗(yàn)人員對(duì)方法操作的熟練程度由檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室自己確定。但USP在其附錄1226“藥典分析方法確認(rèn)( verification of compendial methods) ”中對(duì)分析方法確認(rèn)需要確認(rèn)哪些內(nèi)容給出了指導(dǎo)意見(jiàn)，此處不再贅述。9.方法再驗(yàn)證在某些情況下, 如原材料的合成工藝改變、分析方法發(fā)生改變等，企業(yè)應(yīng)進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并根據(jù)評(píng)估結(jié)果考慮

28、是否需要對(duì)分析方法再次進(jìn)行全面的或部分的驗(yàn)證,以確保分析方法可行。當(dāng)原材料的合成工藝發(fā)生改變時(shí),可能引入新的物質(zhì),則原可瀝濾物的檢查方法和含量測(cè)定方法的專(zhuān)屬性就需要重新進(jìn)行驗(yàn)證,以證明新引入的物質(zhì)對(duì)原有可瀝濾物的含量測(cè)定無(wú)干擾。當(dāng)原材料的來(lái)源發(fā)生變化時(shí),可能會(huì)影響可瀝濾物含量測(cè)定的專(zhuān)屬性和準(zhǔn)確度,因此,需要對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行再驗(yàn)證。當(dāng)某一項(xiàng)目的分析方法發(fā)生改變時(shí), 如采用高效液相色譜法測(cè)定含量的檢測(cè)波長(zhǎng)發(fā)生改變,則要重新進(jìn)行檢測(cè)限、專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線(xiàn)性等內(nèi)容的驗(yàn)證, 同時(shí)還應(yīng)進(jìn)行方法改變前后所得結(jié)果的對(duì)比研究, 證明變更后的方法合理、可行性。參考文獻(xiàn)：1. GB/T27417-2017

29、 合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南2. ICH Validation of Analytical Procedures Text and Methodology Q2（R1）3. 中華人民共和國(guó)藥典 2015年版四部 9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則4. ISO10993.1-2018 Biological evaluation of medical devices Part 1: Evaluation and testing within a risk management process5. GB/T16886.12-2017 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備與參照材料

30、6. GB/T16886.18-2011醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第18部分：材料化學(xué)表征7. GB/T16886.17-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第17部分：可瀝濾物允許限量的建立8. USP-35: verification of compendial methods（part 1226）9. 許明哲，黃寶斌，楊青云等. 分析方法確認(rèn)內(nèi)容介紹J. 藥物分析雜志.2015,35(1):183-18910. ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratoriesS.

31、2017 確認(rèn)該可瀝濾物是否為添加劑否浸提研究否是是該添加劑無(wú)需進(jìn)一步評(píng)估該添加劑添加總量是否超過(guò)其安全限量1.查閱：可瀝濾物理化性質(zhì)；產(chǎn)品預(yù)期接觸方式2.選擇合適的樣品3.確定合理的浸提方式4.選擇合適的浸提溶劑5.其他浸提條件的選擇：時(shí)間、溫度、液體體積、是否需要?jiǎng)討B(tài)浸提等是否有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定最大溶出量是否建立合理的方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證溶出量測(cè)定根據(jù)其毒理學(xué)可接受限度，形成完整的毒理學(xué)評(píng)價(jià)報(bào)告溶出量附錄1 案例：一次性使用聚氯乙烯輸血器中可瀝濾物鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）增塑劑的研究一、概述DEHP，是Di-(2-ethylhexyl) phthalate的縮寫(xiě)，

32、全名為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯。分子式：C24H38O4結(jié)構(gòu)式： 分子量：390.6CAS編號(hào)：117- 81-7物理狀態(tài)：常溫下為無(wú)色無(wú)臭液體。不溶于水，溶于乙醚、乙醇、礦物油等。熔點(diǎn)：-50 或-55沸點(diǎn):在5mm Hg時(shí)大約230 (BASF1994b;Clayoton 1981,in HSDB 2005)在1013hP時(shí)385蒸汽壓：0.000034 Pa在20水溶性：0.003mg/L在20醇溶性：>100mg/ml( 95%乙醇， 22)密度：0.986g/cm³at20( IARC1982，in HSDB 2005)由于聚氯乙烯（PVC） 材料本身質(zhì)地較硬且

33、加工難度較大，為了使PVC制品柔軟往往加入大量的增塑劑。在常用的增塑劑中，DEHP由于其與優(yōu)異的增塑性能、易獲得性以及和PVC 的良好相容性，使得其在成為輸血器中最常見(jiàn)的增塑劑。DEHP一般先與PVC樹(shù)脂以及其他添加劑通過(guò)共混等方式制備含有DEHP的PVC粒料，在此共混過(guò)程中，其不以共價(jià)鍵結(jié)合而是物理結(jié)合于PVC 分子上。一般來(lái)說(shuō)，在軟質(zhì)PVC粒料中DEHP的質(zhì)量百分比可高達(dá)30%50%。 注：材料組成及牌號(hào)等信息可能涉及企業(yè)專(zhuān)利等信息，此處省略。但在正式的遞交文件中應(yīng)予以明確（如適用）。二、浸提液制備的論述2.1總則由于輸血器中的DEHP為脂溶性物質(zhì)，易溶于乙醇，其輸血器中含量可高達(dá)21.6

34、0%-33.37%。一次性使用輸血器在臨床上為只接觸血液的器械，對(duì)于材料中可瀝濾物DEHP的研究，原則上應(yīng)選擇血液作為浸提介質(zhì)，采用臨床相同使用條件進(jìn)行滴注。由于難以收集足夠的血液或招募足夠的志愿者用于研究，因此使用血液或血液成分作為浸提介質(zhì)來(lái)評(píng)估器械釋放的DEHP不是很實(shí)際。因而需選擇一個(gè)合適的替代溶劑，本研究擬選擇密度為0.9373至0.9378g/ml的乙醇/水混合溶液作為替代浸提溶劑，為了驗(yàn)證乙醇/水混合溶液的浸提能力嚴(yán)于血液，進(jìn)行了以下試驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)一次性使用塑料血袋的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 3826-1）中采用密度為0.9373-0.9378g/ml的乙醇水混合物作為血液替代溶劑測(cè)定血袋

35、中DEHP的溶出量。2.2浸提能力的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證乙醇/水混合溶液的浸提能力嚴(yán)于血液，收集來(lái)自三名健康志愿者的血液樣品，用EDTA鹽抗凝并儲(chǔ)存在玻璃容器中。這些血樣作為第一組用于模擬實(shí)際使用情況。第二組采用密度（）為0.9378g/ml（20）的水/乙醇混合物在相同條件下浸提DEHP（相同的提取介質(zhì)體積，相同的滴落速率和相同的滴度、相同環(huán)境溫度）。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1血液和水/乙醇混合物提取能力比較血液 (DEHP 溶出量, mg)乙醇/水 (DEHP 溶出量, mg)1a2a3a0.1100.0680.0732.84a: 數(shù)字1,2和3對(duì)應(yīng)于來(lái)自三名志愿者的全血樣品。由上述結(jié)果可以看出乙醇/

36、水混合溶液的提取能力遠(yuǎn)高于血液。因而，對(duì)該產(chǎn)品選擇乙醇/水混合溶液作為浸提溶液。解讀：應(yīng)結(jié)合器械臨床使用情況選擇合適的浸提方式，若選擇使用替代溶劑進(jìn)行浸提，適用時(shí)，應(yīng)結(jié)合可瀝濾物的性質(zhì)通過(guò)論述或試驗(yàn)方式證明，替代溶劑的浸提能力嚴(yán)于臨床接觸的介質(zhì)。三、分析方法3.1 儀器及參數(shù)：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫7890 GC和配備電子電離（EI）源和四極桿分析儀的安捷倫 5975C質(zhì)譜儀。色譜柱:HP-5MS（30m×0.25mm×0.25m，Agilent JW GC柱，USA）；掃描方式：溶劑延遲時(shí)間3.5min，全掃模式45-450amu（定性）和選擇離子掃描m / z =

37、149（定量）；分流模式：分流比5：1；流速:1.5ml / min；進(jìn)樣量：1樣；柱溫箱條件：起始溫度150，保持0.5分鐘，然后將以20/分鐘升至280，保持7分鐘。3.2方法學(xué)驗(yàn)證3.2.1專(zhuān)屬性分別取DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙醇/水空白對(duì)照和正己烷溶劑進(jìn)行分析。色譜圖如下：圖1在SIM模式下篩選的正己烷試劑的色譜圖圖2 SIM模式下DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液（10g/ ml）的色譜圖圖3 SIM模式下輸血器樣品乙醇/水浸提溶液的色譜圖圖4 SIM模式下輸血器樣品血液浸提溶液的色譜圖由于各種鄰苯二甲酸酯的廣泛使用，使得其在環(huán)境中廣泛分布，如空氣、水、土壤、灰塵、沉積物、海產(chǎn)品和人體組織。在測(cè)試過(guò)程中，乙

38、醇/水的空白對(duì)照有DEHP的響應(yīng)，但是因其響應(yīng)值較低不會(huì)對(duì)結(jié)果測(cè)定造成干擾。解讀：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中所用到的溶劑體系及浸提液基質(zhì)均未對(duì)DEHP的測(cè)定產(chǎn)生影響。3.2.2線(xiàn)性及范圍以正己烷作為溶劑時(shí)，DEHP的線(xiàn)性范圍為0.1-200g/ ml。 相關(guān)系數(shù)大于0.999。解讀：DEHP血液接觸途徑TI值為0.6mg/kg/day，由于輸血器可用于嬰兒，按臨床最嚴(yán)格應(yīng)用人群計(jì)算，根據(jù)GB/T 16886.17，取嬰兒的默認(rèn)體重為3.5kg, 則嬰兒的TE=2.1mg/day。嬰兒一天最大輸血量按臨床最差情況350ml計(jì)，則溶液中最低濃度為6g/ ml。線(xiàn)性最低點(diǎn)0.1 g/ mL可以滿(mǎn)足最具挑戰(zhàn)性人群的評(píng)

39、價(jià)要求。3.2.3重復(fù)性為了驗(yàn)證重復(fù)性，使用具有四種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)表示0.1-200g/ mL的線(xiàn)性范圍內(nèi)的高，中，低和極低濃度，并且在每種濃度重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果濃度 (g/ml)乙醇/水（n=3）RSD（%） 血液（n=3）RSD（%） 極低 (0.1)2.333.88低 (1.0)4.516.71中 (10)8.800.57中（100）7.162.24高 (180,200a)5.027.86a: 乙醇/水和血液樣本中DEHP加入量分別為180g/ ml和200g/ ml解讀：覆蓋線(xiàn)性范圍內(nèi)高、中、低三種濃度。3.2.4回收率此外，采用回收率來(lái)評(píng)估方法的準(zhǔn)確。回收率測(cè)定為測(cè)定5個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度水平重復(fù)3次， 結(jié)果見(jiàn)表3。表3 回收率驗(yàn)證結(jié)果加標(biāo)濃度 g/mL回收率乙醇/水 (n = 3)血液 (n = 3)回收率 (%)RSD (%)回收率 (%)RSD (%