流式細(xì)胞術(shù)(上)

1、流式細(xì)胞術(shù)之流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與原理韋俊2013.08技術(shù)專題概念流式細(xì)胞儀(flow cytometer ,FCM)是集現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計算機技術(shù)于一體的先進科學(xué)技術(shù)設(shè)備，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中先進的儀器之一。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)就是利用利用流式細(xì)胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史起源: 1934年- Moldvan毛細(xì)管細(xì)胞計數(shù)儀雛形: 1947年- Coulter細(xì)胞計數(shù)器1953年-第一臺流式細(xì)胞分析儀Coulter Counter Model A1974年世界上第一臺激

2、光流式細(xì)胞儀FACS-I 1975年研制出世界上第一臺帶計算機的流式細(xì)胞儀 1997年世界上第一臺單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀 2003年世界上第一臺單激光五色的流式細(xì)胞儀2009年世界上第一臺三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀自1981年，北京師范大學(xué)生物系引進中國第一臺流式細(xì)胞儀（FACS ， BDIS）至今，各種型號的流式細(xì)胞儀在國內(nèi)安裝使用已超過 400 臺廈大分析測試中心流式細(xì)胞儀Beckman公司EPICS XL分析型流式細(xì)胞儀BD公司FACSVantage SE分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的特點實現(xiàn)對單列細(xì)胞或生物顆粒進行逐個檢測；實現(xiàn)高通量檢測，最快可達數(shù)萬個每秒；可進行多參數(shù)測量，并具

3、有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義；定性或定量分析細(xì)胞；分選特定性狀或功能的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)四大模塊：液流系統(tǒng)流動室 鞘液SHEATH 樣本流SAMPLE光學(xué)系統(tǒng)光源濾片信號檢測與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)放大電路光電倍增管PMT分析系統(tǒng)計算機 分選系統(tǒng)液流系統(tǒng)流動室：儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。液流驅(qū)動系統(tǒng)（壓力泵）：空氣泵+壓力傳感器流式細(xì)胞儀的流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)Injector TipSheath fluid流體的聚焦高流速適用于定性測量，樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。低流速促使樣本流變窄，單個細(xì)胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束

4、的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實驗，如DNA分析。 光源系統(tǒng)激發(fā)光源：需要良好的單色性和單向性按光源種類：弧光燈和激光器按冷卻方式：空氣冷卻激光器和水冷卻激光器BD公司FACSVantage SE分選型流式細(xì)胞儀： 488nm和紫外同時激發(fā)的Coherent Enterprise水冷激光器； 633nm的空冷氦-氖激光器Beckman公司EPICS XL分析型流式細(xì)胞儀：488nm氬離子空冷激光器光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成其主要光學(xué)原件是濾光片，主要分成4類： 長通濾片(long-pass filter，LP)

5、：允許長于設(shè)定波長的光通過； 短通濾片(short-pass filter，SP)：允許短于設(shè)定波長的光通過； 帶通濾片(band-pass filter，BP)：允許一定帶寬的波長通過； 二分鏡(dichroic filter)它們分別將不同波長的光信號送入到不同的探測器。LONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass (600/100)Transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)Wavelengt

6、hs Blocked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nmPMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234流式細(xì)胞儀的光信號散射光信號：散射光分為前向角散射(forward scatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射(side scatter,

7、SSC)，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。前向角散射光檢測細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光檢測細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性前向散射光（FSC）FALS SensorLaser前向散射光（FSC）側(cè)向散射光（SSC）FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光（SSC）熒光信號熒光檢測器FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)信號檢測與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)當(dāng)攜帶熒光素的細(xì)胞與激光正交時，受激發(fā)發(fā)出熒光，經(jīng)過濾光片分離不同波長的光信號分別到達不同的光電倍增管(PMT)，PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號。電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。 電信號的放大細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。 在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測時，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍。如用線性放大器，將無法在一張圖上清晰地將細(xì)胞陽性群、陰性群同時顯示出來通常使用對數(shù)放大器。細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞懸液形成液流柱細(xì)胞懸液形成液流柱流