醫(yī)院制劑質量標準起草說明模版

1、3.6.4 微生物限度3.6.4.1 方法驗證材料與依據(jù)3.6.4.1 1 供試品：參榆灌腸液規(guī)格：XXX生產(chǎn)企業(yè)：江蘇省XXX醫(yī)院 批號:111212 111214 111215 3.6.4.1.2 培養(yǎng)基：1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 批號：110512 廠家：XXX2玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 批號：1105172 廠家：XXX3營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 批號：110126 廠家：XXX4膽鹽乳糖培養(yǎng)基 批號：110408 廠家：XXX5MUG培養(yǎng)基 批號：110203 廠家：XXX3.6.4.1.3稀釋劑: pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 500ml/瓶,批號：2011032801(如緩沖液為市場購買，需寫明生產(chǎn)

2、企業(yè))3.6.4.1.4 菌種：菌種名稱編號來源傳代次數(shù)大腸埃希菌( Escherichia coli)CMCC（B）44102南京市藥檢所第3代金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMCC（B）26003南京市藥檢所第3代銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)CMCC（B）10104南京市藥檢所第3代枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501南京市藥檢所第3代白色念珠菌(Candida albicans)CMCC（F）98001南京市藥檢所第3代黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC（F）9800

3、3南京市藥檢所第3代3.6.4.1.5 驗證依據(jù)：中國藥典2010年版二部附錄XI J微生物限度檢查法方法驗證。3.6.4.2 驗證實驗操作根據(jù)中國藥典2010年版二部附錄微生物限度檢查法方法，采用常規(guī)法（如常規(guī)法回收率未達70%，需采用培養(yǎng)基稀釋法重新進行驗證；如培養(yǎng)基稀釋法回收率仍未達70%，可采用薄膜過濾法再次進行驗證）對細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證?？刂凭鷻z查方法采用常規(guī)法（若陽性未生長采用培養(yǎng)基稀釋法或薄膜過濾法），從而建立該樣品的微生物限度檢查方法。3.6.4.2.1菌液制備方法： 1.接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置

4、350C培養(yǎng)24小時，分別取上述培養(yǎng)物1ml加9ml 0.9的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。2.接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置250C培養(yǎng)48小時，取上述培養(yǎng)物1ml加9ml 0.9的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,置250C培養(yǎng)7天，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9的無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，并吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9的無菌氯化鈉制成每1ml含孢子數(shù)為501

5、00cfu的孢子懸液。3.6.4.2.2 供試液制備：取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml,混均,作為1：10供試液。3.6.4.3 菌落計數(shù)方法的驗證3.6.4.3.1 平皿法：（常規(guī)法）試驗組：取1：10供試液1ml，分別加入10個平皿中，再依次加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種菌的菌懸液1ml(含50100cfu)，每株菌平行制備2個平皿，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，分別置350C培養(yǎng)48小時和250C培養(yǎng)72小時。菌液組：分別取上述稀釋的菌液1ml注入平皿內，每個菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。供試品

6、對照組：取1：10供試液1ml分別注入4個平皿中，立刻注入營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基制備2個平皿，分別置350C培養(yǎng)48小時和250C培養(yǎng)72小時。以測定供試品的本底菌數(shù)。上述方法平行實驗3次結果見表1 表1.參榆灌腸液細菌.霉菌和酵母菌回收率的測定（平皿法）菌種類型試驗次數(shù)試驗組菌液組供試品對照組回收率（%）試驗組大腸埃希菌14749095.9265620100361560100金 黃 色葡萄球菌13633010024445097.8345410100枯草芽孢桿 菌13842090.524750094.036267092.5白色念珠菌14548083.323539089.735

7、055090.9黑曲霉13438089.522731087.132829096.6試驗組菌回收率(%)由表1可見參榆灌腸液用平皿菌落計數(shù)法，三次平行試驗大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌落回收都達到了70%，說明常規(guī)平皿法用于參榆灌腸液計數(shù)結果是準確的。備注：如采用常規(guī)平皿法菌落回收率都達到70%，則細菌、霉菌和酵母菌的計數(shù)方法驗證即可完成，但如常規(guī)法一種或幾種菌回收率三次均低于70%，需采用培養(yǎng)基稀釋法重新進行試驗，具體操作如下：若細菌回收率低于70%則細菌數(shù)計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌回收率低于70%則霉菌酵母菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，二者均低于70%則同時采用培

8、養(yǎng)基稀釋法。驗證資料中需體現(xiàn)常規(guī)法及培養(yǎng)基稀釋法兩種驗證方法及結果。3.6.4.3.2 平皿法：（培養(yǎng)基稀釋法）試驗組：取1：10供試液0.2ml及各試驗用菌液1ml分別注入平皿中，每種試驗菌平行制備10個平皿，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，細菌350C培養(yǎng)48小時，霉菌及酵母菌250C培養(yǎng)72小時。菌液組：分別取上述稀釋的菌液1ml注入平皿內，每個菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。供試品對照組：取1：10供試液0.2ml分別注入20個平皿中，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基制備10個平皿，分別置350C培養(yǎng)48小時和250C培養(yǎng)72小時。以測定供試品的本底

9、菌數(shù)。 上述方法平行實驗3次結果見表2 表2.參榆灌腸液細菌.霉菌和酵母菌回收率的測定（培養(yǎng)基稀釋法）菌種類型試驗次數(shù)試驗組菌液組供試品對照組回收率（%）試驗組大腸埃希菌14749095.9265620100361560100金 黃 色葡萄球菌13633010024445097.8345410100枯草芽孢桿 菌13842090.524750094.036267092.5白色念珠菌14548083.323539089.735055090.9黑曲霉13438089.522731087.132829096.6試驗組菌回收率(%)由表2可見參榆灌腸液用培養(yǎng)基稀釋法，三次平行試驗大腸埃希菌、金黃色葡萄

10、球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌落回收都達到了70%，說明培養(yǎng)基稀釋法用于參榆灌腸液計數(shù)結果是準確的。備注：如培養(yǎng)基稀釋法回收率仍低于70%，采用薄膜過濾法再次進行試驗。驗證資料中需體現(xiàn)常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過濾法三種驗證方法及結果。具體操作如下：3.6.4.3.3 薄膜過濾法：供試液制備：取1：10供試液10ml放入離心管中，將離心管放入離心機，500轉/min離心3分鐘，取上清液。（注：僅細菌計數(shù)可用低速離心，霉菌及酵母菌計數(shù)不可采用。）試驗組：取1：10上述供試液1ml加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100ml稀釋過濾，用400ml（備注：具體用量依樣品抑菌作用強弱而定

11、，在試驗中需設計不同的沖洗量進行沖洗，根據(jù)回收率的情況選擇不同的沖洗量）pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100ml，在最后一次沖洗液中分別加入試驗用菌液1ml，過濾后無菌方法取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂平板上，細菌350C培養(yǎng)48小時，霉菌及酵母菌250C培養(yǎng)72小時。菌液組：分別取上述稀釋的菌液1ml注入平皿內，每個菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)。供試品對照組：取1：10供試液1ml采用上述薄膜過濾法沖洗過濾，分別置350C培養(yǎng)48小時和250C培養(yǎng)72小時。以測定供試品的本底菌數(shù)。 上述方法平行實驗3次結果見表3 表3.參榆灌腸液細菌.霉菌和酵母菌回

12、收率的測定（薄膜過濾法）菌種類型試驗次數(shù)試驗組菌液組供試品對照組回收率試驗組大腸埃希菌14749095.9265620100361560100金 黃 色葡萄球菌13633010024445097.8345410100枯草芽孢桿 菌13842090.524750094.036267092.5白色念珠菌14548083.323539089.735055090.9黑曲霉13438089.522731087.132829096.6試驗組菌回收率(%)由表3可見參榆灌腸液用薄膜過濾法，三次平行試驗大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌落回收都達到了70%，說明薄膜過濾法用于參榆

13、灌腸液計數(shù)結果是準確的。3.6.4.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法的驗證3.6.4.4.1 直接接種法（1）試驗組： 取1：10的供試液10ml，接種至100ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內，加入49cfu大腸埃希菌,350C培養(yǎng)24小時，可見培養(yǎng)基混濁，有氣體產(chǎn)生。取上述培養(yǎng)物0.2ml接種至5mlMUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)5小時、24小時，在366nm紫外線下觀察，可見熒光反應，滴加靛基質試液，液面呈玫瑰紅色.（2）陰性菌對照組：取1：10的供試液10ml，接種至100ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內，加入33cfu金黃色葡萄球菌, 350C培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)基無混濁與氣體產(chǎn)生。取上述培養(yǎng)液0.2m

14、l接種至5mlMUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)5小時、24小時，在366nm紫外線下觀察，無熒光反應，滴加靛基質試液，液面均呈試劑本色。 上述方法試驗組檢出了大腸埃希菌，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌。說明用100ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基可以進行參榆灌腸液大腸埃希菌檢查。備注：試驗中若100ml陽性對照未生長，則加大膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基用量，分別作200ml、300ml，方法同以上方法。3.6.4.4.2 薄膜過濾法若直接接種法加大培養(yǎng)基用量陽性對照仍無法檢出，則采用薄膜過濾法：（1）試驗組： 取1：10的供試液10ml，用離心機低速離心500r/min離心3分鐘，取上清液定容至10ml，加入pH7.

15、0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100ml薄膜過濾，用400ml（備注：具體用量依樣品抑菌作用強弱而定，在試驗中需設計不同的沖洗量進行沖洗，根據(jù)回收率的情況選擇不同的沖洗量）pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100ml，過濾后無菌方法取出濾膜，接種至100ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內，加入49cfu大腸埃希菌,350C培養(yǎng)24小時，可見培養(yǎng)基混濁，有氣體產(chǎn)生。取上述培養(yǎng)物0.2ml接種至5mlMUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)5小時、24小時，在366nm紫外線下觀察，可見熒光反應，滴加靛基質試液，液面呈玫瑰紅色.（2）陰性菌對照組：取1：10的供試液10ml，用離心機低速離心500r/m

16、in離心3分鐘，取上清液定容至10ml，加入pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100ml薄膜過濾，用400ml（注：具體用量依樣品抑菌作用強弱而定）pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100ml，過濾后無菌方法取出濾膜，接種至100ml的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內，加入33cfu金黃色葡萄球菌, 350C培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)基無混濁與氣體產(chǎn)生。取上述培養(yǎng)液0.2ml接種至5mlMUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)5小時、24小時，在366nm紫外線下觀察，無熒光反應，滴加靛基質試液，液面均呈試劑本色。上述方法試驗組檢出了大腸埃希菌，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌，說明用100ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基可以進行參榆灌腸液大腸埃希菌檢查。備注：如制劑中含生藥，需增加大腸菌群檢查驗證試驗；如制劑中含動物藥，需增加沙門菌檢查驗證方法；如制劑為外用藥，需增加金黃色葡萄球菌、銅綠桿菌檢查驗證方法，每個品種具體要求見中國藥典2010年版附錄。其他控制菌檢查常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法方法同上述大腸埃希菌檢查方法，需使用相應增菌及分離培養(yǎng)基