利用生物信息學方法開發(fā)鵪鶉微衛(wèi)星標記

1、利用生物信息學方法開發(fā)鵪鶉微衛(wèi)星標記白俊艷，龐有志，趙淑娟（河南科技大學動物科技學院，471003）中文摘要：本研究對已公布的鵪鶉核酸序列和EST序列總計635條序列中16核苷酸重復SSR的分布進行了分析。結(jié)果表明，其中共發(fā)現(xiàn)120條SSR，檢出率為18.9%。二核苷酸重復基元的SSR占40.0%，三核苷酸重復基元的SSR占35.8%，五核苷酸重復基元和四核苷酸重復基元的SSR類型，分別占14.2%和10.0%，沒有發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復基元的SSR。組成這些SSR的主要基序有AT/TA，CA/GT，GA/CT，CAG/GTC，AGG/TCC，TAA/AAT，GGC/CGG，GAC/CTG，CGA/

2、GCT，GCA/CGT，GAG/CTC，ACC/CCA，TCTT，TTTG，TCCA，ATGAT/ATCAT，TCCCT，TTCCC。并且SSR的重復次數(shù)都在5以上，由此可以推測利用鵪鶉核苷酸序列和EST序列中的SSR序列將有可能開發(fā)一批有價值的SSR分子標記供各種研究所用，還有助于鵪鶉高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、重要功能基因克隆及基因功能等研究。關(guān)鍵詞：鵪鶉，微衛(wèi)星，生物信息學方法鵪鶉分為野生鵪鶉和家養(yǎng)鵪鶉兩類。野生鵪鶉主要有野生普通鵪鶉和野生日本鳴鶉兩種野生普通鵪鶉。鵪鶉具有體型小、產(chǎn)蛋能力強、繁殖快、易飼養(yǎng)、耗料少等特點，因而具有較高的經(jīng)濟價值，同時還因其敏感性好、世代間隔短，是一種很好的實驗

3、動物，可供營養(yǎng)學、遺傳學、疾病學、組織學、胚胎學、生理學、繁殖學、藥理學等學科方面的實驗和研究。然而，現(xiàn)階段對鵪鶉的遺傳資源研究不多，對于分子遺傳標記領(lǐng)域的研究報道比較少。微衛(wèi)星（microsatellite）是DNA序列中以16個堿基為一個重復單位，重復一般在1020次左右，首尾相接的串聯(lián)重復序列，又稱為簡單序列重復DNA（SSR）。目前微衛(wèi)星標記已經(jīng)廣泛應用于牛、豬、羊等家畜的遺傳育種中，主要包括個體識別和品系鑒定，群體遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳關(guān)系分析，功能基因和QTL定位，構(gòu)建基因圖譜，雜種優(yōu)勢預測。微衛(wèi)星標記在鵪鶉中的研究報道比較少，Kayang等1（2004）開發(fā)了鵪鶉100多個的微衛(wèi)星標記，

4、并首次繪制了鵪鶉的部分遺傳連鎖圖譜。Kayang等2（2006）利用AFLP和SSR標記構(gòu)建了鵪鶉的部分染色體的遺傳連鎖圖譜。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)的鵪鶉的微衛(wèi)星標記仍然為數(shù)不多。隨著生物技術(shù)、生物信息學的發(fā)展，GeneBank、DDBJ等國際生物學公共數(shù)據(jù)庫中核酸序列信息也在不斷增多，為我們開發(fā)鵪鶉微衛(wèi)星標記提供了條件。利用生物信息學方法從這些數(shù)據(jù)庫中檢索SSR序列無疑是一個簡便快速的方法。這種方法節(jié)省了傳統(tǒng)微衛(wèi)星開發(fā)過程中的大量測序費用，也節(jié)省了大量人力，因此具有廣闊的應用前景。本研究的目的就是利用生物信息學方法開發(fā)鵪鶉的新微衛(wèi)星標記，為開展鵪鶉遺傳多樣性研究、品種鑒定、比較基因組研究、進一

5、步完善鵪鶉遺傳連鎖圖譜等工作提供更方便實用的標記。一、材料與方法首先，對NCBI中的公共數(shù)據(jù)庫Genebank中的所有鵪鶉核酸序列和EST序列進行檢索，網(wǎng)站為：。然后，用微衛(wèi)星在線搜索工具SSRIT從這些鵪鶉序列中查找微衛(wèi)星，網(wǎng)站為。最后將找到的微衛(wèi)星利用進行序列同源比對，對于獲得的SSR進行統(tǒng)計分析。二、結(jié)果與分析（一）鵪鶉SSR的檢出率： 截至于2009年4月底，從NCBI網(wǎng)站上檢索到鵪鶉的496條核苷酸序列和139條EST序列，總計635條序列。其中共發(fā)現(xiàn)120條SSR，檢出率為18.9%。（二）鵪鶉不同重復核苷酸數(shù)SSR分布表1 SS不同重復核苷酸數(shù)的數(shù)量及百分比重復核苷酸數(shù)SSR數(shù)量

6、（條）占所有SSR的百分比（%）二核苷酸4840.0三核苷酸4335.8四核苷酸1210.0五核苷酸1714.2SSRs總數(shù)120不同重復核苷酸SSR在鵪鶉的基因組中并不是均勻分布的，由表1可以看出，二核苷酸重復基元的SSR類型最多，占總數(shù)的40.0%，其次是三核苷酸重復基元的SSR類型，占35.8%，最少的是五核苷酸重復基元和四核苷酸重復基元的SSR類型，分別占14.2%和10.0%。而且，在鵪鶉中沒有發(fā)現(xiàn)單核苷酸重復基元和六核苷酸重復基元的SSR。(三)鵪鶉各種SSR分布表2 二核苷酸基元和三核苷酸基元的SSR重復單元數(shù)重復單元SSR數(shù)量（條）百分比（%）二核苷酸GA/CT1531.3CA

7、/GT1633.3AT/TA1735.4GC/CG00.0三核苷酸TTA/AAT49.3GGC/CGG37.0GAC/CTG37.0CAG/GTC920.9CGA/GCT37.0GCA/CGT37.0AGG/TCC818.6GAG/CTC37.0ACC/CCA37.0CCT12.3TTG12.3CGC12.3GAT12.3鵪鶉各種SSR的分布見表2和表3，可以看出，在48條含有二核苷酸重復基元的SSR中，含有AT/TA重復基元的數(shù)量最多，有17條，占35.4%，其次是CA/GT和GA/CT重復基元的，分別占33.3%和31.3%，并且沒有發(fā)現(xiàn)GC/CG重復基元的SSR。在43條含有三核苷酸重復

8、基元的SSR中，含有CAG/GTC重復基元的數(shù)量最多，占20.9%，其次是AGG/TCC，占18.6%，然后依次是TAA/AAT、GGC/CGG、GAC/CTG、CGA/GCT、GCA/CGT、GAG/CTC、ACC/CCA，數(shù)量最少的只有1條，他們是CCT、TTG、CGC、GAT。在12條含有四核苷酸重復基元的SSR中，含有TCTT重復基元的數(shù)量最多，占25.0%，其次是TTTG和TCCA，分別占16.7%和16.7%。在17條含有五核苷酸重復基元的SSR中，含有ATGAT/ATCAT重復基元的數(shù)量最多，有8條，占47.1%，其次是TCCCT和TTCCC，分別占23.5%和23.5%。表3

9、四核苷酸基元和五核苷酸基元的SSR重復單元數(shù)重復單元SSR數(shù)量（條）百分比（%）四核苷酸TCTT325.0TTTG216.7TCCA216.7TCCT18.3CCAT18.3TTAT18.3AAAT18.3AACA18.3五核苷酸ATGAT/ATCAT847.1TCCCT423.5TTCCC423.5CTTCC15.9（四）鵪鶉SSR的重復次數(shù)分布 在120條SSR中，發(fā)現(xiàn)重復次數(shù)最多的是重復5次，有53條SSR，占44.2%；其次是重復次數(shù)為6次的，有36條SSR，占30%；其次是7次和8次的，而重復次數(shù)為9次和22次的為最少，只有1條SSR。三、討論本研究對已公布的鵪鶉核酸序列和EST序列

10、中其16核苷酸重復SSR的分布進行了分析，結(jié)果表明，二核苷酸重復基元的SSR占總數(shù)的40.0%，三核苷酸重復基元的SSR類型，占35.8%，五核苷酸重復基元和四核苷酸重復基元的SSR類型，分別占14.2%和10.0%。并且SSR的重復次數(shù)都在5以上，由此可以推測利用鵪鶉核苷酸序列和EST序列中的SSR序列將有可能開發(fā)一批有價值的SSR分子標記供各種研究所用。同時發(fā)現(xiàn)，利用生物信息學方法開發(fā)SSR有以下幾個特點：首先，生物信息學方法開發(fā)SSR簡便、快捷、可以節(jié)省人力財力；其次，生物信息學方法可以開發(fā)出更高核苷酸重復基元的SSR，如三、四、五、六核苷酸重復基元的SSR，而其他方法開發(fā)的SSR多為二

11、核苷酸重復基元的SSR；最后，生物信息學方法開發(fā)的SSR的重復次數(shù)不是很高，多數(shù)在58次重復范圍，這也可能與這些SSR是位于基因內(nèi)部有關(guān)，其保守性可能比較好。盡管SSR具有廣泛的用途，但是其開發(fā)過程卻是相當費時費力，目前SSR標記的開發(fā)有4種方法：文庫篩選法，基于錨定PCR技術(shù)的方法，生物信息學方法，轉(zhuǎn)移擴增法。文庫篩選法是目前最常用的方法，雖然采用文庫富集法可以使SSR開發(fā)效率（功能引物數(shù)/測序克隆數(shù)）達到40%60%，但是無論單引物延伸富集法3，4，還是選擇雜交富集法5，6，都存在過程煩瑣復雜、技術(shù)要求高等缺點。Hayden 和Sharp 11在錨定PCR的基礎(chǔ)上發(fā)明了SAM法。隨著更多的

12、動物基因組序列、mRNA序列不斷增加，生物信息學方法將會成為一種簡便、快速、實用的微衛(wèi)星開發(fā)方法。參考文獻：1 Kayang B B, Vignal A, Inoue-Murayama M A et al. First-generation microsatellite linkage map of the Japanese quail. Anim Genet. 2004, 35(3): 195-200.2 Kayang B B, Vignal A, Inoue-Murayama M A et al. Integrated maps in quail (Coturnix japonica) c

13、onfirm the high degree of synteny conservation with chicken (Gallus gallus) despite 35 million years of divergence. BMC Genomics, 2006, 7:1-18.3 Fisher P J, Richardson T E, Gardner R C, et al. Characteristics of single- and multi-copy microsatellites from Pinus radiata. Theor Appl Genet, 1998, 96: 9

14、699794 Varghese J P, Rudolph B, Uzunova M I, et al. Use of 5´-anchored primers for the enhanced recovery of specific microsatellite markers in Brassica napus L. Theor Appl Genet, 2000, 101:1151195李明芳，鄭學勤.開發(fā)SSR引物方法之研究動態(tài).遺傳, HEREDITAS,2004,26(5):7697766 Hayden M J, Stephenson P, Logojan A M, et al. A new approach to exten