分子診斷技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)展

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上分子診斷技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)展張健（上海市臨床檢驗(yàn)中心，）摘要：分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使分子診斷技術(shù)進(jìn)入常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用技術(shù)，越來(lái)越多的分子診斷實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)用于疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后判定。不同的分子診斷方法具有不同的臨床應(yīng)用范圍，本文根據(jù)分子診斷技術(shù)特征，按照雜交、擴(kuò)增和測(cè)序三種技術(shù)特征，對(duì)近期分子診斷技術(shù)的發(fā)展及其在臨床應(yīng)用方面的進(jìn)展做一綜述。關(guān)鍵詞：分子診斷熒光原位雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因測(cè)序高通量狹義的分子診斷（molecular diagnosis）是基于核酸的診斷技術(shù)，通過(guò)對(duì)DNA和或RNA的檢測(cè)來(lái)實(shí)踐對(duì)疾病的檢測(cè)和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測(cè)序圖的完成

2、，以及由此而帶來(lái)的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測(cè)，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測(cè)，并廣泛應(yīng)用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后與預(yù)防等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域1。當(dāng)然，分子診斷學(xué)的快速發(fā)展，得益與分子診斷技術(shù)的日新月異。1990年啟動(dòng)的人類基因組計(jì)劃的完成經(jīng)歷了十三年的時(shí)間，而2007啟動(dòng)的1000人基因組計(jì)劃的完成卻只用了3年2，人類了解自然密碼的速度正在跨上快速列車。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)以提供精密準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)服務(wù)于臨床，而分子診斷技術(shù)正逐漸成為成為常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用技術(shù)，這將為檢驗(yàn)醫(yī)

3、學(xué)的發(fā)展提供巨大的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。本文將根據(jù)分子診斷技術(shù)特征，按照雜交、擴(kuò)增和測(cè)序三種技術(shù)特征，對(duì)近期分子診斷技術(shù)的發(fā)展及其在臨床應(yīng)用方面的進(jìn)展做一綜述。一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)發(fā)展及其應(yīng)用兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過(guò)程亦被稱為分子雜交（molecular hybridization）。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交（southern Blot和northern Blot）到實(shí)時(shí)PCR（real time PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測(cè)序技術(shù)，都離不開(kāi)堿基互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)。而且在

4、理論上可以特異性相互作用的兩個(gè)不同分子，例如核酸與核酸之間（A-G、G-C）、蛋白與蛋白之間（抗原和抗體）甚至核酸和蛋白之間（適體與多肽）的相互作用都可以視為分子雜交的不同表現(xiàn)模式。因此，廣義的分子雜交技術(shù)是指以核酸、蛋白、糖基以及細(xì)胞、代謝物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前臨床應(yīng)用的以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)繁多，缺乏統(tǒng)一的分類方法，但是可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的差異分為主要的兩種類型，一類是通過(guò)特異性的標(biāo)記探針檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)，而另一類是通過(guò)探針檢測(cè)從細(xì)胞內(nèi)提取的核酸、蛋白等物質(zhì)，前者以原位雜交及其衍生的技術(shù)為主，后者以生物芯片及其衍生的技術(shù)為主。1、原位雜交技術(shù)（in situ

5、 hybridiztion，F(xiàn)ISH）的發(fā)展與臨床應(yīng)用：原位雜交應(yīng)用特異性的探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸需要標(biāo)記分子顯示雜交信號(hào)，1960s年代的檢測(cè)技術(shù)是放射性核素標(biāo)記，但是信號(hào)檢測(cè)程序復(fù)雜并且可能存在放射性物質(zhì)的污染，而熒光物質(zhì)標(biāo)記可以通過(guò)顯微鏡直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)（Fluorescent in situ hybridiztion，F(xiàn)ISH）一經(jīng)出現(xiàn)立刻取代了放射性標(biāo)記的技術(shù)，成為應(yīng)用最廣泛的分子雜交技術(shù)。FISH技術(shù)通過(guò)熒光標(biāo)記探針，可以可視化的檢測(cè)人類細(xì)胞或組織中特定基因的數(shù)量及其定位，是分子雜交與細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合。IFSH技術(shù)的分析過(guò)程分為四個(gè)步驟，核酸變性、探針

6、變性、雜交及信號(hào)檢測(cè)。因此，針對(duì)探針標(biāo)記、染料開(kāi)發(fā)和圖像分析的技術(shù)的更新是FISH分析技術(shù)發(fā)展的主要路徑。首先是熒光染料的應(yīng)用，從最初的單色FITC應(yīng)用，發(fā)展到使用多種熒光染料的多色FISH技術(shù)（multicolorFISH，1996）3，既多元熒光原位雜交（MultiplexFISH，M-FISH）4和光譜核型分析技術(shù)（Spectral karyotying，SKY）5，使用五種染料（Rhodamine, Texas-red, Cy5, FITC, and Cy5.5）標(biāo)記的探針可以在一次試驗(yàn)中定位多種不同的基因以及使用不同的顏色標(biāo)記顯示24條不同的染色體。其次，在探針?lè)矫?，為了更精?xì)和高分

7、辯的顯示染色體結(jié)構(gòu)和基因的探針，染色體臂、著絲粒、端粒特異的探針被先后開(kāi)發(fā)應(yīng)用，而且應(yīng)用微切割技術(shù)切割技術(shù)制備亞區(qū)域探針（microFISH），使FISH的基因定位和分辯率大大提高6。同時(shí)，探針標(biāo)記對(duì)象和標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展不斷衍生出新的FISH技術(shù)，例如比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）、引物原位標(biāo)記技術(shù)（Primed In Situ Labeling ，PRINS）、肽核酸探針原位雜交（PNA-FISH）、物種交叉熒光原位雜交（RxFISH）、纖維原位雜交（Fiber FISH）等7。在圖像與信號(hào)分析方面，應(yīng)用高分辨率CCD攝像機(jī)和計(jì)算機(jī)

8、自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)獲得廣泛應(yīng)用，M-FISH分別為5種熒光染料分別成像，而SKY結(jié)合傅立葉頻譜技術(shù)，同時(shí)計(jì)量可見(jiàn)光和近紅外范圍內(nèi)的所有點(diǎn)的發(fā)射頻譜而一次成像。目前FISH技術(shù)是基礎(chǔ)科學(xué)研究得到廣泛應(yīng)用，但在臨床診療中的應(yīng)用主要集中在產(chǎn)前診斷、血液腫瘤診斷、感染性疾病診斷及實(shí)體腫瘤的診斷和藥物靶向性治療等領(lǐng)領(lǐng)域。在產(chǎn)前診斷方面，F(xiàn)ISH主要用于染色體數(shù)目異常的診斷，其與常規(guī)核型分析的一致性可以達(dá)到99.5，但結(jié)果報(bào)告時(shí)間只需要24小時(shí)，大大低于核型分析的平均2周左右的報(bào)告時(shí)間，F(xiàn)ISH在多數(shù)的發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)為常規(guī)產(chǎn)前篩查輔助診斷技術(shù)8。在血液腫瘤的診斷方面，F(xiàn)ISH用于染色體異位的融合基因檢測(cè)、

9、基因缺失檢測(cè)、微小殘留病灶監(jiān)測(cè)、骨髓移植監(jiān)測(cè)等。在感染性疾病檢測(cè)方面，F(xiàn)ISH檢測(cè)痰液標(biāo)本中銅綠假單飽菌、流感嗜血桿菌等常見(jiàn)菌的敏感性可以達(dá)到90，特異性1009。對(duì)于軍團(tuán)菌、幽門螺旋桿菌和結(jié)核桿菌等較難培養(yǎng)鑒定的細(xì)菌，F(xiàn)ISH在快速診斷上也顯示了很好的應(yīng)用前景10。在實(shí)體腫瘤的應(yīng)用中，F(xiàn)ISH可以檢測(cè)任何組織類型的染色質(zhì)和基因的異常，廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等實(shí)體腫瘤的腫瘤的輔助診斷，療效檢測(cè)、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷。特別是在腫瘤的個(gè)體化治療方面，F(xiàn)ISH是藥物個(gè)體治療患者篩查的主要方法之一，用于藥物靶向性基因表達(dá)狀態(tài)的檢測(cè)。在乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗(赫賽汀)治療有效性患者篩選

10、中，F(xiàn)ISH被認(rèn)為是檢測(cè)HER2基因表達(dá)狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)11。2、生物芯片技術(shù)的發(fā)展與臨床應(yīng)用生物芯片（Biochip）是通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)將大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原/抗體，甚至細(xì)胞或組織等生物大分子，按照矩陣方式高密度的固定或直接合成在玻璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等固項(xiàng)支持物上，或者整合微流體技術(shù)以及微電級(jí)、為傳感器等制備的類似于電子行業(yè)的芯片樣產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)。固化的探針?lè)肿优c熒光標(biāo)記的相應(yīng)樣本進(jìn)行雜交，通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)掃描分析及計(jì)算機(jī)軟件分析，達(dá)到高通量分析生物信息的目的。生物芯片技術(shù)可以根據(jù)功能的不同分為微陣列芯片（Microarray chip）、微流控芯片（Microfl

11、uidics）和芯片實(shí)驗(yàn)室（LAB-on-chip, LOC）12。早期的微陣列芯片（Microarray）單指基因芯片（gene chip，DNA chip），但隨著蛋白芯片（protein chip）以及糖類芯片（glycan chip）的出現(xiàn)，Microarray逐漸被稱為微陣列芯片，強(qiáng)調(diào)將大量探針有序固化在固相支持物上的檢測(cè)方法，而根據(jù)探針?lè)N類的不同可以分為基因芯片、蛋白芯片及糖類芯片。微流控芯片是在幾平方厘米的單晶硅片、石英、玻璃或有機(jī)聚合物等材料上刻制微通道，實(shí)現(xiàn)樣本預(yù)處理、反應(yīng)、分離和檢測(cè)的微型檢測(cè)平臺(tái)，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各種小分子分析和鑒定13。芯片實(shí)驗(yàn)室是在

12、微流控芯片基礎(chǔ)上發(fā)展了更為復(fù)雜的分析系統(tǒng)，將微機(jī)電技術(shù)于微流體技術(shù)相結(jié)合，將所需的反應(yīng)均集中在一塊芯片上，建立微型分析系統(tǒng)（Micro total analytical system，u-TAS）14。目前臨床實(shí)驗(yàn)室可以應(yīng)用的微流控芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室尚處于研究和開(kāi)發(fā)階段，在生物芯片中只有微陣列芯片的應(yīng)用取得較大的進(jìn)展，微陣列芯片的應(yīng)用以DNA芯片和蛋白芯片為主。目前生物芯片可以應(yīng)用的范圍包括：病原體的快速檢測(cè)、亞型分析及耐藥性檢測(cè)；腫瘤的分類、分期與篩查；遺傳性疾病的診斷于篩查；自身免疫性疾病的診斷等等。國(guó)外的生物芯片開(kāi)發(fā)較早，許多成熟的生物芯片的檢測(cè)平臺(tái)已逐漸應(yīng)用于臨床，例如美國(guó)Osmetch

13、公司的e-SensorCF test（檢測(cè)Cystic fibrosis ）和RocheAffymetrix的CYP450芯片（檢測(cè)藥物代謝相關(guān)基因CYP2D6和CYP2C19），Agendia公司的Mammaprint芯片（檢測(cè)乳腺癌相關(guān)基因），這三種芯片均已獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室15。國(guó)內(nèi)的生物芯片檢測(cè)平臺(tái)的起步較晚，目前有少數(shù)產(chǎn)品獲得sFDA批準(zhǔn)。獲得sFDA批準(zhǔn)的生物芯片產(chǎn)品及其制造商見(jiàn)表1。表一國(guó)產(chǎn)生物芯片檢測(cè)試劑及其制造商制造商名稱生物芯片名稱技術(shù)分類批準(zhǔn)年限上海浩源生物科技有限公司HIV（I型）核酸檢測(cè)DNA芯片2008珠海賽樂(lè)奇生物技術(shù)有限公司HBV耐藥基因點(diǎn)突變

14、DNA芯片2011HBV基因分型檢測(cè)DNA芯片2011湖州樹(shù)康生物技術(shù)有限公司ENA抗體（6種）定性蛋白芯片2011多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)蛋白芯片2009上海百傲科技有限公司CYP2C19基因檢測(cè)DNA芯片2009ALDH2（GLu504Lys）檢測(cè)DNA芯片2010港龍生物技術(shù)（深圳）有限公司HVP基因分型DNA芯片2011上海裕隆生物技術(shù)有限公司多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)（男）蛋白芯片2010多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)（女）蛋白芯片2010博奧生物有限公司抗核抗體（8項(xiàng)）DNA芯片2010遺傳性耳聾基因檢測(cè)DNA芯片2010分枝桿菌鑒定DNA芯片2010資料來(lái)源于國(guó)家食品藥品監(jiān)督局官方網(wǎng)站二、基于擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分

15、子診斷技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR），使體外擴(kuò)增DNA成為可能，開(kāi)啟了體外擴(kuò)增和操作DNA或RAN技術(shù)的發(fā)展。在之后的20多年里，擴(kuò)增DNA的技術(shù)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。目前缺乏統(tǒng)一的核酸擴(kuò)增技術(shù)的分類，但根據(jù)DNA被擴(kuò)增的過(guò)程中是變溫還是恒溫方式，可以將核酸擴(kuò)增技術(shù)分為兩類，一類是溫度循環(huán)式的擴(kuò)增技術(shù)，以常規(guī)（conventional PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR，RT-PCR）為主，另一類技術(shù)是等溫方式的擴(kuò)增技術(shù)，以轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（Tra

16、nscription-mediated amplification，TMA），環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技術(shù)為主。1 溫度循環(huán)式核酸擴(kuò)增技術(shù)：PCR技術(shù)的反應(yīng)過(guò)程是在引物的介導(dǎo)下，通過(guò)DNA聚合酶在變形、退火、延伸3個(gè)不同溫度條件下的多次循環(huán)來(lái)擴(kuò)增引物特異的目的DNA序列，因此PCR技術(shù)的發(fā)展主要以引物的設(shè)計(jì)、產(chǎn)物分析或信號(hào)檢測(cè)為主。對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方式的差異，衍生出兩類主要PCR的測(cè)定技術(shù)，一種是終點(diǎn)檢測(cè)法，通常稱為常規(guī)PCR，一種是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)法，通常稱為實(shí)時(shí)PCR（real time PCR，RT-PCR）16

17、。常規(guī)PCR在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳或雜交等方式的分析，因此與其他技術(shù)的結(jié)合衍生出多種分析方法，例如PCR結(jié)合限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）、PCR結(jié)合特異性寡合苷酸探針斑點(diǎn)雜交（PCR-ASO）、PCR結(jié)合變性梯度凝膠（PCR-DGGE）、PCR結(jié)合的單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）等分析技術(shù)17。由于PCR擴(kuò)增過(guò)程的終末反應(yīng)是進(jìn)入平臺(tái)期，因此檢測(cè)樣本中的不同起始膜板數(shù)的DNA在擴(kuò)增的終末產(chǎn)物中將在數(shù)量上趨于一致，因此很難通過(guò)終末產(chǎn)物的分析對(duì)樣本起始DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方法的RT-PCR得以發(fā)展和應(yīng)用。1992年，Higuchi提出在PCR反應(yīng)退后或延伸時(shí)利

18、用熒光染料EB（溴化乙錠）滲入雙鏈核酸中而使擴(kuò)展產(chǎn)物攜帶熒光物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和產(chǎn)物的熒光達(dá)到定量的方法，但染料也會(huì)結(jié)合到引物等非特異的片段，因此這是非特異的檢測(cè)方法18。1996年，ABI公司推出了第一款熒光定量的PCR儀器ABI7700，使特異性的DNA定量檢測(cè)成為可能19。RT-PCR使用熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的目的片段的特異性結(jié)合，直接測(cè)試PCR過(guò)程中的熒光信號(hào)的變化，在封閉的試管中檢測(cè)，無(wú)需電泳等后續(xù)處理，既簡(jiǎn)便快速又降低了污染，客服了常規(guī)PCR的缺點(diǎn)，在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的驅(qū)動(dòng)下，RT-PCR獲得快速發(fā)展。RT-PCR的原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)一分子的熒光分子（供體）熒光光譜與另一熒光分子

19、（受體）的激發(fā)光譜重疊時(shí)，能量會(huì)在熒光分子間轉(zhuǎn)移，當(dāng)熒光分子的距離小于710nm時(shí)熒光被淬滅，而但熒光分子距離拉開(kāi)時(shí)，熒光信號(hào)可以被檢測(cè)。熒光探針發(fā)射的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量線性相關(guān)。RT-PCR技術(shù)可以使用不同的探針設(shè)計(jì)來(lái)控制熒光的淬滅與釋放，主要包括水解探針、分子信標(biāo)、Scorpion探針、雙鏈探針等20。PCR技術(shù)是體外擴(kuò)增核酸的最有效和研究開(kāi)發(fā)最廣泛的試驗(yàn)技術(shù)，可以檢測(cè)核酸的拷貝數(shù)，分析mRNA的表達(dá)水平、分析基因突變，因此獲得了廣泛的臨床應(yīng)用。同時(shí)，在大量的應(yīng)用中，根據(jù)分析目的和試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同，PCR技術(shù)還發(fā)展衍生出許多不同的測(cè)定方法，例如同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原體的多重PCR（Mult

20、iplex PCR）21，提高敏感性和特異性的巢式PCR（nested PCR）22，研究基因表達(dá)的原位PCR（in situ PCR）23，分析RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）24以及錨定PCR、不對(duì)稱PCR、膜結(jié)合PCR等等25。2 恒溫式核酸擴(kuò)增技術(shù)：恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在一個(gè)恒定的溫度下擴(kuò)增目的DNA或RNA片段，其有點(diǎn)是對(duì)設(shè)備的要求程度不高，并且適合于床旁檢驗(yàn)。因此，在過(guò)去的10年里取得了較快的發(fā)展。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括，核酸序列擴(kuò)增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（Transcription-medi

21、ated amplification，TMA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈置換擴(kuò)增法（strand displacement amplification，SDA）、滾環(huán)擴(kuò)增法（Rolling Crile Amplification，RCA）、復(fù)制酶擴(kuò)增QB等。不同的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的差別主要在于提供擴(kuò)增反應(yīng)得以延續(xù)的動(dòng)力來(lái)源的差異上面。NASAB是通過(guò)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RnaseH三種酶的協(xié)同作用為核酸擴(kuò)增提供動(dòng)力，逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，生成的RNA-DNA，產(chǎn)物被RnaseH分解為單鏈DN

22、A，引物2結(jié)合DNA，再在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成雙鏈DNA，雙鏈DNA上引物攜帶的T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA又可以生成DNA，使反應(yīng)循環(huán)發(fā)生26；TMA技術(shù)只使用逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶，在反應(yīng)中同時(shí)利用逆轉(zhuǎn)錄酶酶的逆轉(zhuǎn)錄活性和Rnase活性，反應(yīng)動(dòng)力的維系與NASBA類似27：LAMP技術(shù)是利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)動(dòng)力28；SDA技術(shù)是應(yīng)用DNA聚合酶的53核酸外切酶活性從雙鏈DNA上的缺口處開(kāi)始合成新鏈，剝離舊鏈，當(dāng)缺口重復(fù)產(chǎn)生時(shí)，切割延伸鏈置換的過(guò)程循環(huán)進(jìn)行，目的片段被擴(kuò)增29；RCA是利用環(huán)狀DNA與強(qiáng)鏈置換活性的29DNA聚合酶為DNA延

23、伸提供動(dòng)力30。3以擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用DNA或RNA的擴(kuò)增技術(shù)，最直接的優(yōu)勢(shì)是在較短的時(shí)間內(nèi)將目的基因的拷貝數(shù)大量擴(kuò)增，具有很高的靈敏度，同時(shí)特異性的引物保證了較高的特異性。因此，在分子診斷技術(shù)中基于擴(kuò)增的技術(shù)，特別是熒光定量PCR技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用最為廣泛。PCR技術(shù)可以準(zhǔn)確的定量感染性疾病病原體，不論是真菌、細(xì)菌和病毒以及寄生蟲(chóng)的感染都可以應(yīng)用擴(kuò)增技術(shù)加以檢測(cè)，同時(shí)同一中病原體可以買到多種擴(kuò)增原理的商業(yè)化檢測(cè)試劑。目前在sFDA注冊(cè)的應(yīng)用PCR方法的體外診斷試劑已達(dá)到192種，成為病原體和基因表達(dá)與突變檢測(cè)的最主要的試劑。為提高PCR的檢測(cè)通量，新進(jìn)發(fā)展的多重PCR

24、技術(shù)以及多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex ligation-dependent Probe amplification，MLPA）可以一次在同一樣本中同時(shí)檢測(cè)多種病原體，最大可同時(shí)擴(kuò)增45個(gè)目的片段31。同時(shí)，對(duì)PCR產(chǎn)物的高分辨率溶解曲線分析，為基因分型和突變掃描提供了新的手段32?？梢灶A(yù)見(jiàn)PCR技術(shù)仍將主導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室感染性病原體的檢測(cè)，細(xì)菌的耐藥基因檢測(cè)，腫瘤個(gè)體化治療的主要檢測(cè)工具。三、基于測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用DNA 的序列分析是分子診斷學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，各種遺傳疾病，病毒或細(xì)菌的感染與變異，在基因表達(dá)水平上的個(gè)性化用藥，多基因疾病的診斷與預(yù)測(cè)，最終都可以借助基因測(cè)

25、序平臺(tái)的應(yīng)用33。傳統(tǒng)DNA的DNA測(cè)序方法包括末端合成終止法和化學(xué)講解法，操作步驟繁瑣、效率低下特別是結(jié)果的判度過(guò)程耗時(shí)太長(zhǎng)，臨床實(shí)驗(yàn)室較難應(yīng)用34。為提高DNA測(cè)序的效率，發(fā)展自動(dòng)化的DNA測(cè)序儀器是分子診斷市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)最激烈的領(lǐng)域，目前第三代的測(cè)序儀器已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用，第四代的測(cè)序亦在研究之中。不同DNA測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)平臺(tái)及其測(cè)序方法見(jiàn)表2。表二、不同制造商提供的DNA測(cè)序平臺(tái)及其測(cè)序方法Generation CompanyPlatform Name Method of SequencingFirstABI/Life technologies 3130xL-3730xLCE-SangerFirs

26、t BeckmanGeXP Genetic Analysis System CE-SangerSecondRoche/454Genome Sequencer FLX System PyrosequencingSecondIlluminaHiSeq 2000/miSeqReversible terminator sequencing by synthesisSecondABI/SOLiD5500xl SOLiD System Sequencing by ligationSecond HelicosHeliScopeSingle-molecule sequencing synthesisThird

27、Pacific BiosciencesPacBio RSReal-time, single- molecule DNA sequencingThirdComplete Genomics In-house lab-built instrumentation Combinatorial probe- anchor hybridization and ligation (cPAL) Third Ion Torrent/Life TechnologiesPersonal Genome Machine (PGM) sequencerSequencing by synthesisFourth Oxford NanoporegridIONNanopor