人外周血來源的DC培養(yǎng)技術(shù)—— 張秀敏

1、 人外周血來源的DC 培養(yǎng)技術(shù)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室 張秀敏張秀敏 個(gè)體個(gè)體中不中不同組同組織的織的細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)形態(tài)發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞及其在后天免疫系統(tǒng)中的作用發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞及其在后天免疫系統(tǒng)中的作用 樹突狀細(xì)胞是一類在顯微鏡下看到的像樹枝樣形狀的細(xì)胞，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的控制者，當(dāng)機(jī)體遭遇病原微生物侵襲或體內(nèi)有細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，樹突狀細(xì)胞很快即能獲知這些信息，并及時(shí)傳遞給免疫系統(tǒng)，將病原微生物或惡變細(xì)胞從體內(nèi)清除出去。單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞B細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞髓系DCBTNK髓系DC淋巴系DC淋巴系前體細(xì)胞髓系前體細(xì)胞多能造血干細(xì)胞GM-CSF TNF-a IL-4CD1

2、a、CD11c、CD83MHC II協(xié)同刺激分子協(xié)同刺激分子CD80、CD86黏附分子黏附分子CD40、CD54分泌細(xì)胞因子分泌細(xì)胞因子DC是一種較好的免疫佐劑，是一類專職的抗原提呈細(xì)胞（APC），在腫瘤免疫、移植免疫和免疫缺陷病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DC在腫瘤治療方面的巨大潛能已被許多研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)。許多納米疫苗的研究將靶向細(xì)胞鎖定為DC。 人樹突狀細(xì)胞交叉遞呈腫瘤抗原途徑及影響因素的研究樹突狀細(xì)胞靶向納米乳劑腫瘤疫苗雙分子修飾的抗原遞呈細(xì)胞靶向腫瘤納米疫苗的研究DCDCDC在體內(nèi)分布廣泛且數(shù)量較少；自1993年體外擴(kuò)增獲得成功以來，還沒有一致公認(rèn)的最特異最理想的體外獲得大量DC的方法；尋找最

3、佳組織來源及建立最佳技術(shù)方法以獲得大量高純度的具有典型形態(tài)、表型、功能的DC成為當(dāng)務(wù)之急。直接分離直接分離DC方法方法 依據(jù)依據(jù)DC的低密的低密度和半粘附特性度和半粘附特性以以及及DC特定的細(xì)胞表特定的細(xì)胞表面標(biāo)志來直接分離面標(biāo)志來直接分離提取提取DC缺點(diǎn)缺點(diǎn)1.1. 數(shù)量少數(shù)量少2. 2. 技術(shù)操作要求高技術(shù)操作要求高3. 3. 難以滿足難以滿足DC的的 研究需要研究需要DC 純度95%以上DC培養(yǎng)技術(shù)-改良的三步改良的三步法法缺點(diǎn)缺點(diǎn) 操作煩瑣，獲得量低操作煩瑣，獲得量低文字內(nèi)容DC培養(yǎng)技術(shù)-細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周血來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周血來源的DC 人DC的來源主要是外周血CD14+細(xì)胞和臍血

4、CD34+前體細(xì)胞，由于外周血取材方便，因此使用較多。外周血PBMC的分離可采用Ficoll密度梯度離心法或利用磁珠分離系統(tǒng)分離，目前最常用的是根據(jù)細(xì)胞的粘附性進(jìn)行分離，經(jīng)過2-4h貼壁孵育，去除外周血淋巴細(xì)胞，然后在rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-的聯(lián)合誘導(dǎo)下分化為成熟DC。DC培養(yǎng)技術(shù)-細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周血來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周血來源的DC取材方便、制備較簡(jiǎn)單、DC獲得率高對(duì)于分離單個(gè)核細(xì)胞的技術(shù)操作要求較高優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 富集白細(xì)胞的健康人血液成分 淋巴細(xì)胞分離液 RPMIl640 胎牛血清 重組人白細(xì)胞介素

5、4(rhlL-4) 重組人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 重組人腫瘤壞子因子(rhTNF-a) FITC標(biāo)記熒光抗CD1a、HLA-DR、CD80、CD86、CD14單克隆抗體連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) Ficoll密度梯度離心法密度梯度離心法粒細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞紅細(xì)胞血漿層血漿層白膜層（淋巴、單核細(xì)胞）白膜層（淋巴、單核細(xì)胞）分離層分離層分離液分離液稀釋的血液稀釋的血液2000rpm/20min離心離心血血 液液稀稀釋釋液液連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)

6、貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 稀稀釋釋液液重復(fù)洗滌細(xì)胞重復(fù)洗滌細(xì)胞2-32-3次次離心離心1000rpm/20min吸棄上清液吸棄上清液連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 1 收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種培養(yǎng)瓶，37C、5% CO2孵箱中2h2 傾出未貼壁細(xì)胞，置于另一200ml塑料培養(yǎng)瓶，繼續(xù)孵育2h3 在連續(xù)兩次貼壁的兩組培養(yǎng)瓶中，均加入RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12h4 次日，吸出懸浮細(xì)胞及貼壁不牢固細(xì)胞于RPMI1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 隔日半量換液，補(bǔ)充rhuGM

7、-CSF 1000u/ml、rhuIL-4 1000u/ml，并在培養(yǎng)第5天加入TNF-2000u/ml6 從第7天起只給DC隔日半量換液，但不補(bǔ)充細(xì)胞因子。相差顯微鏡觀察DC形態(tài)及數(shù)量 培養(yǎng)第培養(yǎng)第7天取天取106 細(xì)胞細(xì)胞加入加入FITC標(biāo)記鼠抗人標(biāo)記鼠抗人CD1a、HLA-DR、CD80、CD86、CD14單克隆抗體單克隆抗體常規(guī)制備樣本常規(guī)制備樣本,流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 收集收集細(xì)胞細(xì)胞固定固定切片切片染色染色分別于培養(yǎng)分別于培養(yǎng)第第7d、第、第15d收集細(xì)胞收集細(xì)胞懸液、離心懸液、離心棄上清棄上清0.25

8、%戊二戊二醛室溫固醛室溫固定定12 h；1% OsO4 后固定后固定2 h脫水脫水包埋包埋超薄切片超薄切片醋酸鈾和醋醋酸鈾和醋酸鉛染色；酸鉛染色；透射電鏡下透射電鏡下觀察觀察連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 1-4h 細(xì)胞貼壁形態(tài)（400） 12h后 細(xì)胞形態(tài)（200） 培養(yǎng)培養(yǎng)12h內(nèi)內(nèi)DC的光鏡下形態(tài)，細(xì)胞基本呈圓形。的光鏡下形態(tài)，細(xì)胞基本呈圓形。 連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 大量大量細(xì)胞聚集成細(xì)胞聚集成簇簇 (400) 胞體胞體增

9、大，形狀不規(guī)則增大，形狀不規(guī)則（400）連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 培養(yǎng)第培養(yǎng)第7d的的DC Control CD1a CD40 HLA-DR CD83 CD86 44.16% 75.04% 95.98% 57.25 % 73.20%PBMC來源來源DC(7d)連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) DC透射電鏡（透射電鏡（3K）DC內(nèi)溶酶體豐富（內(nèi)溶酶體豐富（13K） 連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 培養(yǎng)第培養(yǎng)第7d的的DC 凋亡凋亡DC（4.5K） 吞噬狀態(tài)吞噬狀態(tài)DC

10、 （6K） 培養(yǎng)第培養(yǎng)第15dDC 連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 文字內(nèi)容 采取連續(xù)兩次貼壁孵育PBMC的方法，以充分收集外周血中CD14+DC前體細(xì)胞。此外，在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)12h后，去除牢固貼壁細(xì)胞再繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，以盡量排除巨噬細(xì)胞對(duì)DC培養(yǎng)的干擾。按照我們的改進(jìn)方案，分離培養(yǎng)出的DC無論是數(shù)量還是純度都高于以往一次貼壁分離培養(yǎng)出的DC。每108的PBMC，經(jīng)過連續(xù)兩次貼壁分離培養(yǎng)7天后可獲得51061107個(gè)懸浮和半貼壁細(xì)胞，光鏡觀察其中具有典型DC形態(tài)的細(xì)胞比例大于90%。常見問題常見問題原因：滴加血液時(shí)間過長(zhǎng)；疊加血液方法及速度不當(dāng)。解決方法

11、：在把稀釋后的抗凝血加至分離液面時(shí)將毛細(xì)管貼近分離液并傾斜離心管后再加血液；按照先慢后快的原則，盡可能短時(shí)間內(nèi)完成，不能超過30分鐘。連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 常見問題常見問題原因：滴加抗凝血的操作不當(dāng)；離心速度、時(shí)間及溫度控制不好；ficoll液溫度、血的保存不當(dāng)。解決方法：盡量用15ml的離心管分離；稀釋血液時(shí)混勻不能太用力，否則會(huì)溶血；滴加稀釋的血液時(shí)不要沖破液面；不要振蕩離心管；ficoll液要復(fù)溫；血液常溫避光保存，從采血到分離不超過12個(gè)小時(shí)；離心溫度只能在20-25。連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技

12、術(shù)技術(shù) 常見問題常見問題 PBMC出現(xiàn)在分離液和紅細(xì)胞的交界面，而不是在分離液的上面。原因：離心速度過高；離心機(jī)升降速度過快。解決方法：將離心速度降低，讓離心機(jī)自然沉降。連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 常見問題常見問題 CD14+前體細(xì)胞貼壁不充分，單純的延長(zhǎng)貼壁時(shí)間或前體細(xì)胞貼壁不充分，單純的延長(zhǎng)貼壁時(shí)間或增加貼壁表面積不能明顯增加貼壁細(xì)胞數(shù)量。增加貼壁表面積不能明顯增加貼壁細(xì)胞數(shù)量。 以往一次貼壁分離培養(yǎng)的細(xì)胞中，牢固貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞以往一次貼壁分離培養(yǎng)的細(xì)胞中，牢固貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞比例較高，這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中極易分化為巨噬細(xì)胞，同比例較高，這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中極易分化為巨噬細(xì)胞，同時(shí)拮抗時(shí)拮抗CD14+前體細(xì)胞向前體細(xì)胞向DC的分化與擴(kuò)增。的分化與擴(kuò)增。解決方法解決方法：采用連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)：采用連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)DC，即對(duì)即對(duì)PBMC連續(xù)連續(xù)貼壁兩次，次日取懸浮及半貼壁的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。貼壁兩次，次日取懸浮及半貼壁的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)人外周血來源DC技術(shù)技術(shù) 技術(shù)創(chuàng)新l 改進(jìn)了改進(jìn)了PBMC分離方法，提高了分離方法，提高了PB