課題3分解纖維素的微生物的分離

1、一、基礎知識一、基礎知識基本單位：基本單位：葡萄糖葡萄糖分布：分布：例例1 1：下：下列生物能分解纖維素的是（列生物能分解纖維素的是（ ）人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纖維桿菌纖維桿菌A. B.C. D.C分分解解纖維素纖維素的生物：的生物：草食性動物草食性動物微生物：各種細菌、真菌和少數(shù)放線菌微生物：各種細菌、真菌和少數(shù)放線菌 在草食性動物等的消化道內(nèi)，也在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有共生有分解纖維素的微生物分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的人沒有分解纖維素的能力能力。纖維素纖維素C C1 1酶酶CxCx酶酶

2、葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖纖維二糖維二糖3 3、纖維素酶活性的測定實驗：纖維素酶活性的測定實驗：方法：濾紙方法：濾紙崩潰法崩潰法取二支取二支20mL20mL的試管的試管實驗：實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗纖維素酶分解纖維素的實驗各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入PH4.8PH4.8，物質(zhì)量為，物質(zhì)量為0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液的醋酸醋酸鈉緩沖液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在在乙乙試管中加入試管中加入1mL1mL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振

3、蕩1h1h結(jié)果：乙試管的濾紙條消失結(jié)果：乙試管的濾紙條消失 討論討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？試管的作用是什么？實驗分析：實驗分析：P P2727的的小實驗小實驗本實驗的本實驗的自變量自變量是纖是纖維素酶的有無維素酶的有無自變量的操縱方法是：自變量的操縱方法是：在在一支試管中添加適一支試管中添加適量（量（1mL1mL）的纖維素）的纖維素酶溶液酶溶液，在，在另一支試另一支試管不添加纖維素酶管不添加纖維素酶，但，但需加入等量的緩沖液，需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的會影響溶液的pHpH。乙試管濾紙消失乙試

4、管濾紙消失原因：原因：纖維素酶把纖維纖維素酶把纖維素分解素分解甲試管的作用：甲試管的作用： 對照對照 即：可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈即：可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。纖維素纖維素產(chǎn)生產(chǎn)生分解分解三、三、實驗設計實驗設計土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)梯度梯度稀釋稀釋將樣品將樣品涂布到涂布到鑒別培鑒別培養(yǎng)基養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落什么什么樣的樣的環(huán)境環(huán)境取樣取樣? 培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基的特點的特點? ?挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基的特點的特點? ?如何鑒別如何鑒別? ?思考：本實驗的流程與課題思考：本實驗的流程與課題2

5、 2中的實驗中的實驗流程有哪些異同？流程有哪些異同？ 課課題題2 2：將土樣制成的菌懸液直接涂將土樣制成的菌懸液直接涂布在選擇培養(yǎng)基上布在選擇培養(yǎng)基上 本課題：通過選擇培養(yǎng)，使纖維本課題：通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，素分解菌得到增殖后，再涂布在鑒別再涂布在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上。土壤取樣土壤取樣取樣環(huán)取樣環(huán)境：境：富含纖維素的環(huán)境中富含纖維素的環(huán)境中 由于由于生物與環(huán)境的相互依存關系生物與環(huán)境的相互依存關系，在在富含纖維素的環(huán)境富含纖維素的環(huán)境中，中，纖維素分解菌纖維素分解菌的含量相對提高的含量相對提高，因此從這種土樣中獲，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。得目的微

6、生物的幾率要高于普通環(huán)境。原因原因 實實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。多年積累的枯枝敗葉等。 如如果找不到合適的環(huán)境果找不到合適的環(huán)境，還可以將，還可以將富含富含纖維素的物質(zhì)如濾紙纖維素的物質(zhì)如濾紙等，埋等，埋在土壤中在土壤中，經(jīng)，經(jīng)過過30d30d左右，再從左右，再從已腐爛的濾紙上已腐爛的濾紙上篩選纖篩選纖維素分解菌。維素分解菌。 將濾紙埋在土壤將濾紙埋在土壤中：中：人工設置纖維素人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境，使纖維素分解菌分解菌生存的適宜環(huán)境，使纖維素分解菌相對聚集。相對聚集。將濾紙將濾紙埋在土壤中埋在土壤中有什么作用？你認有什

7、么作用？你認為濾紙應埋進土壤中為濾紙應埋進土壤中多深多深？一般應將濾紙埋于一般應將濾紙埋于深約深約10cm10cm左右的土壤中左右的土壤中。閱讀資料二閱讀資料二“選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基”，回，回答以下幾問題：答以下幾問題：( (富集培養(yǎng)，濃縮）富集培養(yǎng)，濃縮）可可用用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對與之對照，照，或或者將者將纖維纖維素粉素粉改改為為葡萄糖葡萄糖。選擇培養(yǎng)的操作方法：選擇培養(yǎng)的操作方法：將土樣加入裝有將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，的錐形瓶中，將錐形瓶固定在將錐形瓶固定在搖床搖床上上，在一定溫度下，在一定溫度下震蕩震蕩培培養(yǎng)養(yǎng)12天，直至培養(yǎng)液天，直

8、至培養(yǎng)液變渾濁變渾濁。吸取一定的培。吸取一定的培養(yǎng)液（如養(yǎng)液（如5ml），轉(zhuǎn)移到另一瓶新鮮的選擇培），轉(zhuǎn)移到另一瓶新鮮的選擇培養(yǎng)基中，以同樣的方法培養(yǎng)到培養(yǎng)液變渾濁。養(yǎng)基中，以同樣的方法培養(yǎng)到培養(yǎng)液變渾濁。為為什么選擇培養(yǎng)能夠什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮濃縮”所需的微生物？所需的微生物？指微生物的種類少了，而指微生物的種類少了，而某些微生物的數(shù)量多了某些微生物的數(shù)量多了在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適適應該條件應該條件的的微生物得到迅速繁殖微生物得到迅速繁殖，而那些，而那些不適應該條件的微生物不適應該條件的微生物的繁殖的繁殖被抑制被抑制，因，因此可以起到此可以起

9、到“濃縮濃縮”的作用。的作用。101102103104105106將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（2 2）涂）涂布平板：將稀布平板：將稀釋度為釋度為10104 410106 6的菌懸的菌懸液各取液各取0.1ml0.1ml涂布在培涂布在培養(yǎng)基上，養(yǎng)基上，3030倒置培養(yǎng)倒置培養(yǎng)鑒別鑒別纖維素分解菌的纖維素分解菌的培培養(yǎng)基養(yǎng)基CMC-Na CMC-Na 5-10g 5-10g酵母膏酵母膏 1g1gKH2PO4 0.25gKH2PO4 0.25g瓊脂瓊脂 15g15g土豆汁土豆汁 100ml100ml將上述物質(zhì)溶解后將上述物質(zhì)溶解后, ,用蒸用蒸餾水定容

10、到餾水定容到1000ml1000ml（1)1)制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基: :固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基實驗組：實驗組：對照組：對照組：出現(xiàn)明顯出現(xiàn)明顯的透明圈的透明圈不會出現(xiàn)明不會出現(xiàn)明顯的透明圈顯的透明圈實實驗驗組組對對照照組組挑選產(chǎn)生挑選產(chǎn)生透明圈透明圈的菌落的菌落 挑取產(chǎn)生挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，明顯的透明圈的菌落，一般即一般即為分解纖維素的菌落。為分解纖維素的菌落。 接種到接種到纖維素分解菌的纖維素分解菌的選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在基上，在30300 0C C37370 0C C培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。培養(yǎng)。剛剛果紅染色果紅染色法：法：在在長出菌落長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃的培養(yǎng)

11、基上，覆蓋質(zhì)量濃度為的度為的1mg/mlCR溶液，溶液，10-15min后，后，倒去倒去CR溶液，溶液，加入加入物質(zhì)的量濃度為物質(zhì)的量濃度為1mol/lNaCl的溶液，的溶液，15min后倒掉溶液，后倒掉溶液，此時此時產(chǎn)生纖維素酶的菌落產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍出現(xiàn)周圍出現(xiàn)透透明圈明圈。方法一方法一：先先培養(yǎng)培養(yǎng)微生物，微生物，再加入再加入剛果紅進剛果紅進行顏色反應行顏色反應配配置質(zhì)量濃度為置質(zhì)量濃度為10mg/ml的的CR溶液，滅溶液，滅菌后，按照每菌后，按照每200ml培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基加入1ml比比例例加入加入CR溶液，混勻后溶液，混勻后倒平板倒平板。等培。等培養(yǎng)基上出菌落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌

12、養(yǎng)基上出菌落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)明顯的透明圈。落周圍將會出現(xiàn)明顯的透明圈。方法二方法二：在：在倒平板倒平板時就加入剛果紅時就加入剛果紅NaCl溶液的作用：溶液的作用： 漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。清晰。方法一（后加剛果紅）：方法一（后加剛果紅）：優(yōu)點：優(yōu)點：方法二（前加前剛果紅）：方法二（前加前剛果紅）：顯示出顏色反應基本上是纖維素分顯示出顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用解菌的作用缺點：缺點：操作繁瑣，加入剛果紅會使菌落操作繁瑣，加入剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜之間發(fā)生混雜操作簡便，

13、不存在菌落混雜問題操作簡便，不存在菌落混雜問題缺點：缺點：優(yōu)點：優(yōu)點：四、操作提示四、操作提示1、本課題中涉及的生物技術主要有：、本課題中涉及的生物技術主要有：培養(yǎng)基的配置、無菌操作技術、培養(yǎng)基的配置、無菌操作技術、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用，土壤取樣的作用，土壤取樣2、選擇培養(yǎng)的操作方法、選擇培養(yǎng)的操作方法五、五、結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價2、培養(yǎng)基制作合格：、培養(yǎng)基制作合格：未接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有未接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，則說明培養(yǎng)基制作合格。菌落生長，則說明培養(yǎng)基制作合格。選擇培養(yǎng)基篩選出菌落：選擇培養(yǎng)基篩選出菌落：實驗組培養(yǎng)基上，

14、若觀察到產(chǎn)生透明圈的實驗組培養(yǎng)基上，若觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能是纖維素分解菌。菌落，則說明可能是纖維素分解菌。 3 3、分離的結(jié)果是否一致、分離的結(jié)果是否一致由于在土壤中細菌的數(shù)量遠由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。因此最容易分離得到的是細菌。但但由于所取土樣的環(huán)境不同由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放不同同學也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。線菌等不同的分離結(jié)果。原因：形成的菌落若跟其他菌落混雜，原因：形成的菌落若跟其他菌落混雜，產(chǎn)生透明圈的菌落產(chǎn)生透明圈的菌落也可能是也可能是產(chǎn)生淀粉酶產(chǎn)生

15、淀粉酶的微生物的微生物，還可能是，還可能是降解剛果紅的菌種降解剛果紅的菌種形成的形成的，本課題對分解纖維素的微生物本課題對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選，但是這只是分離純進行了初步的篩選，但是這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖維素分化的第一步。為確定得到的是纖維素分解菌，解菌，因此需進一步鑒定。因此需進一步鑒定。在剛果紅培養(yǎng)基上在剛果紅培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明圈出現(xiàn)透明圈，該透，該透明圈明圈一定一定是由是由纖維素分解菌纖維素分解菌形成嗎？形成嗎？不一定。不一定。六、六、鑒定鑒定纖維素分解菌纖維素分解菌 需要進行需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗（的實驗（通過通過微生物微生物發(fā)酵發(fā)酵，看能否，看能否產(chǎn)生纖維素酶。產(chǎn)生纖維素酶。若發(fā)若發(fā)酵物中有纖維素酶，則菌種是纖維素分解酵物中有纖維素酶，則菌種是纖維素分解菌菌 ）發(fā)酵的方法分為發(fā)酵的方法分為固體發(fā)酵固體發(fā)酵和和液體發(fā)酵液體發(fā)酵。1、鑒定原理、鑒定原理：2、鑒定方法：、鑒定方法：采用對采用對纖維素酶纖維素酶分解濾紙等分解濾紙等纖維素纖維素后所產(chǎn)后所產(chǎn)生的生的葡萄糖葡萄糖進行定量的測定，來鑒定纖維進行定量的測定，來鑒定纖維素酶的產(chǎn)生。素酶的產(chǎn)生。 因為因為葡萄糖葡萄糖在在50600 0C C的的Cu(OH)2溶液溶液中加熱中加熱1-2 min，可形成，可形成