化學發(fā)光免疫分析技術 (5)

1、關于化學發(fā)光免疫分析技術關于化學發(fā)光免疫分析技術 (5)現在學習的是第一頁，共29頁發(fā)光：發(fā)光：是指分子或原子中的電子吸收能量后，由是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)基態(tài)（較低能級）躍遷到（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)（較高能級），然（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程?；鶓B(tài)基態(tài)v0激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)v能量能量h.v普朗克公式，能量普朗克公式，能量=h.vh為普朗克常數，為普朗克常數，v為頻率為頻率發(fā)光發(fā)光現在學習的是第二頁，共29頁發(fā)光的分類發(fā)光的分類是指發(fā)光劑（熒光素）是指發(fā)光劑（熒光素）經短波長的入射光照射經短波長的入射光照射后后，電子吸收能

2、量躍，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回遷到激發(fā)態(tài)，在其回復至基態(tài)時，復至基態(tài)時，發(fā)射出較發(fā)射出較長波長的可見光長波長的可見光（熒光）（熒光）。是指發(fā)生在生物體內的是指發(fā)生在生物體內的發(fā)光現象發(fā)光現象。如螢火蟲的。如螢火蟲的發(fā)光，反應底物為螢火發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用的催化下，利用ATP能能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形多余的能量以光子的形式釋放出來。式釋放出來。是指伴隨化學反應過程是指伴隨化學反應過程所產生的光的發(fā)射現象所產生的光的發(fā)射現象。某些物質（發(fā)光劑）某些物質（發(fā)光劑

3、）在化學反應時吸收了反在化學反應時吸收了反應過程中的化學能，使應過程中的化學能，使反應的產物分子或中間反應的產物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能射光子的形式釋放出能量的現象。量的現象。根據形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為根據形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:現在學習的是第三頁，共29頁間接化學發(fā)光間接化學發(fā)光直接化學發(fā)光直接化學發(fā)光 A + B C* C* C + h.v A + B C* C* + D C + D* D* D + h.v 化學發(fā)光的原理化學發(fā)光的原理現在學

4、習的是第四頁，共29頁化學發(fā)光的分類化學發(fā)光的分類酶促化學發(fā)光：酶促化學發(fā)光： 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶- -魯米諾（魯米諾（HRP- -Luminol）系統(tǒng)）系統(tǒng) 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（ALP）系統(tǒng)）系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學發(fā)光：非酶促化學發(fā)光： 吖啶酯系統(tǒng)吖啶酯系統(tǒng) 草酸酯系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng) 閃光（閃光（Flash）：）： 發(fā)光時間在發(fā)光時間在數秒數秒內，如吖啶酯內，如吖啶酯輝光（輝光（Glow）： 發(fā)光時間在發(fā)光時間在數十分鐘數十分鐘以上，如：以上，如： HRP-Luminol系統(tǒng)系統(tǒng) 二氧雜環(huán)乙烷二氧雜環(huán)乙烷APAP發(fā)光（發(fā)光（AP-AMPPD）系統(tǒng)）系統(tǒng) 黃

5、嘌呤氧化酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)現在學習的是第五頁，共29頁在化學發(fā)光反應中參與能量轉移并最終以在化學發(fā)光反應中參與能量轉移并最終以發(fā)發(fā)射光子射光子的形式釋放能量的化合物，稱為的形式釋放能量的化合物，稱為或或?？煞譃椤？煞譃橹苯踊瘜W發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑和和酶促反應發(fā)光劑酶促反應發(fā)光劑?；瘜W發(fā)光劑化學發(fā)光劑現在學習的是第六頁，共29頁能作為能作為化學發(fā)光劑化學發(fā)光劑的條件：的條件：發(fā)光的量子發(fā)光的量子產率高產率高；它的物理它的物理-化學特性要與被標記或測定的化學特性要與被標記或測定的 物質物質相匹配相匹配；能與抗原或抗體形成能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯結合物穩(wěn)定的偶聯結合物； 其化學發(fā)光常是其化學

6、發(fā)光常是氧化反應氧化反應的結果；的結果；在所使用的濃度范圍內對生物體在所使用的濃度范圍內對生物體沒有毒性沒有毒性。現在學習的是第七頁，共29頁 在發(fā)光免疫分析過程中在發(fā)光免疫分析過程中不不需要酶需要酶的催化作用，的催化作用，直接直接參與發(fā)光反應，參與發(fā)光反應，它們在化學結構上有產生發(fā)光的它們在化學結構上有產生發(fā)光的特有基團特有基團，可直接標記抗原或抗體。，可直接標記抗原或抗體。（一）直接化學發(fā)光劑（一）直接化學發(fā)光劑1. 吖啶酯吖啶酯 2. 三聯吡啶釕三聯吡啶釕現在學習的是第八頁，共29頁吖啶酯吖啶酯 在在堿性條件堿性條件下被下被H2O2氧化氧化時，發(fā)出波時，發(fā)出波長為長為470 nm的光，具

7、有很高的發(fā)光效率，其激的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產物發(fā)態(tài)產物 是該發(fā)光反應體系的發(fā)光是該發(fā)光反應體系的發(fā)光體。體。 現在學習的是第九頁，共29頁利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類光，這一類需酶催化需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為后發(fā)光的發(fā)光劑稱為。（二）（二） 酶促反應發(fā)光劑：酶促反應發(fā)光劑：1. 魯米諾魯米諾 2. AMPPD10現在學習的是第十頁，共29頁魯米諾（魯米諾（Luminol）發(fā)光原理）發(fā)光原理辣根過氧化酶辣根過氧化酶現在學習的是第十一頁，共29頁文字內容文字內容魯米諾（魯米諾（Luminol）增強發(fā)光反應原理）增強發(fā)光反

8、應原理雙負離子雙負離子鐵氰化鉀催化鐵氰化鉀催化H2O2產生產生O23-氨基氨基-鄰鄰苯二甲酸苯二甲酸（激發(fā)態(tài)）（激發(fā)態(tài)）過氧化物不穩(wěn)定，分過氧化物不穩(wěn)定，分解產生解產生N2現在學習的是第十二頁，共29頁(Chemiluminescence immunoass- ay,CLIA)，是將具有是將具有高靈敏度高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與的化學發(fā)光測定技術與高高特異性特異性的免疫反應相結合，用于各種的免疫反應相結合，用于各種抗原抗原、半抗原半抗原、抗抗體體、激素激素、酶酶、脂肪酸脂肪酸、維生素維生素和和藥物藥物等的檢測分析等的檢測分析技術。是繼技術。是繼放射免疫分析放射免疫分析、酶免疫分析酶免疫分析、

9、熒光免疫分熒光免疫分析析和和膠體時間分辨熒光免疫分析膠體時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項新之后發(fā)展起來的一項新的免疫分析技術。的免疫分析技術?；瘜W發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析現在學習的是第十三頁，共29頁化學發(fā)光免疫化學發(fā)光免疫分析類型分析類型直接化學發(fā)光直接化學發(fā)光免疫分析免疫分析化學發(fā)光酶化學發(fā)光酶免疫分析免疫分析電化學發(fā)光電化學發(fā)光免疫分析免疫分析現在學習的是第十四頁，共29頁一、直接化學發(fā)光免疫分析一、直接化學發(fā)光免疫分析用用吖啶酯吖啶酯直接標記抗體（抗原），與待測標本中直接標記抗體（抗原），與待測標本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成

10、固相固相包被抗體包被抗體-待測抗原待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物吖啶酯標記抗體復合物，這時只，這時只需加入需加入氧化劑（氧化劑（H2O2）和）和NaOH使成堿性環(huán)境，使成堿性環(huán)境，吖吖啶酯啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產單位時間內所產生的光子能生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量?，F在學習的是第十五頁，共29頁直接化學發(fā)光的機理直接化學發(fā)光的機理現在學習的是第十

11、六頁，共29頁磁磁微粒微粒模式圖模式圖Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特點特點 抗原和抗體結抗原和抗體結合與未合與未結合部結合部分分的的易易分離分離磁微粒技術磁微粒技術磁性納米粒子與無機或有機分子結合磁性納米粒子與無機或有機分子結合形成的可均勻分散于一定基液中具有形成的可均勻分散于一定基液中具有高度穩(wěn)定性的膠態(tài)復合材料高度穩(wěn)定性的膠態(tài)復合材料 現在學習的是第十七頁，共29頁二、化學發(fā)光酶免疫分析二、化學發(fā)光酶免疫分析（

12、Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（HRP）或）或堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（ALP）來標記抗原或抗體，在與待測標來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相包固相包被抗體被抗體-待測抗原待測抗原-酶標記抗體復合物酶標記抗體復合物，經洗滌后，加，經洗滌后，加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光，由入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光，由光光量子閱讀系統(tǒng)量子閱讀系統(tǒng)接收，光電

13、倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦沤邮?，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數據處理系統(tǒng)號并加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。，計算出測定物的濃度。現在學習的是第十八頁，共29頁此處添加內容此處添加內容該分析系統(tǒng)采用該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（HRP）標標記抗體（或抗原），在與反應體系中的待記抗體（或抗原），在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶（酶（HRP）標記抗）標記抗體復合物體復合物，這時加入，這時加入魯米諾發(fā)光劑、魯米諾發(fā)光劑

14、、H2O2和和化學發(fā)光增強劑化學發(fā)光增強劑使產生化學發(fā)光。使產生化學發(fā)光。辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析現在學習的是第十九頁，共29頁辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 現在學習的是第二十頁，共29頁現在學習的是第二十一頁，共29頁化學發(fā)光免疫分析儀化學發(fā)光免疫分析儀優(yōu)點優(yōu)點1.靈敏度高靈敏度高 ：CLIA關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達10-16mol/L(RIA為為10-12mol/L) 。2.寬的線性動力學范圍寬的線性動力學范圍 ：發(fā)光強度在：發(fā)光強度在46個量級之間個量級之間與測

15、定物質濃度間呈線性關系。與測定物質濃度間呈線性關系。 3.光信號持續(xù)時間長光信號持續(xù)時間長 ：輝光型的：輝光型的CLIA產生的光信號持產生的光信號持續(xù)時間可達數小時甚至一天，簡化了實驗操作及測量。續(xù)時間可達數小時甚至一天，簡化了實驗操作及測量。 4.分析方法簡便快速分析方法簡便快速 ：絕大多數分析測定均為僅需：絕大多數分析測定均為僅需加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。 5.結果穩(wěn)定、誤差小結果穩(wěn)定、誤差?。簶悠废抵苯幼约喊l(fā)光，不需：樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，分析結果靈敏穩(wěn)定可靠要任何光源照射，分析結果靈敏穩(wěn)定可靠6.安全性好及使用期長安全

16、性好及使用期長 ：免除了使用放射性物質。：免除了使用放射性物質。 現在學習的是第二十二頁，共29頁現在學習的是第二十三頁，共29頁化學發(fā)光免疫分析的應用（一）化學發(fā)光免疫分析的應用（一） 肺結核病常以人體血清中肺結核病常以人體血清中CA125 含量為疾病標記物，含量為疾病標記物，Wang 等建立了等建立了CA125 的毛細管化學發(fā)光免疫分析方法的毛細管化學發(fā)光免疫分析方法，以實現對肺結核病的檢測。，以實現對肺結核病的檢測。 Knight 等采用等采用化學發(fā)光免疫夾心分析方法對梅毒病毒進行檢測，化學發(fā)光免疫夾心分析方法對梅毒病毒進行檢測，并與并與傳統(tǒng)的分析方法快速血漿素反應（傳統(tǒng)的分析方法快速血

17、漿素反應（RPR）和酶免疫分析方法（）和酶免疫分析方法（ELI SA）進行比較，通過對多種樣品進行檢測，并與）進行比較，通過對多種樣品進行檢測，并與RPR 及及ELISA分析方法分析方法結果相比有結果相比有 99.1的正確率。的正確率。 甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）為腫瘤疾病標志物，）為腫瘤疾病標志物，Zhang 等利用磁性微粒子和包等利用磁性微粒子和包被小管建立了被小管建立了AFP 的化學發(fā)光酶免疫分析方法的化學發(fā)光酶免疫分析方法。在該方法中，。在該方法中，AFP抗抗體首先包被于兩種不同的固相載體上，如磁性微粒子和包被小管，再體首先包被于兩種不同的固相載體上，如磁性微粒子和包被小管，再分別對

18、這兩種包被模式建立的化學發(fā)光免疫分析方法進行比較。通過分別對這兩種包被模式建立的化學發(fā)光免疫分析方法進行比較。通過再抗體包被濃度、標記于抗體上再抗體包被濃度、標記于抗體上HRP 的稀釋比例、分析所需時間、化的稀釋比例、分析所需時間、化學發(fā)光動力學等角度進行衡量，顯示磁性微粒子具有較大的優(yōu)勢。學發(fā)光動力學等角度進行衡量，顯示磁性微粒子具有較大的優(yōu)勢。醫(yī)學檢測醫(yī)學檢測現在學習的是第二十四頁，共29頁化學發(fā)光免疫分析的應用（二）化學發(fā)光免疫分析的應用（二） Quan 等建立了食品中等建立了食品中伏馬菌素伏馬菌素B1 的化學發(fā)光酶免疫分析方法的化學發(fā)光酶免疫分析方法，與伏，與伏馬菌素馬菌素B1 的的

19、ELISA 方法相比，其方法靈敏度提高了方法相比，其方法靈敏度提高了10 倍。且通過樣倍。且通過樣品的添加回收率試驗表明其有良好的回收率，其分析結果與品的添加回收率試驗表明其有良好的回收率，其分析結果與ELISA 分分析方法與析方法與 HPLC 方法有良好的相關性。方法有良好的相關性。 Yang 等建立了食品中等建立了食品中葡萄球菌腸毒素葡萄球菌腸毒素B（SEB）的碳納米管的化學發(fā)）的碳納米管的化學發(fā)光免疫分析方法光免疫分析方法，通過將，通過將SEB 抗體吸附在碳納米管表面抗體吸附在碳納米管表面 ，然后將抗體，然后將抗體碳納米管固定在聚碳酸酯表面，再通過增強化學發(fā)光免疫法測定碳納米管固定在聚碳

20、酸酯表面，再通過增強化學發(fā)光免疫法測定SEB 含量。含量。 Magliulo 等建立了等建立了牛奶中黃曲霉毒素牛奶中黃曲霉毒素M1的化學發(fā)光酶免疫分析方法的化學發(fā)光酶免疫分析方法，通過將黃曲霉毒素，通過將黃曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通過酶標二牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通過酶標二抗在含有魯米諾的基板上進行檢測?？乖诤恤斆字Z的基板上進行檢測。 Lin 等建立了等建立了農產品中黃曲霉毒素農產品中黃曲霉毒素B1 的化學發(fā)光免疫分析方法的化學發(fā)光免疫分析方法。同時。同時， 將建立的分析方法與黃曲霉毒素商品化酶聯免疫試劑盒進行了相關將建立的分析方法與黃曲霉毒素商品化酶聯免疫試劑盒進行了

21、相關性試驗，相關系數為性試驗，相關系數為0.9098，顯示其有較好的應用前景。，顯示其有較好的應用前景。食品安全檢測食品安全檢測現在學習的是第二十五頁，共29頁化學發(fā)光免疫分析的應用（三）化學發(fā)光免疫分析的應用（三） Christian 等通過化學發(fā)光酶免疫分析方法建立了等通過化學發(fā)光酶免疫分析方法建立了環(huán)境內分泌干擾物環(huán)境內分泌干擾物炔雌醇的免疫分析方法炔雌醇的免疫分析方法，并通過建立的分析方法對表面水和污水處，并通過建立的分析方法對表面水和污水處理廠的污水中的炔雌醇進行測定。理廠的污水中的炔雌醇進行測定。 Pittman 等通過磁性小珠和生物素等通過磁性小珠和生物素-親和素為載體建立了親和

22、素為載體建立了水樣和土樣水樣和土樣中中2，4，6-三硝基甲苯的免疫夾心電化學發(fā)光免疫分析方法三硝基甲苯的免疫夾心電化學發(fā)光免疫分析方法。 Zhao 等通過建立等通過建立微板式磁化學發(fā)光酶免疫分析方法來對水樣中微板式磁化學發(fā)光酶免疫分析方法來對水樣中17 -雌二醇進行檢測雌二醇進行檢測。通過微板磁性分離器可避免前處理過程以達到高。通過微板磁性分離器可避免前處理過程以達到高通量分析，再結合高靈敏度的化學發(fā)光體系，建立了該方法。通量分析，再結合高靈敏度的化學發(fā)光體系，建立了該方法。環(huán)境科學環(huán)境科學現在學習的是第二十六頁，共29頁發(fā)展與展望發(fā)展與展望 具有具有選擇性好選擇性好、靈敏度高靈敏度高、分析速

23、度快分析速度快、設備簡單設備簡單等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復雜、低豐度的樣品進行了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復雜、低豐度的樣品進行測定，因而化學發(fā)光免疫分析法逐漸向測定，因而化學發(fā)光免疫分析法逐漸向的方向發(fā)展。的方向發(fā)展。 化學發(fā)光成像技術化學發(fā)光成像技術、化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析與與分離技術分離技術的聯用，的聯用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度、檢測速度和檢測通量得到進一步可以使免疫分析的選擇性、靈敏度、檢測速度和檢測通量得到進一步提高。為了更好地適應臨床、環(huán)境等領域的實際應用，需要大力發(fā)展提高。為了更好地適應臨床、環(huán)境等領域的實際應用，需要大力發(fā)展微型化微型化、集成化集