高效液相資料

1、第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜法高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography, HPLC一、概述氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學性質(zhì)穩(wěn)定的有機化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。所以，HPLC的應用范圍已經(jīng)遠遠超過氣相色譜。 通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。其實，有些液相色譜方法并不能簡單地歸于這四類。 吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備 分配色譜疏水分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高

2、分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機離子、有機離子分析手性色譜立體效應手性異構(gòu)體分離，藥物純化 類 型 主要分離機理 主要分析對象或應用領(lǐng)域親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析二、高效液相色譜儀二、高效液相色譜儀檢測器檢測器高壓輸液泵高壓輸液泵 高壓輸液泵高壓輸液泵 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1、輸液系統(tǒng) (1) 高壓輸液泵高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復性和準確性。高壓輸液泵在線脫氣裝置(2)在線脫氣裝置在

3、線脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。除在線脫氣裝置外，目前也采用超聲脫氣、真空脫氣等方式。脫氣不好時有氣泡，導致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄溢，噪音增加。（3）梯度洗脫裝置通過兩個輸液泵流速的變化，改變流動相的洗脫能力，其作用與氣相色譜的程序升溫類似。ABABCC2、進樣系統(tǒng)通常采用六通伐進樣：色譜柱色譜柱色譜柱色譜柱泵泵泵泵12進進樣樣3、色譜柱Normal column5-um、4.6-umNarrow bore column 1-3 umMicro column 1 um色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料

4、特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。 4、檢測器 作用 用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。目前最常用的檢測器主要有：紫外-可見檢測器熒光檢測器電化學檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器（1）紫外-可見檢測器光源光源檢測室檢測室光柵光柵二極管陣列二極管陣列檢測器檢測器（2）熒光檢測器許多有機化合物，特別是芳香族化合物、被一定強度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應衍生化后檢測。 特點： 有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測法高23個數(shù)量級，特別適合于藥物和生物化學樣品的分析。熒光檢測器結(jié)構(gòu)示意圖光源光源檢測器檢測器濾光片濾光片檢測

5、室檢測室（3）蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。（4）電化學檢測器（以電導檢測器為例）電導儀電導儀電極電極電極電極三、液相色譜分離模式一、吸附色譜（adsorption chromatography） 原理：基于被測組分在固定相表面具有吸附作用，且各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留和實現(xiàn)分離。 固定相： 固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑，所以吸附色譜也稱液固吸附色譜。活性硅膠最常用。流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等

6、。 二、分配色譜 應用： 吸附色譜用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法，如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。 缺點是容易產(chǎn)生不對稱峰和拖尾現(xiàn)象。原理： 主要基于樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。 液-液分配色譜固定相的液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現(xiàn)性很差，不大為人們所采用。后來發(fā)展起來的鍵合固定相以化學鍵合的方法將功能分子結(jié)合到惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。 鍵合固定相OHOHOHOOO+ C18H37SiCl3SiC18H37非極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的O

7、DS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，其極性很小。極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動相是甲

8、醇和乙腈。是當今液相色譜的最主要分離模式。ODS（Octa Decyltrichloro Silane)三、體積排斥色譜（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）原理： 以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受固定相孔徑大小的影響而達到分離的一種液相色譜分離模式。大分子全排出VR = V0小分子全進入VR = V0 + VS中分子部分進入VR = V0 + KVS 四、離子交換色譜（ion exchange chromatography, IEC） IEC使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離，帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。SO3H + M+ SO3M + H+ 抑制柱離子色譜的原理：以陰離子分析為例：分析柱反應：RCl + NaOHROH + NaCl抑制柱反應：RH + NaCl RNa + HClRH + NaOHRNa + H2O第五節(jié)毛細管電動色譜一、電遷移原理高壓電源DLEV電遷移率E電場強度L支持體長度帶電粒子在電場中移動的速度正比于電位梯度rq6q電量r離子半徑溶劑粘度LEtvtSLEtSSSABAB)(在一定的電遷移的條件下，兩個組分的電荷 q 及 半徑 r 不同，遷移的速度就