細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)-課堂PPT-第二講

1、Passage culture of adherent cell lines (subculture)Methods in Cell Biology細(xì)胞株傳代培養(yǎng)細(xì)胞株傳代培養(yǎng)原理原理 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程 1. 1. 培養(yǎng)細(xì)胞生命期（培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture CellsLife Sp

2、an of Culture Cells）指細(xì)胞在整個(gè)離體培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間，分指細(xì)胞在整個(gè)離體培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間，分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。2. 2. 組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所謂細(xì)胞所謂細(xì)胞“一代一代”一詞一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。一含義。如某一細(xì)胞系為第如某一細(xì)胞系為第153153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳

3、代153153次。它與細(xì)胞世代（次。它與細(xì)胞世代（GenerationGeneration）或倍增或倍增( ( DoublingDoubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3 36 6次。次。培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過(guò)程培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過(guò)程（一）潛伏期（潛伏期（Latent Latent phasephase）： 細(xì)胞從接種到貼壁生長(zhǎng)繁殖的一段時(shí)間。n二倍體細(xì)胞該期時(shí)間長(zhǎng)（24-96h）n連續(xù)細(xì)胞系時(shí)間短（10-30min）（二）指數(shù)生長(zhǎng)期： 細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitotic index，MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)。 體

4、外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1-0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。n指數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)n指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象。n癌細(xì)胞則由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（三）停滯期： 即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，pH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。 在此時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。細(xì)胞傳代方法細(xì)胞傳代方法1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

5、 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2-23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。 3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采

6、用酶消化法傳代。常用的消化液有采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。Passage culture of adherent cell lines(subculture)Overview: Remove medium from culture container,rinse with PBS,expose cells to trypsin,incubate, stop trypsin activity by adding serum containing medium, dissociate cells, dilute and return to incubator

7、.貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程n1. 棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。加入23ml的PBS或D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程n2、加入0.5-1 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)），靜置2-5 min（倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)），待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，終止消化。剛加入剛加入合適合適過(guò)頭過(guò)頭3. 加入加入3倍胰酶體積的完全培養(yǎng)液。用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培倍胰酶體積的完全培養(yǎng)液。用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。4. 收集細(xì)胞懸液于離心管中，室溫離心收集細(xì)胞懸液于離心管中，室溫離心5分鐘。

8、分鐘。5. 去上清，加適量新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吸取一定量至去上清，加適量新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吸取一定量至有新培養(yǎng)皿中，添加適量新鮮完全培養(yǎng)基。有新培養(yǎng)皿中，添加適量新鮮完全培養(yǎng)基。 余下的細(xì)余下的細(xì)胞懸液接種于原來(lái)的培養(yǎng)皿內(nèi)。胞懸液接種于原來(lái)的培養(yǎng)皿內(nèi)。6. 將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意事項(xiàng)1 1傳代培養(yǎng)時(shí)要注意傳代培養(yǎng)時(shí)要注意無(wú)菌操作無(wú)菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材

9、。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。應(yīng)嚴(yán)格分開。 2 2傳代時(shí)間的掌握傳代時(shí)間的掌握：每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是：每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。致密時(shí)即可傳代。 3 3、消化時(shí)間的掌握消化時(shí)間的掌握1. Pipette off spent medium and discard2. Add PBS to the flask, being careful not to disturb the monolayer. Rinse the monolayer by gently rocking the

10、flask back and forth. Remove the PBS and discard.3. Add trypsin and rock the flask to ensure that the entire monolayer is covered with the trypsin solution.4. Incubate until the cells begin to detach. 5. Add serum-containing medium and pipette the cells up and down until the cells are dispersed into

11、 a single cell suspension.6. Count the cell either by hemocytometer or Coulter counter and dilute to the appropriate concentration for seeding.7. Add the appropriate volume of cell suspension to a new flask containing medium.8. Place flask in incubator, loose the cap turn to allow for gas exchange.D

12、iscussion Serum contains trypsin inhibors.Thus it is important to remove traces of serun in step 2.The serum in the medium in step 5 will inactivate the remaing trypsin and prevent cell damage.If dealing with a serum-free medium, it may be necessary to use an alternative trypsin inhibitor such as so

13、ybean trypsin inhibitor.The incubation time for the trypsin and the degree of force reqired to get the cells into single cell suspension varies between cell lines.It may be necessary to adjust these parameters to suit your particular cells.本次課內(nèi)容：傳代培養(yǎng)本次課內(nèi)容：傳代培養(yǎng)(RSC96)1. 棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。加入加入23ml的的PBS液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，除去懸液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。浮在細(xì)胞表面的碎片。2. 加入加入0.5-1 ml 0.25的胰蛋白酶液，輕輕震蕩之后去掉，在顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)的胰蛋白酶液，輕輕震蕩之后去掉，在顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。測(cè)。3. 加入加入3ml完全培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)