實(shí)驗(yàn)三、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

1、實(shí)驗(yàn)三、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化二零一二.十植物基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)植物基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)1I.調(diào)整期調(diào)整期（lag phase）II.對(duì)數(shù)期對(duì)數(shù)期( logarithmic phase)III.穩(wěn)定期穩(wěn)定期（stationary phase）IV.衰亡期衰亡期（decline phase）在在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD值可以代表菌體密度，細(xì)菌懸液濃度與光密度成正值可以代表菌體密度，細(xì)菌懸液濃度與光密度成正比比，可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來推知菌液濃度。但，可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來推知菌液濃度。但當(dāng)生長(zhǎng)當(dāng)生長(zhǎng)到一定時(shí)間后，到一定時(shí)間后，OD值不會(huì)再值不會(huì)再增加增加.2 農(nóng)桿菌

2、是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。發(fā)狀根。 根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有TiTi質(zhì)粒和質(zhì)粒和RiRi質(zhì)粒，其質(zhì)粒，其上有一段上有一段T-DNAT-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNAT-DNA插入到插入到植物基因組中植物基因組中, ,并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為

3、并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNAT-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。 特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。的遺傳轉(zhuǎn)化。3農(nóng)桿菌感受態(tài)農(nóng)桿菌感受態(tài)u 感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞（細(xì)胞（compe

4、tent cell)是是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理的一種特殊生理狀態(tài)狀態(tài).u 重組重組DNA要導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其生理狀態(tài)很重要，需要將細(xì)胞進(jìn)行特要導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其生理狀態(tài)很重要，需要將細(xì)胞進(jìn)行特殊處理，使細(xì)胞膜透性發(fā)生暫時(shí)性改變，成為容易接受外源殊處理，使細(xì)胞膜透性發(fā)生暫時(shí)性改變，成為容易接受外源DNA分分子的狀態(tài)，即成為感受態(tài)細(xì)胞。子的狀態(tài)，即成為感受態(tài)細(xì)胞。u 電擊法，電擊法， CaCl2法。法。u 不同的轉(zhuǎn)化方法需制備不同的感受態(tài)。不同的轉(zhuǎn)化方法需制備不同的感受態(tài)。u CaCl2法制備感受態(tài)：法制備感受態(tài)：正在正在生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的生

5、長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶溶液中，液中，0下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出呈現(xiàn)出感受態(tài)感受態(tài).4農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備A 挑取農(nóng)桿菌單菌落于液體培養(yǎng)基中，挑取農(nóng)桿菌單菌落于液體培養(yǎng)基中，28 C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜活化振蕩培養(yǎng)過夜活化B 菌液按菌液按1:50的比例轉(zhuǎn)接于的比例轉(zhuǎn)接于50ml新鮮培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600為為0.4-0.6； C 菌液轉(zhuǎn)移至菌液轉(zhuǎn)移至10 ml的離心管中，的離心管中，冰浴冰浴30 minD 4，5 000 rpm5 000 rpm離心

6、離心5 min, 5 min, 棄棄上清，收集菌體上清，收集菌體E 菌體重懸于菌體重懸于4ml冰預(yù)冷的冰預(yù)冷的20 mM的的CaCl2中，中，冰浴冰浴10-20 minF 4，5 000 rpm5 000 rpm離心離心5 min5 min，棄上清，棄上清G 菌體重懸于菌體重懸于1ml冰預(yù)冷的冰預(yù)冷的20 mM的的CaCl2，分裝分裝100l/管，管，24 h內(nèi)使用或液氮速凍內(nèi)使用或液氮速凍后后-70 C保存保存5u OD600：0.40.6u OD值超過值超過0.6必須重新活化必須重新活化u 當(dāng)當(dāng)OD達(dá)到達(dá)到0.3時(shí)，每隔時(shí)，每隔20min測(cè)一次測(cè)一次OD值。值。u 分光光度計(jì)分光光度計(jì)要測(cè)

7、試要測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)，有沉淀要狀態(tài)，有沉淀要搖勻。注意搖勻。注意比比色色杯的正確選擇及使用杯的正確選擇及使用光電比色法定量測(cè)試原理：朗伯比爾定律：光電比色法定量測(cè)試原理：朗伯比爾定律：“當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí)勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí), , 其吸光度其吸光度A A與吸光物質(zhì)的濃度與吸光物質(zhì)的濃度c c及吸收層厚度及吸收層厚度b b成正比成正比”。其中其中“吸收層厚度吸收層厚度”就是實(shí)踐中的比色杯厚度，如果測(cè)試中使用的比色杯不是同就是實(shí)踐中的比色杯厚度，如果測(cè)試中使用的比色杯不是同一套，就無法保證

8、其厚度一致，也就人為導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)偏差。一套，就無法保證其厚度一致，也就人為導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)偏差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)玻璃比色杯只適用于可見光區(qū), ,在紫外區(qū)測(cè)定時(shí)要用石英比色杯。石英玻璃在紫在紫外區(qū)測(cè)定時(shí)要用石英比色杯。石英玻璃在紫外線到紅外線的整個(gè)光譜波段都有較好的透光性能，可見光透過率在以外線到紅外線的整個(gè)光譜波段都有較好的透光性能，可見光透過率在以上，特別是在紫外光譜區(qū)，最大透過率可達(dá)以上，而普通的玻璃在紫外光上，特別是在紫外光譜區(qū)，最大透過率可達(dá)以上，而普通的玻璃在紫外光譜區(qū)的透過率較差。一般，測(cè)定波長(zhǎng)在譜區(qū)的透過率較差。一般，測(cè)定波長(zhǎng)在350350毫微米以上時(shí)，可以用玻璃比

9、色杯；毫微米以上時(shí)，可以用玻璃比色杯；若在若在350350毫微米以下，必需使用石英比色杯。毫微米以下，必需使用石英比色杯。 6農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化均勻涂布在含均勻涂布在含Rif和和Kan的的YEP平板上，平板上，28 C溫育溫育48 h至菌落出現(xiàn)至菌落出現(xiàn)離心離心去上清，將細(xì)胞重懸于去上清，將細(xì)胞重懸于200L YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中加入加入1 mLYEP培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，28慢搖培養(yǎng)慢搖培養(yǎng)2-4 h液氮中速凍液氮中速凍1 min,迅速置于迅速置于37水浴中水浴中5 min取取100L農(nóng)桿菌感受態(tài)，加入約農(nóng)桿菌感受態(tài)，加入約0.5-1g質(zhì)粒質(zhì)粒DNA,混勻后冰浴混勻后冰浴30 min 載體

10、分子帶有抗生素抗性基因（載體分子帶有抗生素抗性基因（kankan），感受態(tài)受體細(xì)胞本身不具），感受態(tài)受體細(xì)胞本身不具有抗生素的抗性，沒有導(dǎo)入載體的細(xì)胞在抗生素培養(yǎng)基上便不能生長(zhǎng)。有抗生素的抗性，沒有導(dǎo)入載體的細(xì)胞在抗生素培養(yǎng)基上便不能生長(zhǎng)。7u感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率關(guān)鍵是菌液感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率關(guān)鍵是菌液OD值的控制。值的控制。u轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)細(xì)胞的活性以及外載體分子的質(zhì)量，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)細(xì)胞的活性以及外載體分子的質(zhì)量，質(zhì)粒/連接產(chǎn)物。連接產(chǎn)物。u用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNADNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNADNA的濃度的濃度在一定范圍內(nèi)成

11、正比，但當(dāng)加入的外源在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNADNA的量過多或體積過大時(shí)，的量過多或體積過大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。轉(zhuǎn)化效率低。u整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率將會(huì)整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。降低。u防止雜菌和雜防止雜菌和雜DNADNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所有的試劑都要滅菌所有的試劑都要滅菌8u感受態(tài)長(zhǎng)期保存要進(jìn)行速凍，立即用感受態(tài)長(zhǎng)期保存要進(jìn)行速凍，立即用-80 冰箱或液氮速凍，而在使用冰箱或液氮速凍，而在使用時(shí)，用時(shí)，用37 水浴或手掌體溫進(jìn)行速融，避免冰晶形成過程對(duì)細(xì)胞造成的水浴或手掌體溫進(jìn)行速融，避免冰晶形成過程對(duì)細(xì)胞造成的傷害，導(dǎo)致細(xì)胞破損不能存活。傷害，導(dǎo)致細(xì)胞破損不能存活。u感受態(tài)細(xì)胞不能反復(fù)凍融。感受態(tài)細(xì)胞不能反復(fù)