DNA瓊脂糖凝膠電泳ppt課件

1、DNADNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 二二學(xué)時(shí)：學(xué)時(shí)：3 31 1、掌握瓊脂糖凝膠電泳分別核酸的、掌握瓊脂糖凝膠電泳分別核酸的原理和方法。原理和方法。2 2、學(xué)習(xí)核酸染色的方法。、學(xué)習(xí)核酸染色的方法。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂?、?shí)驗(yàn)?zāi)康模?一電泳技術(shù)：一電泳技術(shù)： 1 1、電泳定義：是指帶電粒子在電場中、電泳定義：是指帶電粒子在電場中向與其本身所帶電荷相反的電極方向挪動的向與其本身所帶電荷相反的電極方向挪動的景象。景象。 根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，可分為濾紙，根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，可分為濾紙，醋酸纖維薄膜，淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺醋酸纖維薄膜，淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳技術(shù)

2、的運(yùn)用非常廣泛，從凝膠電泳等。電泳技術(shù)的運(yùn)用非常廣泛，從分別小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到分別小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒的分別鑒定都依賴于電泳技術(shù)。的分別鑒定都依賴于電泳技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理: 1帶電顆粒的大小和外形：顆粒越大，電泳速度帶電顆粒的大小和外形：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；越慢，反之越快；2顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；之越快；3 溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；越快；

3、4溶液的溶液的pH值：影響被分別物質(zhì)的解離度，離等值：影響被分別物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快；電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快； 2 2、影響電泳的主要要素：、影響電泳的主要要素： 5電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快；之越快；6離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；之越快；7電滲景象：電場中，液體相對于固體支持物的電滲景象：電場中，液體相對于固體支持物的相對挪動；相對挪動；8支持物篩孔大?。嚎讖叫?，電泳速度慢，反之支持物篩孔大?。嚎讖叫?，電泳速度慢，反之那么快。那么快。

4、l瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳分別方法，是一種簡便、快速分別鑒定核酸的方法，已泳分別方法，是一種簡便、快速分別鑒定核酸的方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研討中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。成為分子生物學(xué)及基因工程研討中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。l瓊脂糖英文名瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來的，由半，是從瓊脂中提取出來的，由半乳糖和乳糖和3.6-脫水脫水- 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可構(gòu)成多孔的凝膠，電泳瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可構(gòu)成多孔的凝膠，電泳中具有分子

5、篩效應(yīng)。中具有分子篩效應(yīng)。二瓊脂糖凝膠電泳分別核酸的原理：二瓊脂糖凝膠電泳分別核酸的原理：lDNADNA分子在分子在pHpH高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極挪動電荷效應(yīng)中向正極挪動電荷效應(yīng) 。lDNADNA分子泳動速率的大小除與分子泳動速率的大小除與DNADNA分子的帶電量有關(guān)外，分子的帶電量有關(guān)外，還與還與DNADNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)瓊脂糖凝膠的分子分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)瓊脂糖凝膠的分子篩效應(yīng)。篩效應(yīng)。l電泳時(shí)，用溴酚藍(lán)做前沿指示劑，指示電泳時(shí)，用溴酚藍(lán)做前沿指示劑，指示DNADNA樣品在凝膠樣品在凝膠中確實(shí)切位置。中確實(shí)切位置。l溴

6、乙啶是一種熒光染料，可插入溴乙啶是一種熒光染料，可插入DNADNA雙螺旋構(gòu)造的兩個(gè)雙螺旋構(gòu)造的兩個(gè)堿基對之間，與堿基對之間，與DNADNA分子構(gòu)成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下分子構(gòu)成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。這次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用溴乙啶替代品發(fā)出橙黃色的熒光。這次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用溴乙啶替代品DNAgreenDNAgreenDNAgreen核酸染料vDNAgreen是一種花箐類染料，具有平安、靈敏作為各種核酸電泳的染色劑。vDNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm還有一個(gè)吸收峰，與核酸結(jié)合后發(fā)射綠色熒光，因此在紫外凝膠透射儀上可以檢測出DNA樣品。v作為EB的一種替代品。1

7、核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分別的關(guān)系核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分別的關(guān)系 凝膠中，凝膠中，DNA片段遷移率與片段遷移率與DNA分子大小成反比分子大小成反比( 20kb) ，因此經(jīng)過知大小的規(guī)范物挪動的間隔與未知片段的，因此經(jīng)過知大小的規(guī)范物挪動的間隔與未知片段的挪動間隔時(shí)行比較，便可測出未知片段的大小。挪動間隔時(shí)行比較，便可測出未知片段的大小。2核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分別的關(guān)系核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分別的關(guān)系 不同構(gòu)型不同構(gòu)型DNA的挪動速度次序?yàn)椋洪]環(huán)的挪動速度次序?yàn)椋洪]環(huán)DNA直線直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA(當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA不能不能進(jìn)

8、入膠中進(jìn)入膠中)。3不同大小的不同大小的DNA需求用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)展電泳需求用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)展電泳分別。分別。瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀線狀DNA大小大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：注：DNA片段在片段在5-500bp之間時(shí)，普通用聚丙烯酰胺凝膠電之間時(shí)，普通用聚丙烯酰胺凝膠電泳泳PAGE進(jìn)展電泳分別。進(jìn)展電泳分別。三瓊脂糖凝膠電泳分別核酸的影響要素三瓊脂糖凝膠電泳分別核酸的影響要素1 1操作簡單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度操作簡單、制備容易快速

9、、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分別快、分別DNADNA片段范圍廣、樣品不需事先處置就可以進(jìn)展電泳。片段范圍廣、樣品不需事先處置就可以進(jìn)展電泳。2 2凝膠構(gòu)造均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜明晰，分辨率凝膠構(gòu)造均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜明晰，分辨率高，反復(fù)性好。高，反復(fù)性好。3 3瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光檢測及定量測定。光檢測及定量測定。4 4電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保管。成干膜可長期保管。因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研因此

10、，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研討中常用實(shí)驗(yàn)方法之一，討中常用實(shí)驗(yàn)方法之一， DNADNA樣本的分別、純化、鑒定以及樣本的分別、純化、鑒定以及相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。四瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：四瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：DNA Marker 熒光染料熒光染料EB染色后，染色后，在紫外燈在紫外燈(305nm)下下察看到的電泳結(jié)果：察看到的電泳結(jié)果：1 1、實(shí)驗(yàn)資料：提取的小麥苗中的、實(shí)驗(yàn)資料：提取的小麥苗中的DNADNA2 2、儀器：、儀器： (1) (1)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (2) (2)可調(diào)微量移液器可調(diào)微量移液器

11、(3) (3)程度電泳槽程度電泳槽 4 4暗箱紫外透射儀等。暗箱紫外透射儀等。3 3、試劑：、試劑：1 1電泳緩沖液：電泳緩沖液：Tris-Tris-硼酸硼酸EDTAEDTA5050TBETBEpH8.3pH8.3。2 2加樣緩沖液：加樣緩沖液：0.25%0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)BPBBPB，40%40%蔗糖，蔗糖，DNAgreenDNAgreen。 (4) (4)瓊脂糖凝膠：濃度為瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%0.7%。 三、實(shí)驗(yàn)資料、儀器和試劑：三、實(shí)驗(yàn)資料、儀器和試劑：1 1、凝膠板的制備：、凝膠板的制備：1 1取瓊脂糖取瓊脂糖0.7 g0.7 g，加，加1 1TBETBE緩沖溶液緩沖溶液10

12、0ml100ml，于沸水浴中至熔化，制成，于沸水浴中至熔化，制成0.7%0.7%的瓊脂糖膠液。的瓊脂糖膠液。2 2膠床兩頭貼上防水膠帶，構(gòu)成膠床兩頭貼上防水膠帶，構(gòu)成8mm8mm高的擋墻，壓緊膠帶，置程度臺面高的擋墻，壓緊膠帶，置程度臺面上。上。3 3插入梳子，梳齒下端離板底插入梳子，梳齒下端離板底0.50.51mm1mm。4 4當(dāng)瓊脂糖膠液溫度降到當(dāng)瓊脂糖膠液溫度降到6060的時(shí)候的時(shí)候, ,將將6060凝膠不延續(xù)倒入膠床，高凝膠不延續(xù)倒入膠床，高3 34mm4mm，防止產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固。，防止產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固。5 5完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，參與電泳緩沖液，高于膠完全凝固

13、后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，參與電泳緩沖液，高于膠面面1 12mm2mm，從一頭悄然斜拉，從一頭悄然斜拉 梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。四、實(shí)驗(yàn)步驟：四、實(shí)驗(yàn)步驟： 3 3、加樣：、加樣： 將樣品將樣品DNADNA溶液與加樣緩沖液以溶液與加樣緩沖液以5 5 ：1 1的體積比混合，用的體積比混合，用微量進(jìn)樣器加樣，每加完一個(gè)樣品，沖洗三次。加樣量微量進(jìn)樣器加樣，每加完一個(gè)樣品，沖洗三次。加樣量151520 20 l l 加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部。凝膠底部。4 4、電泳：、電泳： 為了獲得電泳分別為了獲得電泳分別DN

14、ADNA片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不應(yīng)高于應(yīng)高于5V/cm5V/cm兩電極間的間隔開場時(shí)用較高電壓兩電極間的間隔開場時(shí)用較高電壓(80V)(80V)，樣品一進(jìn)入膠內(nèi)那么將電壓調(diào)至樣品一進(jìn)入膠內(nèi)那么將電壓調(diào)至5V/cm 5V/cm 。當(dāng)染料前沿移至底。當(dāng)染料前沿移至底邊邊1-2mm1-2mm時(shí)，電泳畢。時(shí)，電泳畢。5 5、染色、察看、顯微照相與記錄：、染色、察看、顯微照相與記錄： 封鎖電源，取出膠床，浸入封鎖電源，取出膠床，浸入0.5g/mL0.5g/mL的的EBEB溶液中，溶液中，30min30min后取出。在紫外檢測儀下察看凝膠中的后取出。在紫外檢測儀下察看凝膠中

15、的DNADNA紅橙色熒紅橙色熒光，并進(jìn)展顯微照相。最后要求繪制光，并進(jìn)展顯微照相。最后要求繪制DNADNA電泳圖譜。電泳圖譜。五、思索題：五、思索題： 影響電泳的主要要素影響電泳的主要要素? ? * * 熒光染料熒光染料EBEB染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠溴鹽苯基菲錠溴鹽(Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。 EBEB是一種扁平分子，它可是一種扁平分子，它可以嵌入核酸相鄰的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)以嵌入核酸相鄰的堿基之間，在紫外線

16、激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。它與出紅橙色熒光。它與DNADNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。特異性。 溴化乙錠嵌入堿基分子中，導(dǎo)致溴化乙錠嵌入堿基分子中，導(dǎo)致DNADNA在復(fù)制過程在復(fù)制過程中錯(cuò)配中錯(cuò)配 。所以溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性。在實(shí)所以溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性。在實(shí)驗(yàn)過程一定要帶上手套！驗(yàn)過程一定要帶上手套！ 2 2、優(yōu)點(diǎn)：、優(yōu)點(diǎn)：1 1染色比較簡便、快捷，普通在染色比較簡便、快捷，普通在101015min15min就可反響。就可反響。2 2EBEB對核酸分子無破壞作用，這是其它染對核酸分子無破壞作用，這是其它染料所不能做料所不能做 到的。到的

17、。3 3EBEB靈敏度高，可檢測出靈敏度高，可檢測出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。4 4既可用于既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的檢測。的檢測。5 5EBEB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時(shí)用紫外隨時(shí)用紫外 燈檢測電泳的進(jìn)程和效果。燈檢測電泳的進(jìn)程和效果。6 6EB-DNAEB-DNA復(fù)合物中的復(fù)合物中的EBEB發(fā)出的熒光比游離發(fā)出的熒光比游離的的EBEB強(qiáng)強(qiáng)1010倍，倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的因此不需洗凈凝膠中游離的EBEB也可檢測出也可檢測出DNADNA的條帶。的條帶。3 3、缺陷：、缺陷： 溴乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和溴乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套。含溴乙啶的溶液不能配制試劑時(shí)應(yīng)