2010年版藥典微生物限度檢查法

1、附錄幻J微生物限度檢查法微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、 酵母菌數(shù)及控制菌檢查。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o 菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)） 懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗證。供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物無毒性。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30'C35 C ;霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為 23 C

2、28C。檢驗結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量 （g、ml或cH）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為 10g或10ml ；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求 檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應(yīng)增加 20g或20ml（其中10g用于陽性對照試驗）。檢驗時，應(yīng)從 2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機抽取不少于檢驗用量 （兩個以上最小包裝單位 ）的3倍量供試品。供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，

3、應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45 C。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。1. 液體供試品取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1 : 10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山 梨酯 80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。2. 固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為 1 : 10的供試液。 必要時加適量的無菌聚山梨酯 80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。3. 需用特殊供試液制備方法

4、的供試品（1）非水溶性供試品方法1取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45C）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合 物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入 45C的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充 分乳化，作為1 : 20的供試液。方法2取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄X山B無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下 ）和無菌 玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45C的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510分鐘，萃取，靜置使油水

5、明顯分層，取其水層作為 1 : 10的供試液。（2）膜劑供試品取供試品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1 : 10 的供試液。（3）腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45'C水浴中，振搖，使溶解，作為 1 : 10的供試液。(4) 氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約 1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室 溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌

6、注射器吸出全部藥液，加至適量的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80)中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1 : 10的供試液。(5) 貼劑供試品取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布 )覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑(如聚山梨酯 80或卵磷脂 )的稀釋劑中，用力振蕩至少 30分鐘，制成供試液。貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。(6) 具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品有抑菌活性時，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性后，再

7、依法檢查。常用的方法如下。 培養(yǎng)基稀釋法 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。 離心沉淀法 取一定量的供試液， 500轉(zhuǎn)/分離心 3分鐘，取全部上清液混合，用于細(xì)菌檢查。 薄膜過濾法 見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)項下的“薄膜過濾法”。 中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有

8、抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活 劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的 培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)。試驗用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌 (Escherichia coli)CMCC(B) 44 102金黃色葡萄球菌 (StaPhylococcus aureus) CMCC(B) 26 003 枯

9、草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B) 63 501 白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98 001 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98 003菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)57天，加入35ml含0

10、.05 % (v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用適宜方法吸出抱子懸 液至無菌試管內(nèi)，用含 0.05 % (v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含抱子數(shù)50100cfu的抱子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在 2小時內(nèi)使用，若保存在28C可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液可保存在28C,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2個平皿，混勻，凝固，置 3035C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分別注入無

11、菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置 2328C培養(yǎng)72小時，計數(shù)；取白色念珠菌 50100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2328C培養(yǎng)72小時，計數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。結(jié)果判定被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值大于70%,且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。計數(shù)方法的驗證當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品 的細(xì)菌、霉菌及酵母菌

12、數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行 驗證。菌種及菌液制備同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查驗證方法驗證試驗至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。（1）試驗組 平皿法計數(shù)時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌

13、，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。（2）菌液組測定所加的試驗菌數(shù)。（3）供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。結(jié)果判斷 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對

14、照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落 數(shù)的百分率）均不低于70%照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的 菌回收率低于70%應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（表1）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛亞硫酸氫納酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨酯汞類制劑亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDT

15、A）鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸?-內(nèi)酰胺類抗生素?-內(nèi)酰胺酶若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作 用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生 長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供 試品檢驗。計數(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方

16、法和試驗條件進(jìn)行供試品的檢驗。驗證試驗也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進(jìn)行。供試品檢查 計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。按計數(shù)方法的驗證試驗確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 ： 10、1 ： 102、1 : 103等稀釋級的供試液。1. 平皿法取供試液1ml，置直徑90mr的無菌平皿中，注入1520ml溫度不超過45'C的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng) 基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中

17、，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng) 3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng) 5天。逐日觀察菌落生長情況；點計菌落數(shù)。必要時，可 適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至 7天進(jìn)行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的 平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差 1倍或以上。一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用 于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊

18、脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點計 霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉 瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合 并計數(shù)。菌數(shù)報告規(guī)則 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于 100cfu 的稀釋級，作為菌數(shù)報 告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、1mL或 10cm供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋

19、級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以v 1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。2. 薄膜過濾法采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45卩m直徑一般為50mm若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時， 應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器 在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過 濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜

20、每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾；若供試品每1g、1ml或10cm所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml進(jìn)行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”。沖洗后取岀濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸岀粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。培養(yǎng)和計數(shù)

21、培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100個。菌數(shù)報告規(guī)則 以相當(dāng)于1g、1ml或10cm供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g、1ml或10cnf供試品)，或v 1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)?？刂凭鷻z查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。菌種對試驗菌種的要求同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。大腸埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44 102金黃色葡萄球菌(Staph

22、ylococcus aureus) CMCC(B) 26 003乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B) CMCC(B) 50 094銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98 001菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白

23、色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在 2小時內(nèi)使用，若保存在28C可在24小時內(nèi)使用。適用性檢查 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查所用的菌株及檢測項目見表2。表2控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長、抑制和指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌MUG培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力大腸埃希菌大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌

24、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力大腸埃希菌沙門菌營養(yǎng)肉湯促生長能力乙型副傷寒沙門菌四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基促生長能力乙型副傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌膽鹽硫乳瓊脂或沙門、志賀氏屬瓊脂促生長能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌溴化十六烷基二甲銨瓊脂綠膿菌素測定用培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基促生長能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌卵黃

25、氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇鹽瓊脂促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生抱梭菌哥倫比亞瓊脂促生長能力生抱梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大腸埃希菌吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)物促生長能力+指示能力白色念珠菌增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗菌各0.1ml（

26、含菌數(shù)50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基生長的菌落大小形態(tài)特征應(yīng)一致。培養(yǎng)基抑制能力檢查：接種不少于100cfu的試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。固體培養(yǎng)基指示能力檢查：取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu）（見表2）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中試驗菌生長的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng) 與對照培養(yǎng)基一致。液體培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種不大于100c

27、fu的試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對照 培養(yǎng)基一致?？刂凭鷻z查方法的驗證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢 查。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應(yīng)重新驗證。驗證時，依各品種項下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，應(yīng)采用大 腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。菌種及菌液制備同控制菌檢查用培養(yǎng)基

28、的適用性檢查驗證方法取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時，取規(guī) 定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取岀濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果判斷 若上述試驗檢岀試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢岀試 驗菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性， 并重新進(jìn)行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進(jìn)行。供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗

29、證。陽性對照試驗 供試品進(jìn)行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10100cfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢岀相應(yīng)的控制菌。陰性對照試驗 取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。（1）大腸埃希菌（Escherichia coli）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量 （不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824小時，必要時可延長至48小時。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMU培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于 5小時、24小時在366nn紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基

30、作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為 MU（陽性；不呈現(xiàn)熒光，為 MU（陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入 數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG!性和靛基質(zhì)陰性。如MUGH性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；女口MUGI性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；女口MUGB性、靛基質(zhì)陰性，或 MUG!性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊 脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢岀大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3所列的菌

31、落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表3大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起， 邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤（2）大腸菌群（Coliform） 取含適量（不少于10ml）的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管 3支，分別加入1 : 10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1 : 100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1 : 1000的供試液1

32、ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1 支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)1824小時。乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長、或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢岀大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng) 物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽抱桿菌，判該管未檢岀大腸菌群；若平板上生長的菌落與表 4所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽抱桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗。表4大腸菌群菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，

33、圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤確證試驗 從上述分離平板上挑選45個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢岀大腸菌群，否則判未檢岀大腸菌群。根據(jù)大腸菌群的檢岀管數(shù)，按表 5報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。表5可能的大腸菌群數(shù)表各供試品量的檢岀結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)N（個/g或ml）0.1g 或0.1ml0.01g 或0.01ml0.001g 或0.001ml+> 103+-102< N v 103+-10 < N< 102-< 10

34、注：+代表檢岀大腸菌群；-代表未檢岀大腸菌群。（3）沙門菌（Salmonella）取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng) 1824小時。取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂 （或沙 門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時（必要時延長至4048小 時）。若平板上無菌落生長，或生長的菌落不同于表 6所列的特征，判供試品未檢岀沙門菌。若平板上生長的菌落與表6所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2

35、3個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢岀沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為沙門菌。表6沙門菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）取供試液10m

36、l（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cni），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平 板上，培養(yǎng)1824小時。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍(lán)綠色素擴(kuò)散。如平板上無菌落生 長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢岀銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或 疑似，應(yīng)挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾

37、紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽抱桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢岀銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素 試驗。綠膿菌素（Pyocyanin）試驗取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng) 24小時，加三氯甲烷35ml至培養(yǎng)管 中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應(yīng)呈陰性。若

38、上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢岀銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為 革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。（5）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cmi），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48小時。取上述培養(yǎng)物， 劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表7所列特征，

39、判供試品未檢岀金黃色葡萄球菌。表7金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.71mm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，夕卜圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1 2mm若平板上生長的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，作血漿凝固酶試驗。血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌水混合液（1 ： 1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面

40、培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養(yǎng)，3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應(yīng)流動自如，陽性對照管血漿應(yīng)凝固，若試驗管血漿凝固者為血漿凝 固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗。若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢岀金黃色葡萄球菌。（6）梭菌（Clostridium） 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml）2份，其中1份置80 &#

41、39;C保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至 100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下培養(yǎng) 48小時。取上述每一培養(yǎng)物 0.2ml，分別涂 抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)4872小時。若平板上無菌落生長，判供試品未檢岀梭菌；若平板上有菌落生長，應(yīng)挑選23個菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。過氧化氫酶試驗 取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽抱，過氧化氫酶陰性，判供試品檢岀梭菌，否則判供試品未檢岀梭菌。（7）

42、白色念珠菌（Candida albicans）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cmi）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 4872小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢岀白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培

43、養(yǎng)2448小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢岀白色念珠菌。若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%土溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗。芽管試驗 挑取1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置3537C、13小時，置顯微鏡下觀察，可見到由抱子長岀短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜抱子、假菌絲、芽管，判供試品未檢岀白色念珠菌。結(jié)果判斷供試品檢岀控制菌或其他致病菌時，按一次檢岀結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌

44、和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報告菌數(shù)。眼用制劑檢岀霉菌和酵母菌數(shù)時，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長菌，方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項下的 規(guī)定。若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、控制菌三項檢驗結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任 何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。稀釋液稀釋液配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。1. pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 照無菌檢查法（附錄幻H）制備。2. pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液 按緩沖液（附錄XV D）配制后，過濾，

45、分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。3.0.9%無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml,過濾，分裝、滅菌。培養(yǎng)基及其制備方法 培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅 菌。1. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基及改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基照無菌檢查法（附錄幻H）制備。2. 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基胨5.0g玫瑰紅鈉0.0133g葡萄糖10.0g瓊脂14.0g磷酸二氫鉀1.0g水1000ml硫酸鎂0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾

46、過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌3. 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （YPD）胨10.0g瓊脂14.0g酵母浸出粉 5.0g水1000ml葡萄糖 20.0g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖，分裝，滅菌。4. 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 （BL）胨20.0g磷酸二氫鉀1.3g乳糖5.0g牛膽鹽2.0g氯化鈉5.0g（ 或去氧膽酸鈉 ）（0.5g）磷酸氫二鉀4.0g水1000ml除乳糖、牛膽鹽（或去氧膽酸鈉）外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ± 0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽 （ 或去氧膽酸鈉 ） ，分裝，滅菌。5. 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基蛋

47、白胨 20.0g0.04% 溴甲酚紫水溶液 25ml乳糖10.0g水 1000ml牛膽鹽 5.0g除0.04%溴甲酚紫水溶液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ± 0.2，加入0.04%溴甲酚紫指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規(guī)格應(yīng)保證產(chǎn)氣結(jié)果的觀察。6. 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 （EMB）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100ml 曙紅鈉指示液2ml20 %乳糖溶液5ml亞甲藍(lán)指示液1.31.6ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60C，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿7. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacC)胨20.0g1% 中性紅指示

48、液3ml乳糖10.0g瓊脂14.0g牛膽鹽5.0g水1000ml氯化鈉5.0g除乳糖、1%中性指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ± 0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60 C，傾注平皿。8.4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl- B -D-glucuronide ，MUG培養(yǎng)基胨10.0g磷酸二氫鉀 （無水 ）0.9g硫酸錳0.5mg磷酸氫二鈉（無水）6.2g硫酸鋅0.5mg亞硫酸鈉40mg硫酸鎂0.1g去氧膽酸鈉1.0g氯化鈉5.0gMUG75mg氯化鈣50mg水1000

49、ml除MUG卜,取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3 ± 0.1，加入MUG溶解，每管分裝5ml，滅菌。9. 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI)胨20.0g硫酸亞鐵0.2g牛肉浸出粉5.0g硫代硫酸鈉0.2g乳糖10.0g0.2% 酚磺酞指示液12.5ml蔗糖10.0g瓊脂12.0g葡萄糖1.0g水1000ml氯化鈉5.0g除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3 ± 0.1，加入瓊脂,加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層（23cm）短斜面。和亮綠試液0.1ml，混勻。10. 四硫磺酸鈉亮

50、綠培養(yǎng)基 （TTB）胨5.0g 硫代硫酸鈉30.0g牛膽鹽1.0g水1000ml碳酸鈣10.0g取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。臨用前，取上述培養(yǎng)基，每 10ml加入碘試液0.2ml和亮綠試液0.1ml，混勻。11. 沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基 （SS）胨5.0g硫代硫酸鈉8.5g牛肉浸出粉5.0g中性紅指示液2.5ml乳糖10.0g亮綠試液0.33ml牛膽鹽8.5g瓊脂16.0g枸櫞酸鈉8.5g水1000ml枸櫞酸鐵銨1.0gpH值使滅菌后為7.2 ± 0.1，濾過，加入瓊脂,除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷

51、至60 C，傾注平皿。除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)加入其余成分，搖勻，冷至 60C，傾注平皿。pH值使滅菌后為7.2 ± 0.1，加入瓊脂，加熱溶化后，再12. 膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL)胨20.0g枸櫞酸鈉1.0g牛肉浸出粉3.0g枸櫞酸鐵銨1.0g乳糖10.0g中性紅指示液3ml蔗糖10.0g瓊脂16.0g去氧膽酸鈉1.0g水1000ml硫代硫酸鈉2.3g13. 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基胨10.0g 溴化十六烷基三甲銨 0.3g牛肉浸出粉 3.0g 瓊脂14.0g氯化鈉5.0g 水1000ml除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后

52、為7.5 ± 0.1，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60'C,傾注平皿。14. 亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基臨用前，取滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100ml中加入新配制的1%亞碲酸鈉（鉀）試液0.2ml，混勻，即得。15. 卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基胨6.0g10% 氯化鈉卵黃液 100ml牛肉浸出粉 1.8g 瓊脂14.0g氯化鈉 30.0g 水650ml除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.6 ± 0.1，滅菌，待冷至約60 C，以無菌操作加入 10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋1個，以無菌操作取

53、出卵黃，放入10%無菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。16. 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基胨10.0g酚磺酞指示液2.5ml牛肉浸出粉1.0g瓊脂14.0g甘露醇10.0g水1000ml氯化鈉75.0g除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ± 0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至 60 C,傾注平皿。17. 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基胨20.0g0.04% 溴甲酚紫指示液 25ml乳糖10.0g 水1000ml除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ± 0.2，加入指示液，

54、分裝于含倒管的小試管中，每管3ml。滅菌。18. 綠膿菌素（Pyocyanin）測定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂培養(yǎng)基）胨 20.0g 甘油10ml氯化鎂 （無水）1.4g 瓊脂14.0g硫酸鉀 （無水） 10.0g 水 1000ml取胨、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3 ± 0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜面19. 梭菌增菌培養(yǎng)基牛肉浸出粉 10.0g 鹽酸半胱氨酸0.5g胨10.0g 氯化鈉5.0g酵母浸出粉 3.0g 醋酸鈉3.0g可溶淀粉 1.0g 瓊脂0.5g葡萄糖5.0g 水1000mL取上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.8 ± 0.2，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌20. 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基酪蛋白胰酶消化物 10.0g 肉胃酶消化物 5.0g 心胰酶消化物 3.0g 氯化鈉5.0g玉米淀粉1.0g 瓊脂15.0g酵母浸出粉 5.0g 水1000ml除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌，冷至4550C，加入相當(dāng)于20mg慶大霉素的無菌硫酸慶大霉素，混