貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同課件

1、 實驗實驗(shyn)三、細胞的傳代與凍存三、細胞的傳代與凍存第一頁，共二十頁。l1. 1.細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？l2.2.使用使用(shyng)(shyng)血清需注意哪些方面？血清需注意哪些方面？l3.3.消化液胰酶的濃度是多少？消化液胰酶的濃度是多少？l4.4.使用小濾器過濾要注意哪些？使用小濾器過濾要注意哪些？第二頁，共二十頁。 針頭濾器針頭濾器(lq)(lq)使用應注意的問題使用應注意的問題 1. 1.擰緊濾器擰緊濾器 2.2.注射器吸液體注射器吸液體 3.3.注射器插好濾器注射器插好濾器 4.4.對著燒杯慢推壓針芯看是否漏對著燒杯慢推壓針芯看是否漏 5

2、.5.如不漏對小瓶過濾。如不漏對小瓶過濾。 6.6.濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復屢次，濾完。屢次，濾完。 7.7.檢查濾器濾膜是否完好。檢查濾器濾膜是否完好。第三頁，共二十頁。一、實驗原理一、實驗原理(yunl)(yunl) 細胞貼壁過程細胞貼壁過程第四頁，共二十頁。培養(yǎng)細胞一代(y di)生長過程第五頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同 什么什么(shn me)(shn me)時候傳代？時候傳代？第六頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同第七頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同 細胞消化細胞

3、消化(xiohu)(xiohu)的最正確程度的最正確程度第八頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同 細胞凍存細胞凍存要求要求凍存條件凍存條件(tiojin)(tiojin)操作要點操作要點 第九頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同二、實驗目的 掌握無菌操作技術。 掌握傳代細胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。 掌握培養(yǎng)細胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)(xngti)和生長狀況。第十頁，共二十頁。三、實驗材料及設備三、實驗材料及設備 1. 1. 細胞細胞 人宮頸癌人宮頸癌HeLa HeLa 細胞細胞 人胃癌人胃癌BGC-823BGC-823細胞細胞2.

4、 2. 試劑試劑 胰酶、DMEM培養(yǎng)基、血清、DMSO、抗生素 3. 3. 儀器儀器 超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管(shgun)，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈 第十一頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同四、實驗步驟四、實驗步驟1. 1.準備：超凈工作臺紫外線處理準備：超凈工作臺紫外線處理3030分鐘分鐘, , 用肥皂洗手用肥皂洗手, , 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 2. 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要

5、稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)(piyng)(piyng)用液置用液置室溫下預熱。室溫下預熱。3 3關閉超凈臺紫外燈關閉超凈臺紫外燈, , 翻開可見光燈開關翻開可見光燈開關, ,翻開抽風翻開抽風機清潔空氣，除去臭氧。用機清潔空氣，除去臭氧。用75%75%酒精擦雙手消毒酒精擦雙手消毒 。 4.4.正確擺放超凈臺內(nèi)的實驗用品：酒精燈、酒精棉球、正確擺放超凈臺內(nèi)的實驗用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒頭、吸管筒新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒頭、吸管筒頭、廢液缸等。點燃酒精燈，準備好實驗試劑：頭、廢液缸等。點燃酒精燈，準備好實驗試劑：DMEMDMEM培養(yǎng)基其中血清含量

6、培養(yǎng)基其中血清含量10%10%、 血清、胰酶血清、胰酶等。等。第十二頁，共二十頁。第十三頁，共二十頁。5.點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6.將培養(yǎng)用液90mL) 瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7. 翻開血清10.5mL) 瓶，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。8. 無菌吸取10mL血清參加到培養(yǎng)液90mL)中，用微量移液器參加雙抗100L輕輕混勻，配置(pizh)完全培養(yǎng)基。9. 在血清中剩余0.5mL) 參加4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，參加0.5mL DMSO凍存保護劑，輕輕混勻即為凍存液 。

7、第十四頁，共二十頁。第十五頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同10.細胞(xbo)瓶口靠近火焰翻開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基對于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出11.加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細胞，棄胰酶，再參加一滴管或兩滴管胰酶以蓋住細胞量為準，轉動培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個細胞層，蓋好瓶蓋。12.顯微鏡下觀察細胞的消化狀態(tài)，待細胞大局部收縮、突起、一半變圓，細胞邊界清晰時，即可立起或翻轉培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺內(nèi)靠近火焰處棄胰酶第十六頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同13. 加兩滴管約1.8-2mL凍存液既全面吹打細胞瓶壁,吹

8、打均勻，細胞濃度宜大，3106個/mL左右。將細胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標記(bioj)好細胞種類，凍存時間，保存條件以及凍存者姓名等懸浮細胞凍存將細胞離心后再加凍存液在培養(yǎng)瓶(剩余少量細胞中參加5mL完全培養(yǎng)及，蓋好瓶蓋擰緊后并旋回半圈。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。凍存管在4度以下存放30min，轉放到20度 1.52h，再轉到70度412h后即可轉移到液氮內(nèi)，注意做好凍存記錄。第十七頁，共二十頁。把握好傳代時機，80-90%集合度階段最好，過早細胞產(chǎn)量少，過晚細胞健康狀態(tài)不佳消化時間要適度，過短細胞不易脫落，過長細胞可脫落流失。消化液濃度

9、(nngd)要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反響快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。不同細胞對消化反響不同。 貼壁不牢直接吹下細胞損傷本卷須知本卷須知第十八頁，共二十頁。1. 1.試述傳代培養(yǎng)的步驟和本卷須知，并指出哪些是關鍵步驟試述傳代培養(yǎng)的步驟和本卷須知，并指出哪些是關鍵步驟? ?2.2.細胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么細胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么? ? 3.3.貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同? ? 4.4.如何估計是否傳代和傳代的方式如何估計是否傳代和傳代的方式(fngsh)?(fngsh)?5.5.細胞凍存應注意的問題。細胞凍存應注意的問題。思考題第十九頁，共二十頁。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同內(nèi)容(nirng)總結實驗三、細胞的傳代與凍存。3關閉超凈臺紫外燈, 翻開可見光燈開關,翻開抽風機清潔空氣，除去臭氧。取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管。6.將培養(yǎng)