生化大實(shí)驗(yàn)--AKP(堿磷酶)的表達(dá)與純化

1、AKPAKP的表達(dá)與純化的表達(dá)與純化20082008年春季學(xué)年年春季學(xué)年研究生班研究生班佟麗佟麗一、一、AKPAKP簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介大腸桿菌堿性磷酸酶大腸桿菌堿性磷酸酶( (也稱大腸桿菌堿性磷酸酯酶，也稱大腸桿菌堿性磷酸酯酶， E. E.colicoli alkaline phosphatase alkaline phosphatase，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱AKP/ALPAKP/ALP，EC.3.1.3.1) EC.3.1.3.1) ，在堿性環(huán)境下能水解多種磷酸單酯化，在堿性環(huán)境下能水解多種磷酸單酯化合物的酶，需要鎂和錳離子為激活劑。合物的酶，需要鎂和錳離子為激活劑。 AKPAKP三維結(jié)構(gòu)模擬圖三維結(jié)構(gòu)模擬圖堿

2、性磷酸酶的不同分子狀態(tài)堿性磷酸酶的不同分子狀態(tài) 堿性磷酸酶的理化性質(zhì)堿性磷酸酶的理化性質(zhì)沉降系數(shù)沉降系數(shù)( (單體單體) )沉降系數(shù)沉降系數(shù)( (二聚體二聚體) )沉降系數(shù)沉降系數(shù)( (四聚體四聚體) )固有粘度固有粘度電泳遷移率電泳遷移率等電點(diǎn)等電點(diǎn)等離子點(diǎn)等離子點(diǎn)摩擦比率摩擦比率MWwMWwMWzMWzMWMWZ+1Z+1吸光率吸光率(278nm for 1mg/ml(278nm for 1mg/ml) )激活劑激活劑抑制劑抑制劑熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性6.0 at pH8.06.0 at pH8.06.26.2S S9.69.6S S3.4cm3.4cm3 3/g/g3.33.31010-5-5

3、cmcm2 2/V sec at pH7.6/V sec at pH7.6pH 4.5pH 4.5pH 6.3pH 6.31.051.05(67-98)(67-98)10103 3 at pH8.0 at pH8.0(88-99)(88-99)10103 3 at pH8.0 at pH8.0(86-110)(86-110)10103 3 at pH8.0 at pH8.00.720.72MgMg2 2+ +，MnMn2+2+，ZnZn2+2+，CaCa2+2+氰化物氰化物, , 焦磷酸鹽焦磷酸鹽8585加熱加熱3030分鐘仍保留活性，分鐘仍保留活性，MgMg2+2+存在時(shí)可增加酶的熱穩(wěn)定存在

4、時(shí)可增加酶的熱穩(wěn)定性性二、蛋白純化常用技術(shù)二、蛋白純化常用技術(shù)1. 1. 破碎破碎 機(jī)械法、溶脹和自溶、化學(xué)處理、生物酶降解機(jī)械法、溶脹和自溶、化學(xué)處理、生物酶降解2. 2. 分分 離離 純純 化化 沉淀：鹽析、有機(jī)溶劑、聚乙二醇、加熱沉淀：鹽析、有機(jī)溶劑、聚乙二醇、加熱 層析：層析：離子交換、凝膠過(guò)濾、親和層析、疏水層析、離子交換、凝膠過(guò)濾、親和層析、疏水層析、 金屬螯合層析、金屬螯合層析、吸附層析、分配層析等吸附層析、分配層析等 離心、超濾等離心、超濾等3. 3. 濃濃 縮縮 的的 方方 法法 沉淀法、吸附法、超濾法、透析法、減壓蒸餾法、沉淀法、吸附法、超濾法、透析法、減壓蒸餾法、 冷凍干

5、燥法冷凍干燥法4.4. 測(cè)測(cè) 定定 方方 法法 光譜法：光譜法： 吸收光譜法（直接測(cè)定法、比色法）、熒光吸收光譜法（直接測(cè)定法、比色法）、熒光法、濁度法、熒光光譜技術(shù)、紅外光譜技術(shù)等法、濁度法、熒光光譜技術(shù)、紅外光譜技術(shù)等 電化學(xué)法、生物活性檢測(cè)法、免疫分析法、生物傳感電化學(xué)法、生物活性檢測(cè)法、免疫分析法、生物傳感器法器法5. 5. 鑒鑒 定定 方方 法法 電泳：瓊脂糖電泳、聚丙烯凝膠電泳電泳：瓊脂糖電泳、聚丙烯凝膠電泳 免疫分析：凝集反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、固相免疫吸附、免疫分析：凝集反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、固相免疫吸附、 免疫印跡等免疫印跡等 色譜：氣相色譜、高壓液相色譜、質(zhì)譜色譜：氣相色譜、高壓液相色譜

6、、質(zhì)譜 特定的化學(xué)反應(yīng)、特定的化學(xué)反應(yīng)、PCRPCR、生物芯片、生物芯片、DNADNA測(cè)序、測(cè)序、 DNADNA重組雜交技術(shù)、表型變化等重組雜交技術(shù)、表型變化等6.6. 標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù)7. 7. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測(cè)量、記錄、處理與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測(cè)量、記錄、處理與分析8. 8. 試劑的配制與保存試劑的配制與保存9. 9. 樣品的保存與處理樣品的保存與處理三、三、AKPAKP表達(dá)純化表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表達(dá)菌體超聲破碎表達(dá)菌體超聲破碎高速離心去沉淀高速離心去沉淀離子交換層析粗分離離子交換層析粗分離加熱除雜加熱除雜, ,高速離心高速離心硫銨沉淀富集硫銨沉淀富集分子篩層析進(jìn)一步分離分子篩層析進(jìn)一步分離

7、透析濃縮透析濃縮培養(yǎng)表達(dá)，收集菌體培養(yǎng)表達(dá)，收集菌體純化監(jiān)測(cè)純化監(jiān)測(cè)OD280OD280比活力比活力SDS-PAGESDS-PAGE紫外監(jiān)測(cè)紫外監(jiān)測(cè)濃度測(cè)定濃度測(cè)定純化方案的評(píng)估純化方案的評(píng)估組分組分體積體積mLmL蛋白蛋白mg/mLmg/mL總蛋總蛋白白 mgmg活力活力U/mLU/mL總活總活力力 U U比活力比活力U/mgU/mg提純提純倍數(shù)倍數(shù)回收回收率率1 1100100留樣！體積測(cè)定！留樣！體積測(cè)定！培養(yǎng)、表達(dá)與菌體收集培養(yǎng)、表達(dá)與菌體收集1. 1.預(yù)培養(yǎng)：預(yù)培養(yǎng)：挑一單菌落至挑一單菌落至 30mL 30mL LBLB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基( (含含50g/mL50g/mL Carb

8、) Carb)，3737、190rpm190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2.2.擴(kuò)大培養(yǎng)：擴(kuò)大培養(yǎng)： 取取2mL2mL3mL3mL預(yù)培養(yǎng)菌液至預(yù)培養(yǎng)菌液至300mL TM300mL TM培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中( (含含50g/ml 50g/ml Carb)Carb)，3737、250rpm250rpm振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)3434小時(shí)小時(shí)3. 3. 誘導(dǎo)表達(dá)：誘導(dǎo)表達(dá)：加入加入IPTGIPTG（終濃度：（終濃度：50mol/L 50mol/L ），），2525、250rpm250rpm振蕩培振蕩培養(yǎng)養(yǎng)12121616小時(shí)小時(shí)4. 4. 收菌：收菌： 44，6000rpm6000rpm10min10m

9、in， 2020保存菌體沉淀保存菌體沉淀注意：平衡！注意：平衡！充分棄上清！充分棄上清！細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎w加入加入30 mL30 mL BufferB BufferB，重懸菌體；，重懸菌體；w超聲破碎：超聲破碎：輸出功率輸出功率1200W1200W，超聲，超聲2 2秒，間隔秒，間隔1010秒，超聲秒，超聲4040次；次；w12,000rpm 412,000rpm 420min20min，留取上清至一新管。，留取上清至一新管。w取上清取上清200 uL200 uL加入加入200 uL200 uL 甘油（甘油（號(hào)樣品號(hào)樣品），），2020保存?zhèn)溆茫槐４鎮(zhèn)溆?；注意冰浴冷卻注意冰浴冷卻注意配平！注意配

10、平！量量體體積積上樣：上樣：將離心上清以將離心上清以0.5mL/min0.5mL/min的流速連續(xù)地加入已平的流速連續(xù)地加入已平 衡好的衡好的DEAE-FFDEAE-FF層析柱中層析柱中, , 每管接收每管接收3 mL3 mL；洗滌：洗滌：用用40 mL40 mL Buffer B Buffer B洗滌雜蛋白洗滌雜蛋白 流速：流速：1 1mLmL/min/min，每管接收，每管接收3 mL3 mL；洗脫：洗脫：用用200 mL200 mL Buffer B Buffer B其中含其中含0 00.3mol/L 0.3mol/L 的連續(xù)的連續(xù) NaClNaCl梯度洗脫梯度洗脫AKPAKP 流速：流

11、速：1 1mLmL/min/min，每管接收，每管接收3 mL3 mL收集：收集：收集有活性的收集有活性的AKPAKP， 取取200 uL200 uL加入加入200 uL200 uL 甘油甘油 （號(hào)樣品號(hào)樣品），）， 2020保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆肈EAE-FF離子交換層析離子交換層析？量量體體積積熱變性：熱變性：8080，水浴，水浴30min30min 4 4 ， 12000rpm 12000rpm20min20min 留留上清上清硫銨沉淀：每硫銨沉淀：每100mL100mL AKPAKP溶液溶液 + + 加入加入6060克固體硫酸銨克固體硫酸銨 溶解后靜置溶解后靜置1010分鐘，分鐘，10000

12、rpm10000rpm10min10min 充分充分棄棄上清上清，沉淀，沉淀-20 -20 保存，備用。保存，備用。濃縮濃縮IIIIII號(hào)樣品號(hào)樣品的制備：取此步上清的制備：取此步上清200L200L，加入，加入200L200L甘甘油，混勻，油，混勻，-20 -20 保存保存量量體體積積沉淀溶解：沉淀用沉淀溶解：沉淀用0.5mL0.5mL左右左右Buffer ABuffer A充分溶解充分溶解， 10000rpm10000rpm10min10min，留留上清上清 分子篩層析：分子篩層析： 將上述離心上清上樣、洗脫（將上述離心上清上樣、洗脫（Buffer ABuffer A） 洗脫流速為洗脫流速

13、為15 mL15 mL/ /小時(shí)，每管接收小時(shí)，每管接收2 mL2 mL透析濃縮：合并光吸收及酶活高峰管透析濃縮：合并光吸收及酶活高峰管 Buffer CBuffer C透析濃縮透析濃縮4 4小時(shí)小時(shí) 分裝分裝-20-20保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆? (號(hào)樣品號(hào)樣品) )Sephacyl S-200 HR分子篩層析分子篩層析IVIV號(hào)樣品號(hào)樣品制備：制備：取取50uL50uL離心上清離心上清+ +150150uL BufferBuL BufferB+200uL+200uL甘油甘油 混勻，混勻，-20-20保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆昧苛矿w體積積量量體體積積pNPpNP （對(duì)硝基酚）（對(duì)硝基酚）pNPPpNPP（對(duì)硝

14、基酚磷酸）（對(duì)硝基酚磷酸）410nm410nm測(cè)定測(cè)定ODOD值值無(wú)色無(wú)色PiPi黃色黃色Na3PO4A = （）C LpNP的摩爾消光系數(shù)的摩爾消光系數(shù)（）：）： 17500 mol-1Lcm-11. 1. LB LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (預(yù)培養(yǎng)用培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)用培養(yǎng)基) 30mL/) 30mL/班班 胰蛋白胨胰蛋白胨 0.3 g0.3 g 酵母提取物酵母提取物 0.15 g0.15 g 氯化鈉氯化鈉 0.3 g0.3 g5mol/L NaOH5mol/L NaOH調(diào)調(diào)pHpH至至7 78 8（經(jīng)驗(yàn)值：（經(jīng)驗(yàn)值：200ul200ulL L） 蒸餾水定容至蒸餾水定容至30mL30mL 2.2. TM

15、 TM培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (表達(dá)培養(yǎng)基表達(dá)培養(yǎng)基) 300mL/) 300mL/組組 胰蛋白胨胰蛋白胨 3.6 g3.6 g 酵母提取物酵母提取物 7.2 g7.2 g 氯化鈉氯化鈉 3.0 g3.0 g 甘油甘油 1.8mL 1.8mL 用用1mol/L Tris1mol/L Tris調(diào)調(diào)pHpH至至7 78 8（經(jīng)驗(yàn)值：（經(jīng)驗(yàn)值： 9.3mL9.3mLL L） 蒸餾水定容至蒸餾水定容至300mL300mL溶液配制溶液配制3.3. Buffer A pH 8.5 1000mL/ Buffer A pH 8.5 1000mL/組組 Tris-HCl 50 mmol/LTris-HCl 50 mmo

16、l/L NaClNaCl 0.2mol/L0.2mol/L EDTA 0.5mmol/L EDTA 0.5mmol/L4.4. Buffer B pH 8.5 1000 Buffer B pH 8.5 1000mL /mL /組組 Tris-HCL 50mmol/L Tris-HCL 50mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA 1mmol/L MgAcMgAc2 2 2mmol/L 2mmol/L 5.5. NaOH 0.5mol/L (NaOH 0.5mol/L (4040mL/mL/組組) ) 降低蛋白與介質(zhì)降低蛋白與介質(zhì)的非特異性結(jié)合的非特異性結(jié)合溶液配制溶液配制6.6.考馬斯

17、亮藍(lán)溶液考馬斯亮藍(lán)溶液 500mL 500mL 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250 50mgG-250 50mg溶于溶于 25mL95%25mL95%乙醇中，乙醇中， 加入加入 50mL85%50mL85%磷酸磷酸, , 加水至加水至500mL500mL，濾紙過(guò)濾（，濾紙過(guò)濾（棕色瓶棕色瓶）7.7. 1mg/mL BSA 10 mL 1mg/mL BSA 10 mL（全班）（全班） 10 mg BSA10 mg BSA用用Buffer ABuffer A溶解，溶解，10 mL 10 mL 容量瓶定容容量瓶定容溶液配制溶液配制溶液配制溶液配制8.8. 測(cè)活液測(cè)活液pH 8.5pH 8.5 100mL

18、100mL 50 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L Tris-HCl 0.2mg/mL BSA 0.2mg/mL BSA 10mmol/L pNPP 10mmol/L pNPP 2mmol/L 2mmol/L MgAc MgAc2 29.9. 終止液終止液 500mL500mL10.10. Buffer C 600 Buffer C 600 mLmL11.11. 30% 30%膠貯液膠貯液 300mL300mL （棕色瓶，棕色瓶，44室溫保存室溫保存) ) 每每100mL100mL中含丙烯酰胺中含丙烯酰胺29.2g29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺0.8g0.8g

19、， 溶解后溶解后過(guò)濾過(guò)濾12.12. 分離膠緩沖液分離膠緩沖液200mL200mL ： 1.5mol/L Tris-HCL pH 8.8 1.5mol/L Tris-HCL pH 8.8 （44室溫保存）室溫保存）13.13. 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液100mL100mL ： 0.5mol/L Tris-HCL pH 6.8 0.5mol/L Tris-HCL pH 6.8 （ 44室溫保存）室溫保存）14.14. 10% 10%（m/Vm/V）過(guò)硫酸銨）過(guò)硫酸銨 10mL10mL （ 分裝，分裝， 2020室溫保存室溫保存）15.15. SDS SDS電泳緩沖液電泳緩沖液 500mL500m

20、L （ （全班（全班, , 室溫保存室溫保存） 25mmol/L Tris 25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly0.192mol/L Gly，0.1%(W/V)SDS0.1%(W/V)SDS溶液配制溶液配制下周實(shí)驗(yàn)內(nèi)容下周實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分子篩層析分子篩層析濃縮保存濃縮保存純化參數(shù)測(cè)定純化參數(shù)測(cè)定純化方案的評(píng)估純化方案的評(píng)估組分組分體積體積mLmL蛋白蛋白mg/mLmg/mL總蛋總蛋白白 mgmg活力活力U/mLU/mL總活總活力力 U U比活力比活力U/mgU/mg提純提純倍數(shù)倍數(shù)回收回收率率1 1100100管號(hào)管號(hào)測(cè)活液測(cè)活液（uLuL）酶稀釋酶稀釋液（液（uLuL）AKPA

21、KP（uLuL）30300 0C C反應(yīng)反應(yīng)10min10min終止液終止液（mLmL）1 136036040400 03.63.62 23603600 040403.63.6組份組份稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)A A410410A A410410平均值平均值活力活力U UmLmL樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品酶活測(cè)定酶活測(cè)定組份組份稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)A A595nm595nmA A595nm595nm平均值平均值蛋白濃度蛋白濃度mg/mLmg/mL樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品管號(hào)管號(hào)1 12 23 34 45 56 67 7標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液uLuL0 010102020303

22、0404050506060H H2 2O uLO uL100100909080807070606050504040考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-G-2502505mL5mL搖勻搖勻,1h,1h內(nèi)以內(nèi)以1 1號(hào)試管為空白對(duì)照號(hào)試管為空白對(duì)照, ,在在595nm595nm處比色處比色A A5955950 00 0平均值平均值0 0 蛋白濃度的測(cè)定蛋白濃度的測(cè)定未完，待續(xù)未完，待續(xù)預(yù)習(xí)堿性磷酸酶分離純化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容預(yù)習(xí)堿性磷酸酶分離純化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 誤誤 差差準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度表示實(shí)驗(yàn)分析測(cè)定值與真實(shí)值相接近的程度。準(zhǔn)確度表示實(shí)驗(yàn)分析測(cè)定值與真實(shí)值相接近的程度。誤差：誤差：測(cè)定值與真實(shí)值之間的差值為

23、誤差。包括絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差。測(cè)定值與真實(shí)值之間的差值為誤差。包括絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差。 誤差愈小，測(cè)定值愈準(zhǔn)確，即準(zhǔn)確度愈高。誤差愈小，測(cè)定值愈準(zhǔn)確，即準(zhǔn)確度愈高。絕對(duì)誤差：絕對(duì)誤差：測(cè)定值與真實(shí)值之差。測(cè)定值與真實(shí)值之差。相對(duì)誤差：相對(duì)誤差：絕對(duì)誤差在真實(shí)值中所占的百分率。絕對(duì)誤差在真實(shí)值中所占的百分率。精確度和偏差：精確度和偏差：精確度表示在相同條件下，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)的測(cè)定值相近精確度表示在相同條件下，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)的測(cè)定值相近的程度。一般用偏差來(lái)衡量分析結(jié)果的精確度。的程度。一般用偏差來(lái)衡量分析結(jié)果的精確度。偏差：偏差：絕對(duì)偏差、相對(duì)偏差。絕對(duì)偏差、相對(duì)偏差。誤誤 差差 來(lái)來(lái) 源源 1 1、系統(tǒng)誤差（、系統(tǒng)誤差（可測(cè)誤差可測(cè)誤差）：）：測(cè)定過(guò)程中，某些經(jīng)常發(fā)生的原因所造成的，它對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響比較穩(wěn)定，測(cè)定過(guò)程中，某些經(jīng)常發(fā)生的原因所造成的，它對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響比較穩(wěn)定，在同一條件下重復(fù)測(cè)定中常重復(fù)出現(xiàn)，使測(cè)定結(jié)果不是偏高，就是偏低，而在同一條件下重復(fù)測(cè)定中常重復(fù)出現(xiàn)，使測(cè)定結(jié)果不是偏高，就是偏低，而且大小有一定規(guī)律，它的大小與正