從魚肉中提取DNA并提取其含量(精)

1、從魚肉中提取 DNA 并測定其含量一、實驗?zāi)康?、 了解用鹽溶法從生物組織中提取 DNA 的原理。2、 學(xué)會從動物組織中提取 DNA 的操作技術(shù)。3、學(xué)習(xí)和掌握測定 DNA 的定糖法(二苯胺法)的原理和操作技術(shù)。二、實驗原理在濃氯化鈉(12mol/L )溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋 白的溶解度很小，在稀氯化鈉(0.14 mol/L )溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很 小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖 核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得的核蛋白用 SDS (十二烷基硫酸鈉)處理，DNA 或(RNA)即與蛋白質(zhì) 分開，可用氯仿一

2、異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而 DNA 則溶解于溶液中。向溶液中 加入適量乙醇，DNA 即析出。為了防止 DNA 或(RNA)酶解，提取時加入 EDTA (乙二胺四乙酸)脫氧核糖核酸中的a兌氧核糖在酸性環(huán)境中變成 羥基一丫酮基戊醛與二 苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在 595nm 處有最大的吸收，在每毫升含 DNA20400微克范圍內(nèi)，光密度與 DNA 的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙 醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。除 DNA 夕卜，脫氧木糖，阿拉伯糖也有同樣的反應(yīng)。三、實驗試劑(1) 0.14mol/L 氯化鈉-0.05mol/LpH7.0 檸檬酸鈉緩沖液 先配制 0.05mol/LpH7.0

3、檸檬酸鈉緩沖液， 再稱取一定量固體氯化鈉溶于此緩沖液中。 使最終氯化鈉濃度為 0.14mol/L。(2) 1 mol/L 氯化鈉溶液。(3) 氯仿-異戊醇混合液。(4) 80 %、90 %乙醇及無水乙醇。(5) 二苯胺試劑：稱取 1 克結(jié)果的二苯胺試劑溶于 100 毫升分析純的冰醋酸中， 再加入 10 毫升過氯酸(A.R60%以上)或濃硫酸 2.75 毫升， 混勻備用。 臨用前加 入 1 毫升 1.6%乙醛溶液（乙醛溶液應(yīng)保存于冰箱，一周內(nèi)可使用）所配得的溶液 應(yīng)為無色。四、實驗器具解剖器具、玻璃勻漿器、普通離心機、培養(yǎng)皿、量筒（ 50ml、100ml）;燒杯（100ml、250ml）、磨口試

4、劑瓶（150ml）、滴管、玻璃棒、臺秤、真空干燥器、 魚肝臟、試管及試管架、移液管（1, 2, 5 毫升）、恒溫水浴、可見光分光光度計五、實驗過程DNA 提取操作步驟（1）將活魚殺死后，迅速取出肝臟，置于冰浴中的培養(yǎng)皿中，剔除結(jié)締組織，用 少量冰冷的 0.14mo l/L 氯化鈉-0.05mol/LpH7.0 檸檬酸鈉緩沖液洗去血污，用濾紙吸干后稱重，約取 20g 剪碎后置玻璃勻漿器中，加入相當(dāng)于 2 倍干重的冰冷的 0.14mol/L 氯化鈉-0.05mol/LpH7.0 檸檬酸鈉緩沖液，在冰浴中反復(fù)研磨，制成細(xì)胞 勻漿。（2）將肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，以三千轉(zhuǎn)每分鐘離心十五分鐘，棄去上清液

5、， 所得沉淀再用兩倍質(zhì)量的 0.14mo l/L 氯化鈉-0.05mol/LpH7.0 檸檬酸鈉緩沖液研磨并如前離心兩次。（3） 講細(xì)胞核沉淀轉(zhuǎn)移到 100ml 燒杯中，加入 6 倍質(zhì)量的 1 mol/L 氯化鈉溶液， 充分?jǐn)噭?，置于冰箱中過夜，可得到半透明的粘稠狀液體，將下層沉渣棄去。用滴 管慢慢滴入 11 倍體積的冰冷蒸餾水中，此時有白色絲狀物（DNA 核蛋白）析出， 用玻璃棒攪起，瀝干水分，再溶于八倍質(zhì)量的1 mol/L 氯化鈉溶液中，迅速攪拌加速溶解。（4） 將上述溶液導(dǎo)入巨磨口塞的 250ml 試劑瓶內(nèi)，再加入等體積的氯仿-異戊醇 混合液，劇烈震蕩 5 分鐘，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，在三千轉(zhuǎn)

6、下離心十五分鐘，這時可見 三層。上層是含有 DNA 和 RNA 核蛋白的水層，下層是氯仿-異戊醇有機溶劑層，中間夾著的是變性蛋白質(zhì)凝膠層。吸出上面的水層，再用氯仿-異戊醇如前進(jìn)行脫蛋白，直至界面處不再出現(xiàn)蛋白質(zhì)凝膠為止。量取水層體積后再倒入2 倍體積的冰冷的 95%乙醇中，再用玻璃棒攪起白色絲狀物（DNA 沉淀），瀝干，先用 80%乙 醇洗滌兩次，再用無水乙醇洗滌一次，所得 DNA 沉淀置于真空干燥器內(nèi)干燥，稱 重。含量測定操作步驟（一） DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取 8 支試管，編號，按下表加入試劑管號01234567試劑DNA 標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.81.01.21.62.0蒸餾水21.81

7、.61.21.00.80.40二苯胺試劑44444444加畢，搖勻，于 60C恒溫水浴中保溫 1 小時，（或于沸水中煮沸 15 分鐘，冷 卻測0.D595nm 值。）以光密度為縱坐標(biāo)，DNA 含量（ug/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線。（二）樣品的測定取 2 支試管，各加 0.20.5 毫升的待測液（內(nèi)含 DNA 應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測范圍之 內(nèi)）加蒸餾水稀釋至 2 毫升，再加 4 毫升二苯胺試劑，搖勻，其操作步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲 線的制作相同。根據(jù)測得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光密度DNA 的含量，按下式計算出樣品中 DNA 的百分含量。DNA 含量/毫升待測液二標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值 怖釋倍數(shù)-x 100祈鮮時肝（對”血六、注意事項1、二茉胺法測定 DNA 含量靈敏度不高，待測樣品中 DNA 含量低于 50mg/L 即難以測定。乙醛可增加二苯胺法測定 DNA 的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉 伯糖的干擾，能顯著提高測定的靈敏度。2、樣品中含有少量 RNA 并不影響測定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、 芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應(yīng)形成有色化合物，故能干