流式細胞儀實驗方法與常見問題分析

1、流式細胞儀實驗方法與常見問題分析 流式細胞儀（Flow Cytometer）是集多種技術(shù)為一體的新型高科技儀器。 流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段，對處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒同時進行多參數(shù)定量分析和分選的高新技術(shù)。 研究對象：各種細胞、微生物、人工合成微球等。BD FACSAria 中心實驗室的流式能做什么？ 流式實驗需要做哪些準備和工作？流式細胞儀檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞功能細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA 含量蛋白質(zhì)含量染色體分析特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞活性細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體凋亡

2、 在上述信號基礎上的細胞分選（未開展分選） 單細胞標本的制備 標記熒光抗體 檢 測（老師） 數(shù)據(jù)分析FCM實驗流程一、單細胞標本的制備 （關(guān)鍵步驟）6種標本來源 外周血單細胞懸液制備新鮮的外周血是天然的單細胞懸液，需要用紅細胞裂解液裂解RBC。 培養(yǎng)細胞的單細胞懸液制備 脫落細胞的單細胞懸液制備脫落細胞應去除取材伴隨的雜質(zhì)后再制備細胞懸液。對臨床診斷和治療很有意義，比如脫落的肺泡細胞。 新鮮實體組織單細胞懸液制備常用方法：酶消化法、機械法、化學處理法、表面活性劑處理法等。不論哪種方法都不可避免會對細胞表面膜結(jié)構(gòu)、細胞活性和功能造成不同程度的損傷。 活檢標本單細胞懸液制備方法：與新鮮實體組織基本

3、相同，要求鏡檢 取材標本至少取3塊以上。 石蠟包埋組織單細胞懸液制備常用方法：二甲苯脫蠟法、組織清潔劑脫蠟法、甲氧-雙氧水處理法。擴大了流式的應用范圍，有利于進行臨床回顧性研究。評判單細胞懸液制備的標準細胞團塊、碎片盡可能少，不能出現(xiàn)肉眼可見的團塊，上機前細胞必須過300目濾膜。細胞呈單個分散狀態(tài)。細胞濃度：51051106分散過程中細胞的活性不受到明顯的損害，以保證下一步的熒光染色處理。 樣品制備過程中常見的問題及解決對策 常見問題原 因解決對策細胞密度低制備過程中細胞損失增加離心時間、吸棄上清非特異熒光強抗體不純、死亡細胞多選擇純度高的抗體、用同型對照抗體或雙標記排除非特異熒光碎片多細胞死

4、亡、機械損傷在細胞生長狀態(tài)良好時測試、避免反復吹打細胞聚集消化不完全、酒精固定造成的細胞粘連 徹底消化、在用酒精固定細胞時加入終濃度為1.5-3的小牛血清熒光弱靈敏度不夠、抗體加入量不飽和、反應時間短改用生物素-親和素、增加抗體用量、延長反應時間測不出亞二倍體峰凋亡測試方法選擇不當改用原位末端標記或Annexin-V和PI雙標記法二、標記熒光抗體 直接免疫熒光染色：細胞與抗體反應，多用于細胞 表面標志的染色分析。 間接免疫熒光染色：先用一抗與待測抗原反應，再用二抗（熒光素標記）進行標記。選擇合適的熒光染料 必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)。（激發(fā)光源488nm633nm407nm） 激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍。 熒光素光譜的重疊應當盡量減少。 一定要選擇商業(yè)化的流式用單克隆抗體，此類抗體在制備過程中有嚴格的質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標抗體，如果是用間標抗體，二抗的選擇更應嚴格。 影響熒光染色效果的因素 溫度：高溫時熒光淬滅的可能性增大。 pH值：其改變會導致熒光光譜改變，影響熒光強度。 固定劑：與細胞的某些物質(zhì)結(jié)合后，干擾熒光染料與細胞成分的結(jié)合，造成熒光強度改變。 其他：孵育時間、溶劑的性質(zhì)、細胞濃度