DNA重組技術的基本工具

1、專題專題1 1 基因工程基因工程1基礎理論和技術的發(fā)展催生了基因工程20世紀中葉，基礎理論取得了重大突破 1.DNA是遺傳物質的證明 2.DNA雙螺旋結構和中心法則的確立 3.遺傳密碼的破譯2技術發(fā)明使基因工程的實施成為可能 1.基因轉移載體的發(fā)現(xiàn) 2.工具酶的發(fā)現(xiàn) 3.DNA合成和測序技術的發(fā)明 4.DNA體外重組的實現(xiàn) 5.重組DNA表達實驗的成功 6.第一例轉基因動物問世 7.PCR技術的發(fā)明3基因工程的概念：基因工程的概念： 基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外的設計，并通過體外DNADNA重組和轉基因等技術，重組和轉基因等技術，賦

2、予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在由于基因工程是在DNADNA分子水平上分子水平上進行設計和進行設計和施工的，因此又叫做施工的，因此又叫做DNADNA重組技術重組技術或基因拼接或基因拼接技術。技術。4重組重組DNA導入導入形成形成51.1 DNA1.1 DNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具6 基因工基因工程需要哪程需要哪些基本工些基本工具具? ?7分子手術刀分子手術刀限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶8一、分子手術刀一、分子手術刀-限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶

3、( (限制酶）限制酶）9DNA分子上的一段脫氧核苷酸鏈10 T磷磷酸酸二二酯酯鍵鍵1234512345 A1112內切酶切割內切酶切割DNADNA后形成的末端后形成的末端黏性末端、平黏性末端、平末端是如何形成的？末端是如何形成的？13141516 大腸桿菌的一種限制酶大腸桿菌的一種限制酶（EcoR)EcoR)能識別能識別GAATTCGAATTC序列，序列，并在并在G G和和A A之間切開形成黏性末之間切開形成黏性末端。端。 SmaSma能識別能識別CCCGGGCCCGGG序列，并序列，并在在C C和和G G之間切割形成平末端之間切割形成平末端 。17當限制酶在它識別序列的當限制酶在它識別序列的

4、中心軸線（圖中虛線）兩側中心軸線（圖中虛線）兩側將將DNADNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端黏性末端，而當限制，而當限制酶在它識別序列的酶在它識別序列的中心軸線處中心軸線處切開時，產(chǎn)生的則是切開時，產(chǎn)生的則是平末端平末端。18限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是的。1920黏性末端黏性末端平末端平末端21尋根問底尋根問底:限制酶存在于原核細胞中的限制酶存在于原核細胞中的作用是什么？為什么限制酶不剪切細菌作用是什么？為什么限制酶不剪切細菌本身的本身的DNA？22怎樣理解限制酶和怎樣理解限制酶和

5、DNA連接酶在微生物中能夠分離連接酶在微生物中能夠分離到到,而高等植物和動物中沒有而高等植物和動物中沒有?23為什么限制酶不能為什么限制酶不能將自己的將自己的DNA分子分子剪切掉？剪切掉？1 1、DNADNA分子不具分子不具備該種限制酶的備該種限制酶的識別切割序列；識別切割序列；2 2、通過甲基化酶、通過甲基化酶將甲基轉移到所將甲基轉移到所識別序列的堿基識別序列的堿基上，使限制酶不上，使限制酶不能切開。能切開。241.1.原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，但是，生物在長期的的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵進

6、化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNADNA侵入時，會利侵入時，會利用限制酶將外源用限制酶將外源DNADNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源原核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，從而達到保護自身、使之失效，從而達到保護自身的目的。的目的。2.2.迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識別和切斷中提取出來的，

7、它們各自可以識別和切斷DNADNA上特定的堿基序列。上特定的堿基序列。細菌中限制酶之所以不切斷自身細菌中限制酶之所以不切斷自身DNADNA，是因為微生物在長期的進化，是因為微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，對于外源入侵的過程中形成了一套完善的防御機制，對于外源入侵的DNADNA可以降解可以降解掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNADNA分子分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣

8、，盡基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNADNA被切斷，并且可以防被切斷，并且可以防止外源止外源DNADNA的入侵的入侵. .25二、連接酶二、連接酶“分子縫合針分子縫合針”.作用：連接磷酸二酯鍵作用：連接磷酸二酯鍵26 限制酶切割后產(chǎn)生兩種不同的末端。限制酶切割后產(chǎn)生兩種不同的末端。那么恢復它們的連接時，所用那么恢復它們的連接時，所用DNA連接連接酶是否可以不加選擇？酶是否可以不加選擇？E.coliDNAE.coliDNA連接酶：連接黏性末端連接酶：連接黏性末端T T4 4DNADNA連接酶：連

9、接黏性末端和平末端連接酶：連接黏性末端和平末端.DNA.DNA連接酶的種類連接酶的種類27DNADNA連接酶連接酶-“-“分子縫合針分子縫合針”分分類類E.coliDNAE.coliDNA連接酶連接酶T T4 4DNADNA連接酶連接酶差別差別: : E.coliDNAE.coliDNA連接酶連接酶只能只能將雙鏈將雙鏈DNADNA片段互片段互補的黏性末端之間連接起來補的黏性末端之間連接起來, ,不能將雙鏈不能將雙鏈DNADNA片段片段平末端之間進行連接平末端之間進行連接; T; T4 4DNADNA連接酶既可以連接酶既可以“縫縫合合”雙鏈雙鏈DNADNA片段互補的黏性末端片段互補的黏性末端,

10、,又可以又可以“縫合縫合”雙鏈雙鏈DNADNA片段的平末端片段的平末端, ,但連接平末端之間的效率但連接平末端之間的效率比較低。比較低。28DNA連接酶連接酶分子縫合針分子縫合針常用類型常用類型EcoliEcoli DNADNA連接連接酶酶T T4 4 DNADNA連接酶連接酶來源來源大腸桿菌大腸桿菌T T4 4噬菌體噬菌體功能功能連接黏性末端連接黏性末端連接黏性末端和平末連接黏性末端和平末端端結果結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵酸二酯鍵29DNA聚合酶和聚合酶和DNA連接酶有何連接酶有何相同點和不同點？相同點和不同點？30答：不是一回事。答

11、：不是一回事。DNADNA連接酶和連接酶和DNADNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的相鄰核苷酸的3 3位碳原子上的羥基與位碳原子上的羥基與5 5位碳原子上所連磷酸基團的羥位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？（1 1）DNADNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的33末端末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNADNA連接酶是在兩個連接酶是在兩個DNADNA片段之間形片段之間形成磷酸二酯鍵，不

12、是在單個核苷酸與成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNADNA片段之間形成磷酸二酯鍵。片段之間形成磷酸二酯鍵。（2 2）DNADNA聚合酶是以一條聚合酶是以一條DNADNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNADNA鏈；而鏈；而DNADNA連接酶是將連接酶是將DNADNA雙鏈上雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此的兩個缺口同時連接起來。因此DNADNA連接酶不需要模板。連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。31DNADN

13、A連接酶連接酶DNADNA聚合酶聚合酶連接連接DNADNA鏈鏈連接部位連接部位相同點相同點雙鏈雙鏈單鏈單鏈在兩在兩DNADNA片段之間形片段之間形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加將單個核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3 3末端的末端的羥基上，形成磷羥基上，形成磷酸二酯鍵酸二酯鍵都能形成都能形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵二者都由蛋白質構成二者都由蛋白質構成32假如目的基因導入受體細胞后不能復制假如目的基因導入受體細胞后不能復制將怎樣？將怎樣？作為載體沒有切割位點將怎樣？作為載體沒有切割位點將怎樣？目的基因是否進入受體細胞，你如何察目的基因是否進入受體細胞，你如何察覺？覺？如果載體

14、對受體細胞有害將怎樣？如果載體對受體細胞有害將怎樣？三、基因進入受體細胞的載體三、基因進入受體細胞的載體 “分子運輸車分子運輸車”33載體的必要條件載體的必要條件 能自我復制能自我復制 或能進入受體生物細胞并在或能進入受體生物細胞并在受體生物細胞內復制并表達受體生物細胞內復制并表達 有一個或多個切割位點有一個或多個切割位點 具有標記基因具有標記基因 以便重組后進行篩選以便重組后進行篩選 對受體細胞無害對受體細胞無害 結構簡單結構簡單 以便提取和在體外進行操作，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作太大就不便操作34能復制并帶著插能復制并帶著插入的目的基因一入的目的基因一起復制起復制有切割位點

15、有切割位點有標記基因的存有標記基因的存在，可用含氨芐在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基青霉素的培養(yǎng)基鑒別。鑒別。35常用的分子運輸車常用的分子運輸車有哪些？有哪些？質粒、質粒、噬菌體衍生物、噬菌體衍生物、動植物病毒動植物病毒3637小結基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有專一性具有專一性(識別序列識別序列)切開切開DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵種類種類E.coliDNA連接酶連接酶T4 DNADNA連接酶連接酶載體載體具備的具備的條件條件自我復制自我復制具一個多個限制酶切位點具一個多個限制酶切位點具

16、標記基因具標記基因大小適中大小適中質粒、質粒、噬菌體衍生物、動植物病毒噬菌體衍生物、動植物病毒對受體細胞無害對受體細胞無害38思考與探究思考與探究總結規(guī)律總結規(guī)律限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列有什么特點？無論是無論是6 6個堿基還是個堿基還是4 4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈軸線兩側的雙鏈DNADNA上的堿基是反向對稱重復排列的。上的堿基是反向對稱重復排列的。 1.1.限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能將的任何部位都能將DNADNA切開嗎？以下是四種切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的不同限制酶切割形成的DNAD

17、NA片段：片段：(1) (1) CTGCACTGCA (2) (2) ACAC (3) GC (3) GC G G TGTG CG CG（4 4）G G (5) (5) G G (6) (6) GCGC CTTAACTTAA ACGTC ACGTC CGCG(7) GT(7) GT (8)AATTC(8)AATTC CA CA G G你是否能用你是否能用DNADNA連接酶將它們連接起來？連接酶將它們連接起來？39 2和7能連接形成ACGT TGCA； 4和8能連接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能連接形成GCGC CGCG； 1和5能連接形成CTGCAG GACGTC。40 3.基因工

18、程中作為載體使用的基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒（分子很多都是質粒（plasmid），），即獨立于細菌擬核處染色體即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1） 載體載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制

19、酶的切點所處可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。于因目的基因的插入而失活。（2） 載體載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體上隨染色體DNA的復制而同步復制。的復制而同步復制。（3） 載體載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。（4） 載體載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到必需是安全的

20、，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。除受體細胞外的其他生物細胞中去。（5） 載體載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。就不便操作。 實際上自然存在的質粒實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。行人工改造后才能用于基因工程操作。414.網(wǎng)上查詢：DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領嗎？ 迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不連接酶都不具有連接單鏈具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)的能力，至于原

21、因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈鏈DNA的酶。的酶。421.在基因工程中，切割運載體和含有目的在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的基因的DNA片段，需使用（片段，需使用（ ）A. 同種限制酶同種限制酶 B. 兩種限制酶兩種限制酶C. 同種連接酶同種連接酶 D. 兩種連接酶兩種連接酶434445問題問題:DNA聚合酶與聚合酶與DNA連接酶是同一種酶的不連接酶是同一種酶的不同名稱嗎同名稱嗎?相同相同區(qū)別區(qū)別DNADNA聚聚合酶合酶形成磷形成磷酸二酯酸二酯鍵鍵只能將單個核苷酸連接到核酸片段上只能將單個核苷酸連接到核酸片段上; ;以一條以一條DNAD

22、NA鏈為模板鏈為模板, ,形成互補的形成互補的DNADNA鏈。鏈。DNADNA連連接酶接酶將兩個將兩個DNADNA片段之是形成磷酸二脂鍵；片段之是形成磷酸二脂鍵；將將DNADNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板。不需要模板。46問題：標記基因的作用及其應用問題：標記基因的作用及其應用標記標記基因基因抗四環(huán)素的基因抗四環(huán)素的基因抗氨芐青霉素的基因抗氨芐青霉素的基因特定顏色的基因特定顏色的基因四環(huán)素四環(huán)素氨芐青霉素氨芐青霉素47習題習題:已知標記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基已知標記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因因,現(xiàn)探討某細菌的質粒中有無標記基

23、因或標記基因是什現(xiàn)探討某細菌的質粒中有無標記基因或標記基因是什么么?請設計實驗、寫出可能的實驗結果，并得出相應的請設計實驗、寫出可能的實驗結果，并得出相應的實驗結論實驗結論對照組：對照組：不添加抗不添加抗生素生素實驗組實驗組1：添加一定濃添加一定濃度的四環(huán)素度的四環(huán)素實驗組實驗組2：添加一定濃添加一定濃度的氨芐青度的氨芐青霉素霉素實驗組實驗組3：添：添加一定濃度的加一定濃度的四環(huán)素和氨芐四環(huán)素和氨芐青霉素青霉素對照組對照組實驗組實驗組1 1實驗組實驗組2 2實驗組實驗組3 3 結結 論論結果一結果一+ + + + +既含有抗四環(huán)素基因也含既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因有抗氨芐青霉素基

24、因結果二結果二+ + +只含有抗四環(huán)素基因只含有抗四環(huán)素基因結果三結果三+ + +只含有抗氨芐青霉素基因只含有抗氨芐青霉素基因結果四結果四+ +既不含有抗四環(huán)素基因也既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因不含有抗氨芐青霉素基因48載體的三大功能：載體的三大功能：1）為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力。）為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力。2）為外源基因提供在受體細胞的的復制能力或整合力。）為外源基因提供在受體細胞的的復制能力或整合力。3）為外源基因提供在受體細胞的的擴增和表達能力。）為外源基因提供在受體細胞的的擴增和表達能力。理想載體具備四個條件：理想載體具備四個條件：1)具有對受體

25、細胞的可轉移性，提高導具有對受體細胞的可轉移性，提高導入細胞的效率。入細胞的效率。2)具有與特定受體細胞相適應的復制位具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點，使外源基因在受體細胞點或整合位點，使外源基因在受體細胞中穩(wěn)定遺傳。中穩(wěn)定遺傳。3)具有多種單一的核酸內切酶識別切割具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點，有利于外源基因的拼接插入。位點，有利于外源基因的拼接插入。4)具有合適的選擇標記（報告基因），具有合適的選擇標記（報告基因），便于便于DNA重組分子的檢測。重組分子的檢測。問題問題:為什么需要載體為什么需要載體,直接將基因導入受體直接將基因導入受體細胞行不行細胞行不行?49質粒的構建

26、與改造質粒的構建與改造1)1)刪除不必要的刪除不必要的DNADNA區(qū)域，縮小分子量，提高區(qū)域，縮小分子量，提高外源外源DNADNA片段裝載量。片段裝載量。2)2)滅活某些質粒的編碼基因。滅活某些質粒的編碼基因。3)3)加入易于識別的選擇標記基因。加入易于識別的選擇標記基因。 4)4)加入特殊的基因表達調控元件。加入特殊的基因表達調控元件。 一般來說，天然運載體往往不能滿足人類的所有要求，一般來說，天然運載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對某些天然的運載體因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對某些天然的運載體進行人工改建。進行人工改建。 50（08海南高考）海南高考）右圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所右圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制酶指分別為限制酶EcoR、BamH的酶切位點，的酶切位點，a