基因工程-基因工程載體

1、2022-4-2第三章 基因工程的載體n載體：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的工具n用于基因工程的載體用于基因工程的載體細(xì)菌質(zhì)粒載體噬菌體衍生載體Cosmid載體Phagemid載體酵母質(zhì)粒載體真核病毒載體Bacmid載體2022-4-2發(fā)展概況發(fā)展概況 1.1. 第一階段（第一階段（19771977年前）：年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.

2、 第二階段：第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUCpUC系列載體。系列載體。 3.3.第三階段：第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列載體，含系列載體，含T3T3，T7T7，sp6sp6啟動(dòng)子載體，表啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。達(dá)型載體及各種探針型載體。 2022-4-2第三章 基因工程的載體n作為基因工程載體的基本功能基本功能1. 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2. 為外

3、源基因提供復(fù)制能力或整合能力3. 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件2022-4-2第三章 基因工程的載體n作為基因工程載體必須具備的基本條件基本條件1. 具有對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2. 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3. 長(zhǎng)度盡可能小，以提高其載裝能力4. 具有多種單一的酶切位點(diǎn)5. 具有合適的選擇性標(biāo)記2022-4-2遺傳標(biāo)記基因遺傳標(biāo)記基因 1. 1. 標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（載體或重組分子）分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主是否進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞 這種指示可以是選擇性的（這種指示可以是選擇性的（ApApr r ，

4、TcTcr r ，KanKanr r），也可以），也可以是非選擇性的（如是非選擇性的（如lacZlacZ） 2 2）指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入載體分子是否插入載體分子形成了重組子。形成了重組子。 * * 這種指示也可以是這種指示也可以是選擇性選擇性的（如的（如TcTcr r），也可以是），也可以是非選非選擇性擇性的（如的（如TcTcS S， lacZ, GUSlacZ, GUS），絕大多數(shù)為后者。），絕大多數(shù)為后者。 * * *有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。當(dāng)充任第一有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。當(dāng)充任第一作用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前作

5、用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前多采用非選擇性的多采用非選擇性的檢測(cè)性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作檢測(cè)性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（選擇性標(biāo)記基因（lacZlacZ，GUSGUS等）。等）。2022-4-22.2. 標(biāo)記基因的種類(lèi)標(biāo)記基因的種類(lèi) 1 1）抗性標(biāo)記基因抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金屬抗性基因重金屬抗性基因: Cu: C

6、ur r ，ZnZnr r ，Cd Cd r r c. c. 代謝抗性基因代謝抗性基因: TK: TK，抗除草劑基因，抗除草劑基因 2 2）營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶類(lèi)的基因，類(lèi)的基因， 這類(lèi)基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如這類(lèi)基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3 3）生化標(biāo)記基因生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZ,

7、 GUS, lacZ, GUS, CATCAT 4 4） 噬菌斑噬菌斑 2022-4-2 3.3. 使用標(biāo)記基因注意要點(diǎn)使用標(biāo)記基因注意要點(diǎn) 1 1）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞 2 2）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機(jī)制）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機(jī)制: Ap: Apr r 3 3）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍: : 基因啟動(dòng)子基因啟動(dòng)子, , 翻譯起翻譯起始序列始序列, , 密碼子偏愛(ài)性密碼子偏愛(ài)性 4 4）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對(duì)功能的影響）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對(duì)功能的影響: LacZ, GUS: LacZ, GUS 4.4. 常用的遺傳標(biāo)記基因常用的遺傳標(biāo)記基因 1) 1) 四環(huán)

8、素抗性基因四環(huán)素抗性基因（TcTcr r） Tetracycline Tetracycline 可結(jié)合在核糖體可結(jié)合在核糖體30s30s亞基中的一種亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過(guò)程。四環(huán)素抗性基因蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過(guò)程。四環(huán)素抗性基因編碼一種編碼一種399 AAs399 AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。2022-4-22) 2) 氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類(lèi)的活性?？梢种萍?xì)菌細(xì)胞膜上參

9、與細(xì)胞壁合成酶類(lèi)的活性。ApApr r抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺環(huán)的環(huán)的水解水解，使氨芐青霉素失活。，使氨芐青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） ChlorophenicolChlorophenicol可結(jié)合在核糖體可結(jié)合在核糖體50 S50 S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。成。CmCmr r基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；阴；?，導(dǎo)致乙?；?，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。4) 4) 卡那霉素

10、卡那霉素(Kan(Kanr r), ), 新霉素新霉素(Neo(Neor r) )和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r) )基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類(lèi)抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來(lái)自轉(zhuǎn)座子類(lèi)抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使這類(lèi)抗生素抗性基因均可使這類(lèi)抗生素磷酸化磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)。2022-4-2 5 5）半乳糖苷酶

11、基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZlacZ） 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因產(chǎn)物不具酶活，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：鏈和鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具半乳糖苷酶活性；只有半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補(bǔ)作互補(bǔ)作用用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。為分別由兩個(gè)基因編碼。為鏈編鏈編碼的基因稱之為

12、碼的基因稱之為lacZlacZ( (編碼編碼145 AAs)145 AAs)。這兩個(gè)基因（。這兩個(gè)基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作為標(biāo)記基因。）均可作為標(biāo)記基因。 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn)半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn): : a.a. 酶催化酶催化X-GalX-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀 b. lacZb. lacZ編碼編碼5-5-端可容許很大的變化而不影響酶活性端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZc. lacZ和和鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大2022-4-2 P LacZ LacZ 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 Lac

13、ZLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18 BamHI片段片段重組重組DNADNA分子分子 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落為重組白色菌落為重組子，子，蘭色菌落蘭色菌落為為原載體原載體利用利用LacZLacZ基因篩選重組子基因篩選重組子2022-4-2 6 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS） 該基因編碼一種可分解各種該基因編碼一種可分解各種-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lac

14、ZlacZ基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒(méi)有這種基因。分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒(méi)有這種基因。 7 7）熒光素酶基因熒光素酶基因 熒光素酶或由螢火蟲(chóng)產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)熒光素酶或由螢火蟲(chóng)產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入生熒光，若在反應(yīng)中加入CoACoA，可使靈敏度提高，可使靈敏度提高1010倍；或由發(fā)光細(xì)倍；或由發(fā)光細(xì)菌（菌（Photobacterium fischeriPhotobacterium fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-FMN-氧化氧化還原酶聯(lián)用，通過(guò)還原酶聯(lián)用

15、，通過(guò)NAD(P)HNAD(P)H的變化測(cè)定酶活的變化測(cè)定酶活。 8 8）發(fā)光蛋白質(zhì)基因發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。2022-4-2 分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類(lèi)分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類(lèi) 1. 1. 復(fù)制起點(diǎn)的種類(lèi)復(fù)制起點(diǎn)的種類(lèi) 1) 1) 核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn)核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn) a. a. 染色體復(fù)制起點(diǎn)染色體復(fù)制起點(diǎn)原核生物原核生物( (環(huán)狀環(huán)狀) )和真核生物和真核生物( (線狀線狀) )染色體染色體 b. b. 染色體外復(fù)制起點(diǎn)染色體外復(fù)制起點(diǎn) i. i. 質(zhì)粒

16、質(zhì)粒DNA,RNA,DNA,RNA,線狀線狀, ,環(huán)狀環(huán)狀, ,單鏈單鏈, ,雙鏈雙鏈 ii. ii. 病毒病毒同上同上, , 細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi)細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi) 2) 2) 核外復(fù)制起點(diǎn)核外復(fù)制起點(diǎn) a. a. 線粒體線粒體所有真核細(xì)胞所有真核細(xì)胞 b. b. 葉綠體葉綠體所有綠色植物細(xì)胞所有綠色植物細(xì)胞 原核與真核生物原核與真核生物兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒2022-4-2 3. 3. 按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體 1) 1) 質(zhì)粒復(fù)制型質(zhì)粒復(fù)制型復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自質(zhì)粒或線粒體和葉綠體復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體 2) 2) ARSARS復(fù)制型復(fù)制型A

17、RSARS（autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence)，或，或稱染色體復(fù)制型稱染色體復(fù)制型 3) 3) 病毒復(fù)制型病毒復(fù)制型復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自病毒，若為復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自病毒，若為RNARNA病毒，必須反轉(zhuǎn)病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為錄為cDNAcDNA。 4) 4) 混合復(fù)制型混合復(fù)制型 a.a. 同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合質(zhì)粒形式存在；質(zhì)粒或病毒質(zhì)粒形式存在；質(zhì)?；虿《拘问酱嬖谛问酱嬖?022-4-2 例：大腸桿菌（例：大腸桿菌（E.coliE.coli）的）的噬粒噬粒（phagemidphagemid）載體既含有來(lái)

18、自質(zhì)粒）載體既含有來(lái)自質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又含有來(lái)自噬菌體（如的復(fù)制起點(diǎn)，又含有來(lái)自噬菌體（如M13M13）的復(fù)制起點(diǎn)。在不）的復(fù)制起點(diǎn)。在不同條件下，它可以質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，從而同條件下，它可以質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，從而獲得質(zhì)粒獲得質(zhì)粒ds- DNAds- DNA或噬菌體或噬菌體ss ss DNADNA又如：釀酒酵母（又如：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）的某些載體既含有）的某些載體既含有質(zhì)粒（質(zhì)粒（22）復(fù)制起點(diǎn)，又含有）復(fù)制起點(diǎn)，又含有ARSARS片段片段 b.b. 不同生物復(fù)制起點(diǎn)混合不同生

19、物復(fù)制起點(diǎn)混合穿梭載體穿梭載體（shuttle vectorshuttle vector）兩種兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)?；虿《拘问酱嬖谏镏幸再|(zhì)?；虿《拘问酱嬖?* * 穿梭載體范圍穿梭載體范圍：細(xì)菌：細(xì)菌細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌酵母菌，酵母菌， 細(xì)菌細(xì)菌真菌，細(xì)菌真菌，細(xì)菌動(dòng)物動(dòng)物2022-4-2Plac Plac LacZorioriF1(-)Ampr T 3 T 7 pBS-SK(-)pBS-KS(-)pBS(3.0 kb)pBSpBS載體的結(jié)構(gòu)載體的結(jié)構(gòu)2022

20、-4-2YRp12 (6.9 kb)oriTcrE EP B 大腸桿菌大腸桿菌- -釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體2022-4-2分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)種類(lèi)、標(biāo)記基因與拷貝分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)種類(lèi)、標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系數(shù)的關(guān)系 1. 1. 復(fù)制起點(diǎn)種類(lèi)與拷貝數(shù)間的關(guān)系復(fù)制起點(diǎn)種類(lèi)與拷貝數(shù)間的關(guān)系 1) 1) 質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型：低拷貝（嚴(yán)緊型，質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型：低拷貝（嚴(yán)緊型，1-2 copies1-2 copies，受宿主染色，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型，體基因控制）；高拷貝（松弛型，20 copies20 copies，受宿主染色體控，受宿主染色體控制較弱）制較弱） 2)

21、ARS 2) ARS型載體：拷貝數(shù)較高（約型載體：拷貝數(shù)較高（約20 copies20 copies） 3) 3) 病毒型復(fù)制起點(diǎn)：高拷貝病毒型復(fù)制起點(diǎn)：高拷貝 2.2. 標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系 若標(biāo)記基因表達(dá)效率高，宿主細(xì)胞可能不大量產(chǎn)生標(biāo)記基若標(biāo)記基因表達(dá)效率高，宿主細(xì)胞可能不大量產(chǎn)生標(biāo)記基因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數(shù)會(huì)降低。對(duì)于不同標(biāo)記因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數(shù)會(huì)降低。對(duì)于不同標(biāo)記基因，可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù)?；?，可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù)。 如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物濃度。如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物濃度。 對(duì)于營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基

22、因，可降低該基因的表達(dá)效率或更換其他低對(duì)于營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，可降低該基因的表達(dá)效率或更換其他低效率的標(biāo)記基因效率的標(biāo)記基因2022-4-2分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性 1. 1. 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素影響轉(zhuǎn)化頻率的因素 1) 1) 復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn) 2) 2) 標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因 2.2. 影響穩(wěn)定性的因素影響穩(wěn)定性的因素 1)1) 復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差差 2)2) 選擇壓力選擇壓力

23、 3)3) 載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài)載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài)自主復(fù)制型和整合型自主復(fù)制型和整合型 宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)1、定義 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征n自主復(fù)制性自主復(fù)制性n質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）以及一個(gè)控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨(dú)立

24、于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制 2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征n不相容性不相容性n利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被導(dǎo)入同一細(xì)胞中，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中，就會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng) ，幾種質(zhì)粒中只能有一種長(zhǎng)期穩(wěn)定地留在細(xì)胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。 2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征n可擴(kuò)增性可擴(kuò)增性npMB1或ColEI類(lèi)質(zhì)粒在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或Co

25、lEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增氯霉素?cái)U(kuò)增。 2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征n攜帶遺傳標(biāo)記攜帶遺傳標(biāo)記 n在實(shí)驗(yàn)室中將質(zhì)粒通過(guò)物理方法導(dǎo)入受體細(xì)胞，但是即使在最佳條件下，受體細(xì)胞中也只有少數(shù)細(xì)胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進(jìn)入了質(zhì)粒的受體細(xì)胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標(biāo)記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標(biāo)記。 2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)3、分類(lèi) 接合型和非接合型 嚴(yán)緊性和松弛型在基因工

26、程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建1、理想質(zhì)粒載體所具備的條件n質(zhì)粒較小n質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記n帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn)n應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建2、質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的n 天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇 （2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組 （3）縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度，切去不必要

27、的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量增加裝載量 （4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件加裝特殊的基因元件方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。2022-4-2n多拷貝質(zhì)粒多拷貝質(zhì)粒 經(jīng)過(guò)人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)粒拷貝數(shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。 n 測(cè)序質(zhì)粒測(cè)序質(zhì)粒 拷貝數(shù)高，加裝測(cè)定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆 n 整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上 n穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒 含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，

28、能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制 n表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá) n探針質(zhì)粒探針質(zhì)粒 篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，他通常裝有一個(gè)可以定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)基因、終止子等。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為：2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322n大?。?.3 kbn選擇標(biāo)記：Apr Tcrn單一酶切位點(diǎn)：EcoR Hind BamH PstI Sal 等2022-4-22022-4-22022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒

29、載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322n用于組建pBR322的三個(gè)親本質(zhì)粒的特征：npSE2124：Apr基因npMB8 :Col EI松弛型復(fù)制子npSC101:Tcr基因2022-4-22022-4-22022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒n多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括pUC8/9 pUC18/19npUC的親本質(zhì)粒是pBR322,包括如下四個(gè)部分：n來(lái)自 pBR322 的復(fù)制起點(diǎn)（ori）n來(lái)自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變）nE.coli的lacZ基因及其啟

30、動(dòng)子組成lacZ 基因nlacZ內(nèi)部人工組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）它含有如下單一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。2022-4-22022-4-22022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒npUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)n更小的相對(duì)分子量和更高的拷貝數(shù)n可用組織化學(xué)法檢測(cè)重組體n具有多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段是基因工程中目前最常用的是基因工程中目前最常用的E.coli克隆載體克隆載體2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmi

31、d）的制備n堿裂解法 n（1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中 n（2）加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 n（3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 n（4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì) n（5）離心取上清液，用苯酚氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶 n（6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 1.（7）無(wú)DNase的RNase處理殘余RNA2022-4-2第一節(jié) E.coli 質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備n沸水浴法 （1）將菌體懸浮在含有EDTA和Triton X-100的緩沖液中 （2）加溶菌酶破細(xì)胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒 （4）離心，

32、用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物 （5）乙醇異丙醇沉淀2022-4-2一、一、Ti質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 1. 根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)與與Ti質(zhì)粒質(zhì)粒 G-菌，可侵入菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crown gall tumor)。冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征：冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征： i. 不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng)不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng) ii.ii.合成腫瘤特有的化合物合成腫瘤特有的化合物冠癭堿冠癭堿(opine)(opine)，能專一，能專一 的為根癌農(nóng)桿菌所利的為根癌農(nóng)桿菌所利用用. .

33、這兩個(gè)特征由這兩個(gè)特征由TiTi質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。 三、其他質(zhì)粒載體2022-4-21) Ti 質(zhì)粒類(lèi)型質(zhì)粒類(lèi)型（由（由Ti 質(zhì)粒所產(chǎn)生的冠癭堿種類(lèi)而定）質(zhì)粒所產(chǎn)生的冠癭堿種類(lèi)而定） i. 鱆魚(yú)堿類(lèi)鱆魚(yú)堿類(lèi)(octopine) ii. 胭脂堿類(lèi)胭脂堿類(lèi)(nopaline) iii.農(nóng)堿類(lèi)農(nóng)堿類(lèi)(agropine)2) Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) i. 環(huán)狀環(huán)狀ds-DNA,160-250kb，具六個(gè)功能區(qū)，具六個(gè)功能區(qū) i) 致瘤區(qū)：合成植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素致瘤區(qū)：合成植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素 ii) 冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭

34、堿合成冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成 iii) 冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解 iv) Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移：參與不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移 v) 毒（性）區(qū)：參與毒（性）區(qū)：參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體 vi) DNA復(fù)制區(qū)：參與復(fù)制區(qū)：參與Ti 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)制復(fù)制2022-4-2Ti 質(zhì)粒 (160-250 kb)T-DNA Vir Rep tra tra分裂素Opine合成分解 25 bp重復(fù)區(qū)25 bp重復(fù)區(qū)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 2022-4-2 ii. T-DNA T-DNA包括植物

35、激素冠癭堿合成區(qū)基因及兩側(cè)相同的包括植物激素冠癭堿合成區(qū)基因及兩側(cè)相同的25 bp重復(fù)重復(fù)序列，序列，T-DNA整合不具特異性，右側(cè)整合不具特異性，右側(cè)25 bp重復(fù)序列對(duì)重復(fù)序列對(duì)T-DNA的的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。 不同不同Ti 質(zhì)粒中的質(zhì)粒中的T-DNA結(jié)構(gòu)是不相同的，其中結(jié)構(gòu)是不相同的，其中 i) 胭脂堿胭脂堿Ti 質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA長(zhǎng)長(zhǎng)23bp,結(jié)構(gòu)連續(xù)，具結(jié)構(gòu)連續(xù)，具13個(gè)基因個(gè)基因 ii) 鱆魚(yú)堿鱆魚(yú)堿Ti 質(zhì)粒中的質(zhì)粒中的T-DNA不連續(xù)，分左右兩段，分別稱之為不連續(xù)，分左右兩段，分別稱之為T(mén)L和和TR, TLDNA長(zhǎng)長(zhǎng)13.2 kb,含含8個(gè)基因，包括鱆魚(yú)堿合成酶和

36、植物激素個(gè)基因，包括鱆魚(yú)堿合成酶和植物激素合成基因合成基因, TR DNA長(zhǎng)長(zhǎng)7.9 kb，含，含5個(gè)基因，參與甘露堿個(gè)基因，參與甘露堿(mannopine)和農(nóng)堿合成和農(nóng)堿合成 iii) )兩者同源性：主要集中在植物激素合成區(qū)。兩者同源性：主要集中在植物激素合成區(qū)。 2022-4-25 7 iaaH iaaM ipt 6a 6b OCSNOSacs 魚(yú)堿型T-DNA胭脂堿型T-DNATi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA的同源性的同源性 2022-4-22. Ti質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 1) Ti質(zhì)粒作為載體的問(wèn)題質(zhì)粒作為載體的問(wèn)題 i) 太大，無(wú)適合克隆位點(diǎn)太大，無(wú)適合克隆位點(diǎn) ii)T-DNA的存在不能使

37、轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為完整植株的存在不能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為完整植株 2) 載體類(lèi)型載體類(lèi)型 i)中間載體中間載體(intermediate vector) 由以下幾部分組成：由以下幾部分組成： 適合于適合于E.coliE.coli和和A.tumefaciensA.tumefaciens自主復(fù)制和選擇用標(biāo)記基因自主復(fù)制和選擇用標(biāo)記基因 適合于植物細(xì)胞選擇用標(biāo)記基因適合于植物細(xì)胞選擇用標(biāo)記基因 一段來(lái)自天然一段來(lái)自天然TiTi質(zhì)粒的部分質(zhì)粒的部分T-DNAT-DNA序列（提供同源重組）序列（提供同源重組） 1-21-2個(gè)來(lái)自個(gè)來(lái)自T-DNAT-DNA的的25bp25bp重復(fù)序列重復(fù)序列 用于表達(dá)外源基因的用

38、于表達(dá)外源基因的DNADNA序列（如啟動(dòng)子、終止子序列序列（如啟動(dòng)子、終止子序列）2022-4-2 中間載體或重組子中間載體或重組子 E.coli(中宿主中宿主) A.tumefaciens 在根癌農(nóng)桿菌中與天然在根癌農(nóng)桿菌中與天然Ti質(zhì)?；蚍侵铝鲑|(zhì)粒發(fā)生質(zhì)粒或非致瘤質(zhì)粒發(fā)生共整合作用共整合作用 感染植物受傷組織或與植物細(xì)胞共培養(yǎng)感染植物受傷組織或與植物細(xì)胞共培養(yǎng) T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到染色體進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到染色體DNA中中 外源基因表達(dá)外源基因表達(dá)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化接合接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 2022-4-2Ti A.tG-A.tA.tG-細(xì)菌間DNA的轉(zhuǎn)移Ti A.tA.tA.t細(xì)菌-植物間DNA

39、的轉(zhuǎn)移根癌農(nóng)桿菌中根癌農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 2022-4-2LIHtmsTiVirTiVirTiVirTiVirLIHTi-1Ti-3LIHTi-2Ti-2LIHTi-5Ti-6Ti-4vir分離兩個(gè)25 bp重復(fù)序列,插入細(xì)菌載體分離25 bp和LIH序列,插入細(xì)菌載體除去致瘤基因除去致瘤基因和25bp序列Vir 用細(xì)菌載體DNA取代T-DNA除去全部T-DNATi-5是中間載體,Ti-6是雙質(zhì)粒載體Ti基因片段植物標(biāo)記基因Ti質(zhì)粒衍生的植物克隆載體質(zhì)粒衍生的植物克隆載體 2022-4-2二、二、釀酒酵母釀酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆載體的

40、分子克隆載體 1.克隆載體的種類(lèi)克隆載體的種類(lèi) 1) 按復(fù)制方式劃分按復(fù)制方式劃分 i. 自主復(fù)制型；自主復(fù)制型； ii. 整合型（非自主復(fù)制型）整合型（非自主復(fù)制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按復(fù)制子來(lái)源劃分按復(fù)制子來(lái)源劃分 i. 附加體型附加體型- yeast episomal plasmid(YEp)，其復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自于釀，其復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒酒酵母的天然質(zhì)粒-2質(zhì)粒質(zhì)粒 ii. 染色體復(fù)制型染色體復(fù)制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其復(fù)制起點(diǎn)來(lái)，其復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自染色體上的自主復(fù)制序列自染色體上的自主

41、復(fù)制序列(ARS-autonomous replicating sequence)三、其他質(zhì)粒載體2022-4-2TELURA3 2AmprTcrURA3 YIpYEp YRpYLp pYAC AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcrTcrURA3OriOriOriOriCENYCp AmprTcrURA3OriTRP1HIS4TELTELTEL2URA3AmprTELARS釀酒酵母載體的種類(lèi)和構(gòu)建釀酒酵母載體的種類(lèi)和構(gòu)建 2022-4-2 * 若在若在YRp中插入釀酒酵母的著絲粒序列，該種載體中插入釀酒酵母的著絲粒序列，該種載體YCp-Yeast Centrometric plas

42、mid * 若在若在YCp 或或YRp 中插入一段酵母的端粒結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒稱之為中插入一段酵母的端粒結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒稱之為YLp-Yeast Linear plasmid * 若將若將YLp質(zhì)粒構(gòu)建成環(huán)狀分子質(zhì)粒構(gòu)建成環(huán)狀分子,該質(zhì)粒稱之為該質(zhì)粒稱之為pYAC載體載體(Yeast Artificial Chromosome) 3) 標(biāo)記基因標(biāo)記基因 大多數(shù)是以酵母菌氨基酸或堿基合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因作為選擇標(biāo)大多數(shù)是以酵母菌氨基酸或堿基合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因作為選擇標(biāo)記，如記，如ARG4ARG4，LEU2LEU2，TRP1TRP1，HIS3HIS3和和URA3URA3。使用這些遺傳標(biāo)記時(shí)，受使用這些遺傳

43、標(biāo)記時(shí)，受體菌應(yīng)是相應(yīng)標(biāo)記基因的突變型，且是穩(wěn)定的突變體（缺失突變或體菌應(yīng)是相應(yīng)標(biāo)記基因的突變型，且是穩(wěn)定的突變體（缺失突變或多點(diǎn)突變），利用遺傳互補(bǔ)進(jìn)行轉(zhuǎn)化體選擇的，重組子則是靠在多點(diǎn)突變），利用遺傳互補(bǔ)進(jìn)行轉(zhuǎn)化體選擇的，重組子則是靠在E.coliE.coli的轉(zhuǎn)化體中來(lái)鑒別的。的轉(zhuǎn)化體中來(lái)鑒別的。 2022-4-2 2. 酵母克隆載體的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)酵母克隆載體的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn) 1) 穿梭載體，穿梭載體，YIp除外除外 2) 有適合兩種生物的標(biāo)記基因有適合兩種生物的標(biāo)記基因 3) 環(huán)狀或線狀環(huán)狀或線狀DNA 詳見(jiàn)下表詳見(jiàn)下表 2022-4-2載體類(lèi)型載體類(lèi)型 存在方式存在方式 所需所需DNA序列序

44、列 標(biāo)記基因標(biāo)記基因 轉(zhuǎn)化頻率轉(zhuǎn)化頻率 穩(wěn)定性穩(wěn)定性 （菌落（菌落/gDNA）無(wú)絲分裂）無(wú)絲分裂 有絲分裂有絲分裂 整合型整合型 整合整合 與染色體與染色體DNA Apr Tcr 10 +a +a (YIp5) 1-幾個(gè)拷貝幾個(gè)拷貝 同源同源 URA3 附加體型附加體型 自主復(fù)制自主復(fù)制 2質(zhì)粒質(zhì)粒 Apr Tcr 103-104 -b -c (YEp13) 多拷貝多拷貝 LEU2 復(fù)制型復(fù)制型 自主復(fù)制自主復(fù)制 ARS Apr Tcr 103-104 -b -c (YRp7) 多拷貝多拷貝 TRP1 著絲粒型著絲粒型 染色體狀染色體狀 ARS,CEN Apr 103-104 +d +d (Y

45、Cp19) 通常單拷貝通常單拷貝 TRP1,URA3 線型線型 染色體狀染色體狀 ARS，CEN TRP1，HIS3 103-104 +e + (YLp21) 通常單拷貝通常單拷貝 TEL a. 每次細(xì)胞分裂仍有約每次細(xì)胞分裂仍有約1%的載體的載體DNA從染色體上脫落下來(lái)從染色體上脫落下來(lái)b. 在選擇培養(yǎng)基中在選擇培養(yǎng)基中15-20代后，代后，10-30%的轉(zhuǎn)化子丟失載體的轉(zhuǎn)化子丟失載體DNAc. 非孟德?tīng)柺椒蛛x，主要是非孟德?tīng)柺椒蛛x，主要是4+：0-d. 無(wú)絲分裂時(shí)有無(wú)絲分裂時(shí)有3-14%轉(zhuǎn)化體丟失質(zhì)粒，有絲分裂時(shí)有轉(zhuǎn)化體丟失質(zhì)粒，有絲分裂時(shí)有3%轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒不發(fā)生分離轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒不發(fā)生分離在選

46、擇培養(yǎng)基上丟失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體低于在選擇培養(yǎng)基上丟失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體低于1% 1% 釀酒酵母各種載體的特征釀酒酵母各種載體的特征2022-4-23. YEp載體載體 1) 酵母酵母2質(zhì)粒質(zhì)粒 i. 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) ii. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) REP1 REP3REP2oriFLP P H HEREP1 REP3REP2oriFLP P H HEB formA form2774bp599bp51 bp51 bp16bp16bp16bp16bp11 bp11 bp13 bp 13 bp122 bp1072294002291782質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 2質(zhì)粒倒置區(qū)的質(zhì)粒倒置區(qū)的同向和反向重復(fù)片段同向和反向重復(fù)片段2

47、022-4-22022-4-22022-4-22）2質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 YIp中可插入整個(gè)或部分中可插入整個(gè)或部分2質(zhì)粒質(zhì)粒DNA構(gòu)成構(gòu)成YEp。大多數(shù)釀酒酵母菌株中都含有。大多數(shù)釀酒酵母菌株中都含有2質(zhì)質(zhì)粒，粒，YEp復(fù)制所需的酶可由復(fù)制所需的酶可由2質(zhì)粒提供。質(zhì)粒提供。 YEp具有具有YRp載體相同的特點(diǎn)，它還可以與載體相同的特點(diǎn)，它還可以與2質(zhì)粒發(fā)生重組。重組質(zhì)粒不穩(wěn)定，在無(wú)質(zhì)粒發(fā)生重組。重組質(zhì)粒不穩(wěn)定，在無(wú)選擇壓力條件下可很快消失。利用此特點(diǎn)可除去酵母菌株中的天然質(zhì)粒，即選擇壓力條件下可很快消失。利用此特點(diǎn)可除去酵母菌株中的天然質(zhì)粒，即Cir+ Ciro 當(dāng)當(dāng)YEp進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)化

48、體內(nèi)所含進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)化體內(nèi)所含DNA可得如下雜交圖譜（設(shè)可得如下雜交圖譜（設(shè)YEp為為8 kb，BamHI有一單切點(diǎn)）有一單切點(diǎn)）YEp13(10.7 kb)Tcrori22E EP B 1 2 3 410.710.710.76.33.53.51-YEp13 探針探針; 2-2質(zhì)粒探針質(zhì)粒探針; 3-LEU2探針探針; 4-pBR322探針探針2022-4-24. pYAC載體載體 酵母菌人工染色體酵母菌人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)廣泛用于構(gòu)建高等廣泛用于構(gòu)建高等動(dòng)植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建動(dòng)植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建, 由由YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建

49、成經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成pYAC載體。載體。pYAC載體具有以下特點(diǎn)：載體具有以下特點(diǎn)： 1） 雙雙TEL位點(diǎn)；位點(diǎn)； 2） 三個(gè)酵母菌遺傳標(biāo)記基因；三個(gè)酵母菌遺傳標(biāo)記基因； 3） 一個(gè)一個(gè)SUP4基因用于檢測(cè)重組子基因用于檢測(cè)重組子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的ade2赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色菌落，要是在菌落，要是在SUP4基因中插入外源基因中插入外源DNA片段后在轉(zhuǎn)化片段后在轉(zhuǎn)化ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。成紅色菌落。2022-4-2YAC:酵

50、母人工染色體（yeast artificial chromosome）目前能容納最大外源DNA片斷的載體. nYAC載體有兩個(gè)臂，每個(gè)臂的末端有一個(gè)端粒（TEL），臂上有著絲粒（CEN）、自主復(fù)制序列（ARS）、選擇標(biāo)記（TRP1和URA3）n裝載容量：50Kb-2000KbnYAC載體是以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，如：pYAC22022-4-22022-4-2AmprTELTELSup4CEN4 ARS1TRP1OripYAC4E Sm S X B X B pYAC OriTRP1TELTELHIS4AmprARSCENpYAC載體的結(jié)構(gòu)載體的結(jié)構(gòu)2022-4-22022-4-22022-4-2202

51、2-4-2第二節(jié) 噬菌體載體一、 噬菌體的分子生物學(xué)n噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和 DNA組成n1. -DNA的物理圖譜n -DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個(gè)12核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)，全長(zhǎng)48.5kb。 左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞，DNA自主復(fù)制以及調(diào)控基因，中間是負(fù)責(zé)與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因2022-4-2A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因

52、 功能不明區(qū)功能不明區(qū) 溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生長(zhǎng)非必須區(qū)段生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI cI基因：溶源過(guò)程控制基因?；颍喝茉催^(guò)程控制基因。噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)2022-4-25-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear

53、form 2022-4-22022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體一、噬菌體的分子生物學(xué)2022-4-2 溶源階段溶源階段 ( (整合到寄主染色體上整合到寄主染色體上) )48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) phage2022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體二、 噬菌體載體的構(gòu)建n天然的DNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實(shí)驗(yàn)的載體n1. 1. 縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度 野生型DNA包裝的上限為50.9kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，

54、如果將縮短便提高裝載量。其實(shí)DNA上約有40-50%的DNA片段（J-N區(qū)間）是復(fù)制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。2022-4-22022-4-22022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建n縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度 n插入型載體插入型載體 n 該類(lèi)載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度為37kb，有單一酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入。其允許插入片段最大為13.9kb。n根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性分為兩種亞型：n免疫功能失活插入型載體1.半乳糖苷酶失活插入型載體2022-4-2插入式載體：插入式載體： cI cI基因插入失活：基因插入失活：如如 gt10 gt10、NM1149NM1149等載體，在等

55、載體，在cI cI基因上有基因上有EcoR IEcoR I及及Hind IIIHind III的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI cI基因的失活?；虻氖Щ?。cI cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活：基因插入失活：如如charon16Acharon16A載體，在非必須區(qū)段引入載體，在非必須區(qū)段引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoR IEcoR I位點(diǎn)，插入失活后

56、利用位點(diǎn)，插入失活后利用X-galX-gal法篩選法篩選（蘭白篩選）。（蘭白篩選）。 2022-4-2 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A2022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建n縮短長(zhǎng)度縮短長(zhǎng)度 n替換型載體（取代型載體）替換型載體（取代型載體） 1.該類(lèi)載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長(zhǎng)，使用時(shí)用酶切開(kāi)，分離去除這個(gè)14kb長(zhǎng)的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 2022-

57、4-2Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Charon 4AEMBL3/4Charon 402022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建n刪除重復(fù)的酶切口刪除重復(fù)的酶切口n插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；n取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行2.天然的l-DNA上有許多重復(fù)的酶切口，如：EcoRI 5個(gè)，HindIII 7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除。2022-4-22022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體二、噬菌體載體的構(gòu)建n構(gòu)建琥珀型密碼子突變體n 終止密碼子有三種：UAA（

58、赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀）n 琥珀型突變：CAG-UAG（stop）3. 將野生型-DNA上A和B兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG，當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的A和B頭部蛋白，也就不能被包裝，不能裂解細(xì)菌。阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。2022-4-22022-4-2第二節(jié) 噬菌體載體三、 -DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)作為載體的優(yōu)點(diǎn)n-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌n-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量n重組-DNA的篩選較為

59、方便1.4. 重組-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易2022-4-22022-4-2第三節(jié) Cosmid載體一、Cosmid的定義的定義 nCosmid（cos sitecarrying plasmid）：是一是一類(lèi)由人工構(gòu)建的含有類(lèi)由人工構(gòu)建的含有 -DNA兩端兩端cos序列序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體。n質(zhì)粒復(fù)制子包括：一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)抗性基因Apr 、Tcr。2022-4-2Cosmid載體的特點(diǎn)載體的特點(diǎn)具有具有噬菌體的特性；噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；具有較高容量的克隆能力；具有較高容量的克隆能力；1.具有與同源性序列的質(zhì)

60、粒進(jìn)行重組的能力具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力2022-4-2第三節(jié) Cosmid載體二、Cosmid的構(gòu)建的構(gòu)建 nCosmid含有-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒。由于-DNA包裝時(shí)，其包裝蛋白只識(shí)別粘性末端附近的一小段順序，均1.5kb長(zhǎng)。如果將這一小段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個(gè)重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時(shí)它仍可象-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與噬菌體DNA所不同的是，Cosmid不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進(jìn)入細(xì)胞后，通過(guò)質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。2022-4-22022-4-22