(完整版)南京林業(yè)大學(xué)酶工程期末考試重點(diǎn)生物技術(shù)專業(yè)

1、1、 酶的特點(diǎn)和米氏方程式的推導(dǎo)。酶是生物體內(nèi)進(jìn)行新陳代謝不可缺少的受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。酶催化作用特點(diǎn)：（一）酶和一般催化劑的共性：用量少而催化效率高；不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點(diǎn)；可降低反應(yīng)的活化能。（二）酶作為生物催化劑的特點(diǎn)：用量少而催化效率高；專一性高；反應(yīng)條件溫和；可調(diào)節(jié)性。2、米氏常數(shù)的測(cè)定和意義。答： 測(cè)定： 基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于 y=ax+b 的直線方程，再用作圖法求出 Km 。意義： 當(dāng) v=Vmax/2 時(shí)， Km=s（Km 的單位為濃度單位） 。是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，通過測(cè)定Km的數(shù)值，可鑒別酶?？山票硎久负偷孜镉H和力，Km愈小

2、，E對(duì)S的親和力愈大；Km愈大，E對(duì)S的親和力愈小。在已知Km的情況下，應(yīng)用米氏方程可計(jì)算任意S 時(shí)的 V ，或任意 V 下的 S （用Km 的倍數(shù)表示） 。3、可逆抑制的種類和判別。答： 競(jìng)爭性抑制： 某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似， 因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。 當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后， 底物被排斥在反應(yīng)中心之外， 其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。特點(diǎn)： Km 變大，酶促反應(yīng)速度減??； 非競(jìng)爭性抑制： 酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化， 并導(dǎo)至酶活性下降。 由于這類物質(zhì)并不是與底物競(jìng)爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競(jìng)爭性抑制劑。 特點(diǎn)： Km 雖然不變，但由于Vmax 減小，

3、所以酶促反應(yīng)速度也下降了； 反競(jìng)爭性抑制： 抑制劑僅能與酶底物復(fù)合物結(jié)合，但ESI 不能轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物 P 。特點(diǎn)： Km 變小， Vmax 減小，斜率不變。4、酶的分類和命名。答：分類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶。系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。推薦名：只取一個(gè)較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。對(duì)于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。酶系統(tǒng)編號(hào)： 采用四碼編號(hào)方法， 第一個(gè)號(hào)碼表示該酶屬于6 大類酶中的某一大類， 第二個(gè)號(hào)碼表示該酶屬于該大類中的某一亞類， 第三個(gè)號(hào)碼表示屬于亞類中的某一小類， 第四個(gè)號(hào)碼表示這一具體的酶在該小類中的序號(hào)。每個(gè)號(hào)碼之間用圓點(diǎn)（.）

4、分開。5、酶活單位和酶活測(cè)定。答：酶活單位： 酶活單位U ： 在一定條件下， 一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 （濃度/時(shí)間）國際酶活力單位IU ： 在最適條件下，每分鐘內(nèi)催化 1umol 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1972 年定為 1kat 單位： 每秒鐘能催化 1mol 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。1kat=60x 106IU。酶的比活力：用每mg蛋白質(zhì)所含酶活力單位數(shù)，比活愈大，純度愈高。比活力=酶活力 U/mgPr=總活力U/總蛋白mg酶活力測(cè)定的步驟：根據(jù)酶催化的專一性，選擇適宜的底物，并配制成溶液。根據(jù)酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)， 確定酶催化反應(yīng)的溫度PH 值、 底物濃度、 激活

5、劑濃度等反應(yīng)條件。在一定的條件下，將一定量的酶液和底物溶液混合均勻，反應(yīng)時(shí)間。運(yùn)用各種生化檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。注意：若不能即時(shí)測(cè)出結(jié)果的，則要及時(shí)終止反應(yīng)，然后再測(cè)定。6、酶活性中心的定義和部位。答： 酶活性中心： 酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定區(qū)域，也就是說，只有少數(shù)特異的氨基酸殘基參與底部結(jié)合及催化作用。 這些特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域， 即與酶活力直接相關(guān)的區(qū)域，稱為酶的活性部位或活性中心?；钚圆课唬?通常分為結(jié)合部位和催化部位， 前者負(fù)責(zé)與底物的結(jié)合， 決定酶的專一性；后者負(fù)責(zé)催化底物鍵的斷裂形成新鍵， 決定酶的催化能力。 對(duì)需要輔酶的酶來說， 輔酶分子

6、或輔 酶分子上的某一部分結(jié)構(gòu)，往往也是酶活性部分組成部分。 7、影響酶催化作用的有關(guān)因素。 答： 底物濃度： 在低底物濃度時(shí), 反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax ） ，此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。PH:在一定的pH下，酶具有最大的催化活性,通常稱此pH 為最適 pH ； pH 穩(wěn)定性。 溫度： 一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快；另一方面,溫度升高,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失；因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。 在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。酶濃度： 在

7、一個(gè)反應(yīng)體系中，當(dāng) S>>E 反應(yīng)速率隨酶濃度的增加而增加（ v=kE ） ,這是酶活測(cè)定的基礎(chǔ) 之一。抑制劑；激活劑。 8、影響酶催化效率的有關(guān)因素 答： （一） 底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)： 酶和底物復(fù)合物的形成過程既是專一性的識(shí) 別過程， 更重要的是分子間反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)的過程。 這一過程包括： 鄰近效應(yīng)和定向效 應(yīng)。 鄰近效應(yīng) 是指酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物后，使底物和底物（如雙分子反應(yīng)）之間， 酶的催化基團(tuán)與底物之間結(jié)合于同一分子而使有效濃度得以極大的升高， 從而使反應(yīng)速率大 大增加的一種效應(yīng)。 定向效應(yīng) 是指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間和酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán) 之間的

8、正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。 （二）底物的形變和誘導(dǎo)契合： 當(dāng)酶遇到其專一性底物時(shí)，酶 中某些基團(tuán)或離子可以使底物分子內(nèi)敏感鍵中的某些基團(tuán)的電子云密度增高或降低，產(chǎn)生“電子張力 ” ，使敏感鍵的一端更加敏感，底物分子發(fā)生形變， 底物比較接近它的過渡態(tài) ，降 低了反應(yīng)活化能，使反應(yīng)易于發(fā)生。 （三）酸堿催化： 酸堿催化是通過瞬時(shí)的向反應(yīng)物提供 質(zhì)子或從反應(yīng)物接受質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)， 加速反應(yīng)的一類催化機(jī)制。 在水溶液中通過高反應(yīng) 性的質(zhì)子和氫氧離子進(jìn)行的催化稱為 專一的酸堿性催化或狹義的酸堿催化； 而通過 H+ 和 OH-以及能提供H+和OH-供體進(jìn)行的催化稱為總酸堿催化或廣義的酸堿催化。（四） 共價(jià)催化

9、： 共價(jià)催化又稱親核催化或親電子催化， 在催化時(shí)， 親核催化劑或親電子催化劑能分別 放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負(fù)電中心， 迅速形成不穩(wěn)定的共價(jià)中間復(fù) 合物，降低反應(yīng)活化能，使反應(yīng)加速。 （五）金屬離子催化： 金屬離子以3 種主要途徑參加催化過程（ 1）通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向； （ 2 ）通過可逆的改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化 還原反應(yīng)； （ 3）通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負(fù)電荷。 （六）多元催化和協(xié)同效應(yīng)（七）活性部位微 環(huán)境的影響 9、簡述胰凝乳蛋白酶的催化反應(yīng)機(jī)制。 答：胰凝乳蛋白酶選擇裂解芳香族氨基酸如象Phe、 Tyr 羧基側(cè)鏈。其活性中心由 Ser195、His57 和 A

10、sp102 組成。在胰凝乳蛋白酶的催化反應(yīng)中，組氨酸的咪唑基起著廣義酸堿催化劑 的作用，先促使Ser195 的羥基親核地附著到底物敏感肽鍵中的羧基原子上，形成共價(jià)的?；虚g物，在促進(jìn)?；?ES 中間物上的?；D(zhuǎn)移到水或其他的?；荏w（如醇、氨基 酸等）上。絲氨酸三殘基（包括天冬氨酸和組氨酸）構(gòu)成的活性中心的一部分。組氨酸極化Ser側(cè)鏈的羥基（去質(zhì)子）。底物存在時(shí)，His57側(cè)鏈接受Se95側(cè)鏈羥基 的質(zhì)子。因此His57是堿催化劑。Ser195丟失氫離子，產(chǎn)生烷基氧離子。烷基氧離子的親核 性比羥基大得多。 Asp102 協(xié)助 His57 定位， 通過氫鍵和靜電相互作用使His57 更能接受

11、Ser195的質(zhì)子。 10、酶活性的調(diào)節(jié)控制。 答：一、調(diào)節(jié)酶的濃度；二、通過激素調(diào)節(jié)酶活性；三、反饋抑制調(diào)節(jié)酶活性；四、抑制劑 和激活劑對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)；五、其他調(diào)節(jié)方式：通過別構(gòu)調(diào)控、酶原的激活、酶的可逆共價(jià)修飾和同工酶來調(diào)節(jié)酶的活性。11、協(xié)同效應(yīng)：正協(xié)同效應(yīng)：底物或調(diào)節(jié)物的結(jié)合大大增加了酶對(duì)后續(xù)底物分子的親核性。（S型曲線）負(fù)協(xié)同效應(yīng)：底物濃度較小的范圍內(nèi)，酶活力上升很快，隨后底物濃度雖有較大提高，但反應(yīng)速率升高很小，表現(xiàn)為負(fù)協(xié)同。（表現(xiàn)雙曲線）同工酶：是指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、 理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)：酶分子的非催化部位與某些化合

12、物可逆地非共價(jià)結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象的改 變，進(jìn)而改變酶活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)。1、寫出谷氨酸發(fā)酵的最理想途徑，說明 CO2固定化反應(yīng)的重要性。答：途徑：葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP途徑）和己糖磷酸支路（HMP途徑）生成丙酮酸，再氧 化成乙酰輔酶 A （乙酰COA）,然后進(jìn)入三竣酸循環(huán)，生成“酮戊二酸。a酮戊二酸在 谷氨酸脫氫酶的催化及有 NH4+存在的條件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸的生物合成途徑包 括EMP、HMP、TCA循環(huán)、DCA循環(huán)和CO2固定作用等。重要性：體系中如果不存在 CO2固定反應(yīng)，則有：3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + 4 CO2 產(chǎn)率：147 / （1

13、80*3/2 ） = 54.4% 體系中存在CO2固定反應(yīng)，則有：C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + CO2 產(chǎn)率：147 / 180 = 81.7%可見，在GA的生物合成過程中，CO2固定反應(yīng)對(duì)于產(chǎn)率的提高有著多么重要的作用。實(shí)際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二竣酸完全來自于 CO2固定反應(yīng)，體系也不可能完全不存在 CO2固定反應(yīng)，因此，GA發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應(yīng)在：54.4%-81.7%。2、谷氨酸產(chǎn)生菌之所以能夠合成、積累并分泌大量的GA,其菌種內(nèi)在的原因有哪些？答：生物素缺陷型：谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型，谷氨酸發(fā)酵時(shí)，通過控制生物素亞適量（貧乏量）

14、，引起菌種代謝失調(diào)，使谷氨酸得到大量積累。具有CO2固定反應(yīng)的酶系： 菌種能利用CO2產(chǎn)生大量草酰乙酸，有利于谷氨酸的大量積累。a-KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失：體內(nèi)a -KGA脫氫酶活性很低時(shí)，TCA循環(huán)才能夠停止，a-KGA才得以積累， 為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失：NADPH 是a -KGA還原氨基化生成 GA必須物質(zhì)，而且該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫竣相偶聯(lián)的;由于NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定的積累，NADPH對(duì)于抑制a -KGA的脫竣氧化有一定的意義。產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶

15、 一一異檸檬酸裂解酶：該酶是一種調(diào)節(jié)酶，或稱為別構(gòu)酶，其活性可以通過某種方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過該酶酶活性的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，DCA循環(huán)的封閉是實(shí)現(xiàn)GA發(fā)酵的首要條件。糖的代謝才能沿著a-酮戊二酸的方向進(jìn)行，從而有利于谷氨酸的積累。 菌體有強(qiáng)烈的L-谷氨酸脫氫酶活性：a-KGA + NH4+ +NADPH = GA +NADPL-谷氨酸脫氫酶，實(shí)質(zhì)上 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強(qiáng)，a一酮戊二酸易生成谷氨酸。該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫竣氧化相偶聯(lián)。3、谷氨酸發(fā)酵過程中，生物素（ Vh）作用表現(xiàn)在那幾個(gè)方面？答：GA產(chǎn)生菌大都是生物素的營養(yǎng)缺陷型，即： VH-o 生物素對(duì)發(fā)酵的影響是全面的

16、，在發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制其濃度。（一）生物素對(duì)糖代謝的影響：VH對(duì)于糖酵解有促進(jìn)作用；對(duì)丙酮酸的有氧氧化一一 乙酰輔酶A的生成也有促進(jìn)作用。這樣培養(yǎng)基中如果有較豐富的VH,就會(huì)打破糖酵解與丙酮酸氧化之間的平衡，導(dǎo)致丙酮酸的積累，丙酮酸積累則可能導(dǎo)致乳酸的 形成，乳酸生成，則使得碳源利用率降低，而且?guī)淼氖前l(fā)酵液的pH值下降。另一方面，可以通過控制 VH的濃度，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于乙醛酸循環(huán)的封閉。（2） 生物素對(duì)氮代謝的影響： 當(dāng) VH 缺乏時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性減弱；當(dāng) VH 豐富時(shí)，異檸檬酸裂解酶的活性必然加強(qiáng)。 GA 發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成

17、期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。（3） 生物素對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響： 谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH- ，而 VH 又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過控制 VH 的濃度，來實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)。 VH 對(duì)細(xì)胞膜合成的影響主要是通過對(duì)細(xì)胞膜的主要成分 磷脂中的脂肪酸的生物合成來實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)限制了菌體脂肪酸的合成時(shí)，細(xì)胞就會(huì)形成 一個(gè)細(xì)胞膜不完整的菌體。4、生物素（VH ）如何封閉乙醛酸循環(huán)的？答：乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶， 研究表明， 該酶受以下幾個(gè)因素的影響： 為醋酸誘導(dǎo)；受琥珀酸阻遏。當(dāng) VH 缺乏時(shí)：（ 1 ）丙酮酸的有氧氧化就會(huì)減弱（由于VH

18、對(duì) TCA 循環(huán)的促進(jìn)作用），則：乙酰輔酶A 的生成量就會(huì)少，醋酸濃度降低，它的誘導(dǎo)作用降低；（ 2 ） VH 對(duì) TCA 循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強(qiáng)；兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失， DCA 循環(huán)得到封閉。5、抗生素的定義、種類和作用機(jī)制。答： 定義： 抗生素是某些細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，或用化學(xué)方法合成的相同化合物或結(jié)構(gòu)類似物， 在低濃度下對(duì)各種病原性微生物或腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)力殺滅作用或有其他藥理作用的藥物。作用機(jī)制：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成（ B內(nèi)酰胺類、磷霉素、萬古霉素）；抑制細(xì)菌蛋 白質(zhì)

19、合成（四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖昔類、氯霉素類）；抑制細(xì)菌 DNA合成（利福平）；抑制細(xì)菌RNA合成（放線菌素）；損傷細(xì)菌細(xì)胞膜（兩性霉素B、粘菌素、氨基糖苷類） 。6、青霉素生產(chǎn)菌種、生物合成途徑、前體物質(zhì)及其的作用。答： 目前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種， 根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌。前體物質(zhì)： 前體是抗生素分子的前身或其組成的一部分， 直接參與抗生素的生物合成而自身無顯著變化。在一定條件下，加入前體可控制抗生素的合成方向，并增加產(chǎn)量。如：在青霉素 G 的生產(chǎn)中常加入苯乙酸或苯乙酰胺作為前體；在紅霉素

20、生產(chǎn)中添加丙酸、丙醇鹽作為前體。但前體一般對(duì)生產(chǎn)菌有一定的毒性。7、為什么與葡萄糖相比，乳糖是生產(chǎn)青霉素的最好碳源？8、乳酸發(fā)酵機(jī)理的種類和合成途徑。答：種類：同型乳酸發(fā)酵：發(fā)酵產(chǎn)物只有乳酸的一種發(fā)酵。產(chǎn)能途徑為EMP途徑。同型乳酸發(fā)酵的特點(diǎn)： 1mol 的 G 產(chǎn)生 2mol 乳酸，理論轉(zhuǎn)化率是100%。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。異型乳酸發(fā)酵：發(fā)酵產(chǎn)物除乳酸外還有一些乙醇、乙酸和CO2。是同型或異型決定于菌種特性并與發(fā)酵條件關(guān)系密切 。 此過程 1mol 己糖生成 1mol 乙醇、 lmol 二氧化碳和 1mol 乳酸。 乳酸對(duì)糖轉(zhuǎn)化率50 。 另外有比例較高的乙醇、 乙酸和二氧

21、化碳等。9、細(xì)菌和根霉發(fā)酵乳酸的優(yōu)劣比較。10、檸檬酸和乳酸鈣鹽法提取工藝流程的差別。11、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑。12、檸檬酸發(fā)酵過程中，錳缺乏為何會(huì)是銨根離子濃度升高呢？答： 當(dāng)培養(yǎng)基中 Mn+ 缺乏時(shí)， NH4+ 濃度升高，同時(shí)微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（ GA 谷氨酸、 Arg 、 Gin 谷氨酰胺等） ，這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會(huì)升高之。13、檸檬酸溢出代謝的原因。答：引起檸檬酸溢出代謝的原因包括以下三個(gè)方面：（一）高水平的檸檬酸合成能力。這個(gè)能力由 3 個(gè)因素構(gòu)成。第一：是在有高濃度草酰

22、乙酸（ OAA ）的情況下對(duì)A c C o A具有高度親和力的組成型的 檸檬酸合成酶（CS）的存在；第二：是催化丙酮酸（PYR）固定CO 2生成草酰乙酸反 應(yīng)的高水平的組成型的丙酮酸竣化酶（PC）的存在；第三：是在缺少鎰的條件下，蛋白質(zhì) 分解或蛋白質(zhì)合成受阻造成的鏤的高濃度能解除檸檬酸（CTA）對(duì)磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，檸檬酸的分泌，降低其胞內(nèi)濃度。（二）較低的降解檸檬酸的能力。這個(gè)能力由兩個(gè)因素構(gòu)成。第一：是低水平的a一酮戊二酸脫氫酶（ KD）影響TCA環(huán)運(yùn)行的暢通程度，使 TCA環(huán)前 半部的中間產(chǎn)物積壓； 第二： 在錳缺乏的條件下， 順烏頭酸酶（AE ） 和異檸檬酸脫氫酶（ I

23、D ）的活性降低，從而使檸檬酸的累積比其他幾種酸（順烏頭酸、異檸檬酸和a一酮戊二酸）更明顯。（三） 在檸檬酸過量合成階段， 培養(yǎng)基的 PH 值顯然會(huì)影響細(xì)胞膜對(duì)目的產(chǎn)物檸檬酸的跨膜輸送；檸檬酸的分泌也會(huì)影響培養(yǎng)基的 PH 值。錳與鐵的缺乏有利于檸檬酸的排出。14、高產(chǎn)檸檬酸菌株的生理或形態(tài)特征。答：一般高產(chǎn)檸檬酸的菌株都具有一定的生理或形態(tài)特征。對(duì)于黑曲霉其主要特征有：在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長不太好，形成的菌落較小，形成抱子的能力也較弱；能耐受高濃度的葡萄糖并產(chǎn)生大量酸性a一淀粉酶和糖化酶，即使在低PH下兩種酶仍具有大部分活力；能耐高濃度檸檬酸，但不能利用和分解檸檬酸；能抗微量金屬離子

24、，特別是抗鎰、鋅、銅、鐵等金屬離子；在搖瓶和深層液體培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生大量細(xì)小的菌絲球；具有旁系呼吸鏈活性，利用葡萄糖時(shí)不產(chǎn)生或少產(chǎn)生ATP。15、 TCA 循環(huán)在檸檬酸積累中的調(diào)節(jié)及中間物回補(bǔ)途徑。答： 調(diào)節(jié)： 大量生產(chǎn)草酰乙酸是積累檸檬酸的關(guān)鍵； 丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調(diào)節(jié)的控制或極微弱； TCA循環(huán)的阻斷或微弱（即順烏頭酸酶、異檸檬酸脫 氫酶和a一酮戊二酸脫氫酶活力降低），導(dǎo)致檸檬酸積累。而且，當(dāng)檸檬酸濃度超過一定水 平，就抑制異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累?；匮a(bǔ)途徑： TCA 循環(huán)重要功能除產(chǎn)能外，為一些氨基酸和其他化合物的合成提供了中間產(chǎn)物?；匮a(bǔ)方式：通過某些化合物的

25、CO2固定作用；轉(zhuǎn)氨基作用：一些轉(zhuǎn)氨基酶所催化的反應(yīng)也能合成草酰乙酸和a一酮戊二酸；轉(zhuǎn)氨基作用的定義：a氨基酸的氨基通過酶的催化，轉(zhuǎn)移到a一酮酸的酮基上，生成相應(yīng)的氨基酸；原來的a氨基酸則轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的a一酮酸；通過乙醛酸循環(huán)。17、說明檸檬酸發(fā)酵過程中氧的重要性。答：乙酰 CoA 和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過程中要引進(jìn)一個(gè)氧原子（H 2O） ，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對(duì)檸檬酸發(fā)酵的作用為：氧是發(fā)酵過程生成的NADH重新氧化的氫受體；近來的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有 一條標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈以外，還有一條側(cè)系呼吸鏈。當(dāng)缺氧時(shí)，只要很短時(shí)間中斷供氧，就會(huì)導(dǎo)致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導(dǎo)致檸檬

26、酸產(chǎn)酸急劇下降。18、簡述二氧化碳固定反映對(duì)于提高檸檬酸產(chǎn)率的意義。答：通過CO2固定反應(yīng)提供C4二竣酸192 / 180 = 106.6%C6H8O7 C6H12O6 （C 沒有增加）可見，CO2固定反應(yīng)堆與檸檬酸發(fā)酵的重要性。19、繪制薯干粉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的工藝流程。20、并行發(fā)酵，側(cè)系呼吸鏈，同性發(fā)酵，抗生素，液化，理論轉(zhuǎn)化率。答：側(cè)系呼吸鏈：NAD （P） H經(jīng)過該呼吸鏈，可以正常的傳遞氫離子，將其氧化為H2O,但是并沒有氧化磷酸化生成 ATP。能夠正常產(chǎn)生 ATP的呼吸鏈稱之為標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈?？股兀嚎股厥悄承┘?xì)菌、 放線菌、真菌等微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，或用化學(xué)方法合成的 相同化合物或

27、結(jié)構(gòu)類似物，在低濃度下對(duì)各種病原性微生物或腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)力殺滅作用或有 其他藥理作用的藥物。21、酶的提取、分離純化技術(shù)路線及方法。22、酶提取的目標(biāo)和原則。答：目標(biāo)：將目的酶最大限度的溶解出來；保持生物活性。原則：相似相溶；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的 PH值，溶解度增加。23、鹽析沉淀的原理是什么？分段鹽析的類型和常用鹽析劑。答：鹽析沉淀（改變離子強(qiáng)度）是利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離的過程。鹽溶：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分

28、子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。分段鹽析的類型：Ks分段鹽析法和B分段鹽析。Ks分段鹽析法：在一定的PH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。B分段鹽析：在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱腜H及溫度的沉淀方法。常用的鹽析用鹽：硫酸錢、硫酸鈉、磷酸鹽、檸檬酸鹽。24、根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同，過濾分為？根據(jù)推動(dòng)力不同膜分離分為？ 答：類別截留的顆粒大小主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2um酵母、霉菌、動(dòng)植物細(xì)胞、 固形物濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷微濾0.22um細(xì)菌、灰塵微濾膜超濾20A0.2um病毒、生物大分子超濾膜反滲透&l

29、t;20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜根據(jù)推動(dòng)力不同膜分離分為：加壓膜分離、電場(chǎng)膜分離、擴(kuò)散膜分離。25、常用的層析方法有幾種，各分離依據(jù)是什么？答：層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附力不同分配層析各組分在兩相中分配系數(shù)不同離子交換層析離子交換劑上解離基團(tuán)對(duì)離子親和力不同各組分相對(duì)分子量不同 生物分子與配基間專一又可逆親和力 等電特性與離子交換層析特性結(jié)合凝膠層析 親和層析 層析聚焦26、凝膠層析、離子層析、膜分離技術(shù)的原理，分離過程和常用樹脂的類型、判別。答： 凝膠層析的原理： 凝膠顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，加入欲分離的混合物， 大量蒸餾水或其他稀溶液洗柱； 分子量最大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而

30、沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，最后流出柱外。分離過程： 凝膠的選擇和處理： 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。 將干膠懸浮于 510 倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。 柱的選擇： 采用 L/D 比值高的柱子，可提高分辨率， 但影響流速。 加樣： 體積不能過多， 不超過床體積的 5% ， 脫鹽時(shí)可在 10%左右。洗脫：洗脫液與平衡時(shí)用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。膠的保存：洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。用 0.02%NaN 3防腐。類型： 交聯(lián)葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠。離子交換層析的原理： 根

31、據(jù)離子交換樹脂對(duì)需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。酶是兩性物質(zhì)，當(dāng)溶液的 PH 值大于酶的等電點(diǎn)時(shí)，酶分子帶負(fù)電荷，可用陰離子交換劑進(jìn)行層析分離， 反之，用陽離子交換劑。 若選擇陽離子交換樹脂， 則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH一發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異， 因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。類型： 陽離子交換劑常用羧甲基和磺丙基； 陰離子交換劑常用二乙氨基乙基， 二乙氨基乙基2羥丙基。分離過程：裝柱上樣平衡洗脫收集再生上樣：上樣體積不十

32、分嚴(yán)格。洗脫：梯度洗脫法：增加溶液的離子強(qiáng)度和改變?nèi)芤旱腜H 值。再生：用 0.5mol/LNaOH 和 0.5mol/LNaCl 混合溶液或 0.5mol/LHCl 處理。膜分離技術(shù)的原理： 借助于一定孔徑的高分子薄膜， 將不同大小、 不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。 薄膜的作用是選擇性的讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。27、如何檢查一種酶的制劑是否達(dá)到了純的制劑？試用所學(xué)過的知識(shí)加以論述。28、下面是某酶的純化總結(jié)表，試計(jì)算比活力，回收率及純化倍數(shù)。答：常用比活力表示酶制劑的純度。比活力=酶活力（u/ml） /蛋白質(zhì)含量（mg蛋白

33、/ml酶液）回收率表示提純過程中酶損失程度的大小?；厥章试礁?，損失越小?；厥章?（提純后酶總活力/提純前酶總活力）x 100%純化倍數(shù)表示提純過程中純度提高的倍數(shù)。提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好。純化倍數(shù)=純后比活力/提純前比活力總活力即樣品中全部酶活力?？偦盍Χ富盍挝粩?shù)x酶液總體積29、凝膠層析的洗脫中先流出的是？答：大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來。30、簡述雙水相萃取的概念與特點(diǎn)。答：概念：用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%90% ） ，故稱“雙水相”

34、系統(tǒng)。特點(diǎn)：每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良好的環(huán)境；PEG、 葡聚糖和無機(jī)鹽對(duì)酶等無毒害作用，不會(huì)引起變性。萃取原理：利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。31、解釋酶的發(fā)酵生產(chǎn)、酶的誘導(dǎo)、酶的反饋?zhàn)瓒簦óa(chǎn)物阻遏） 、分解代謝物阻遏。誘導(dǎo)的種類？固定化細(xì)胞，固定化酶，組成酶？答： 酶的發(fā)酵生產(chǎn)： 經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作，利用微生物的生命活動(dòng)獲得所需酶的技術(shù)過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。酶的誘導(dǎo)： 加進(jìn)某種物質(zhì)， 使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象， 稱為酶生物合成的誘導(dǎo)作用，簡稱誘導(dǎo)作用。酶的反饋?zhàn)瓒簦?是指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的

35、現(xiàn)象。分解代謝物阻遏： 是指某些物質(zhì) （主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等） 分解代謝的產(chǎn)物阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。誘導(dǎo)物的種類：固定化細(xì)胞： 又稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞， 是指采用各種方法固定在載體上， 在一定的空間范圍進(jìn)行生長、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。固定化酶： 與水不溶性載體結(jié)合、在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用的酶稱為固定化酶。組成酶： 酶在細(xì)胞中的量比較恒定， 環(huán)境因素對(duì)這些酶的合成速率影響不大， 這類酶稱為組成型酶。如 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、糖酵解途徑的各種酶等。適應(yīng)型酶或調(diào)節(jié)型酶： 生物細(xì)胞中合成的酶的含量卻變化很大， 其合成速率明顯受到環(huán)境因素

36、的影響。如大腸桿菌3-半乳糖昔酶。32、酶的生產(chǎn)方法。答 ：一、提取分離法：采用各種提取、分離、純化技術(shù)從動(dòng)物、植物的組織、器官、細(xì)胞或微生物細(xì)胞中將酶提取出來，再進(jìn)行分離純化的技術(shù)過程；酶的提?。?是指在一定的條件下， 用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈希?使酶充分溶解到溶劑中的過程，主要的提取方法有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。酶的分離純化： 是采用各種生化分離技術(shù)，使酶與各種雜質(zhì)分離， 達(dá)到所需的純度，以滿足使用的要求。二、生物合成法：生物合成法產(chǎn)酶首先要經(jīng)過篩選、誘變、細(xì)胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，然后在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的

37、新陳代謝作用， 生成各種代謝產(chǎn)物， 再經(jīng)過分離純化得到人們所需的酶。 （酶的主要生產(chǎn)方法）據(jù)所使用的細(xì)胞種類的不同生物合成法可分為微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶。三、化學(xué)合成法。 采用合成儀進(jìn)行酶的化學(xué)合成，成本高，難以工業(yè)化生產(chǎn)。33、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程。34、原核生物中酶生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制。答：原核生物中酶生物合成的調(diào)節(jié)主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，又稱為基因水平調(diào)節(jié)。酶合成的誘導(dǎo)：加入某些物質(zhì)使酶的生物合成開始或加速的現(xiàn)象；末端產(chǎn)物阻遏：由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量積累引起的阻遏；分解代謝物阻遏： 指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物 （碳源或氮源） 存在時(shí)，利用快的那種分解底

38、物會(huì)阻遏與利用慢的底物的分解有關(guān)的酶的合成的現(xiàn)象。35、常見產(chǎn)酶微生物有哪些？答： 大腸桿菌： 是最為著名的原核生物。 大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長繁殖、大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌；枯草芽抱桿菌：是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5核苷酸酶、某些氨基酸及核苷，是應(yīng)用最廣泛的最常用的產(chǎn)酶微生物；鏈霉菌：鏈霉菌是生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的主要微生物；木酶：用于產(chǎn)纖維素酶的 重要菌株。36、微生物產(chǎn)酶模式幾種？特點(diǎn)？最理想的合成模式是什么？答：同步合成型：酶的合成與細(xì)胞的生長同步進(jìn)行；延續(xù)合成型：酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始，生長進(jìn)入平衡期后，酶又延續(xù)合成一段時(shí)間；中期合成

39、型：酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間后才開始，進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨之停止；滯后合成型：當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入 平衡期后，才開始并大量積累酶。最理想的合成模式：延續(xù)合成型。改造非理想模式： A 、同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提高相應(yīng)的 mRNA 的穩(wěn)定性；B、滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶合成提早開始；C、中期合成型：努力提高 mRNA 穩(wěn)定性，解除代謝物阻遏物。38、簡述微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過程中工藝條件的控制？（從PH 、溫度、溶解氧三方面論述）答：pH值的控制：培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。 為了維持培養(yǎng)基pH 的相對(duì)恒定， 通常在培

40、養(yǎng)基中加入 pH 緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加酸、堿。 不同的細(xì)胞，其生長繁殖的最適 pH 值有所不同。 一般細(xì)菌和放線菌的生長最適 pH值在中性或堿性范圍（pH6.58.0）;霉菌和酵母的最適生長 pH 值為偏酸性（pH46）;植物細(xì)胞生長的最適 pH值為56。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適 pH值與生 長最適 pH 值往往有所不同。 細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適 pH 值通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH 值。 溫度的控制： 不同的細(xì)胞有各自不同的最適生長溫度。通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升 高 10，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。 有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度

41、與細(xì)胞生長最適溫度有所不同， 而且往往低于生長最適溫度。 這是由于在較低的溫度條件下， 可以提高酶所對(duì)應(yīng)的 mRNA 的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間， 從而提高酶的產(chǎn)量。 溶解氧的控制：細(xì)胞必須獲得充足的氧氣，使從培養(yǎng)基中獲得的能源物質(zhì)（一般是指各種碳源）經(jīng)過有氧降解而生成大量的能量ATP 。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中， 處于不同生長階段的細(xì)胞，其細(xì)胞濃度和細(xì)胞呼吸強(qiáng)度各不相同， 致使耗氧速率有很大的差別。 因此必須根據(jù)耗氧量的不同， 不斷供給適量的溶解氧。39、在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，為了提高酶的產(chǎn)率，可以采取哪些措施？答：添加誘導(dǎo)物：酶的作用底物、酶的反應(yīng)底物、酶的底物類似物、有些產(chǎn)物類似物；

42、 控制阻遏物濃度：產(chǎn)物阻遏、分解代謝物阻遏；添加表面活性劑：離子型表面活性劑對(duì)細(xì) 胞有毒害作用，用非離子型表面活性劑；添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑?；罨埽涸谝欢囟认?，1 摩爾底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能（ kJ/mol）酶的固定化 :將酶和菌體與不溶性載體結(jié)合的過程;固定化酶:在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可回收重復(fù)使用;檸檬酸的發(fā)酵機(jī)理可概括為：大量的胞內(nèi) NH4+ 和呼吸活性提高，使通過糖酵解途徑的代謝得到加強(qiáng)葡萄糖經(jīng)EMP 通路分解成為丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在丙酮酸脫氫酶復(fù)合物作用下氧化成為乙酰CoA 及 CO2 ，然后在檸檬酸合成酶作用下與草酰乙酸縮合而形成檸檬

43、酸，而異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸酶因受到抑制，而使檸檬酸得以積累。糖經(jīng)糖酵解途徑（EMP 途徑），形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4 化合物，丙酮酸脫羧形成 C2 化合物，兩者縮合形成檸檬酸。葡騎磨*丙前酸iCO=乙酰5A而獲丁行被配目前用于工業(yè)化的生產(chǎn)菌種幾乎都是黑曲霉。黑曲霉以無性生殖的形式繁殖研究檸檬酸溢出代謝的最好的例子無疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定環(huán)境條件下累積檸檬酸，是因?yàn)樵谶@種環(huán)境條件下代謝途徑前段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率大于后段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率。檸檬酸的溢出代謝是黑曲霉特有的遺傳和生化機(jī)制與培養(yǎng)條件共同起作用的結(jié)果。 菌種退化：指生產(chǎn)能力的下降，但有時(shí)也伴隨產(chǎn)抱子能力、抗粗放環(huán)境等能力的下降。 檸檬酸生物合成途徑.C6H12O6 EMP 2GH4O3