血漿循環(huán)icroRNA提取檢測及其在冠心病的表達[精品]

1、血漿循環(huán)血漿循環(huán)MicroRNAMicroRNA提取檢測及其在冠心病的表達提取檢測及其在冠心病的表達 鄭志偉鄭志偉 勞海燕勞海燕 余細(xì)勇余細(xì)勇 林秋雄林秋雄 朱杰寧朱杰寧 王玲王玲 孫碩孫碩 陳紀(jì)言陳紀(jì)言 鐘詩龍鐘詩龍 廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東省心血管病研究所講述目錄講述目錄簡述血漿循環(huán)簡述血漿循環(huán)miRNA提取檢測提取檢測的方法的方法采用前述建立的方法，在采用前述建立的方法，在25例冠例冠心病患者和心病患者和30例健康對照中檢測例健康對照中檢測miRNA的表達情況。的表達情況。在細(xì)胞實驗進一步探討在細(xì)胞實驗進一步探討miRNA的作用機制

2、的作用機制 研究背景MicroRNAMicroRNA是生物體內(nèi)長度約為是生物體內(nèi)長度約為20202323個核苷酸的非個核苷酸的非編碼小編碼小RNARNA，通過與靶，通過與靶mRNAmRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行調(diào)控。平上對基因的表達進行調(diào)控。最近研究發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中也存在最近研究發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中也存在miRNAmiRNA，有希望作為，有希望作為疾病無創(chuàng)診斷或者疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物。疾病無創(chuàng)診斷或者疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物。Solexa Whole Genome SequencingSolexa Whole Genome Sequencing miRNAs (2

3、1-23nt) were most abundant sequences in serum RNAsChen et al. 2008 Cell Res.miRNA差異？差異？疾病疾病預(yù)后，轉(zhuǎn)歸預(yù)后，轉(zhuǎn)歸血漿循環(huán)血漿循環(huán)miRNA的表達的表達 預(yù)測預(yù)測?生物標(biāo)記物？生物標(biāo)記物？我們的設(shè)想我們的設(shè)想我們的研究工作我們的研究工作研究血漿中存在的循環(huán)研究血漿中存在的循環(huán)miRNA，建立其提取檢，建立其提取檢測的方法，并且檢測血測的方法，并且檢測血漿漿miRNA在冠心病人中在冠心病人中的表達情況，尋找疾病的表達情況，尋找疾病發(fā)生發(fā)展或者影響預(yù)后發(fā)生發(fā)展或者影響預(yù)后的生物標(biāo)記物。的生物標(biāo)記物。血漿血漿mi

4、RNA提取檢測基本流程提取檢測基本流程血漿循環(huán)血漿循環(huán)miRNAmiRNA提取方法提取方法血漿血漿miRNA 的提取的提取第四步第四步晾干，加無晾干，加無RNAase水進行溶解，檢測濃水進行溶解，檢測濃度，保存度，保存第一步第一步ProteinK 消化，消化，Trizol LS和氯仿對和氯仿對血漿進行提取血漿進行提取第三步第三步離心，取得離心，取得RNA沉淀沉淀，70%乙醇洗滌乙醇洗滌第二步第二步異丙醇和核酸共沉淀異丙醇和核酸共沉淀劑對前述水相進行沉劑對前述水相進行沉淀淀血漿循環(huán)血漿循環(huán)miRNA的檢測原理的檢測原理實驗結(jié)果實驗結(jié)果二、二、miRNA提取方法學(xué)的考察（一）提取方法學(xué)的考察（一）

5、1、采用外源合成的cel-miRNA-39檢驗提取方法的提取效率：2、has-miR-16的累加實驗的累加實驗采用加入外源合成的采用加入外源合成的has-miR-16 mimics，比較提取方法的有效性。，比較提取方法的有效性。二、二、miRNA提取方法學(xué)的考察（二）提取方法學(xué)的考察（二）內(nèi)源內(nèi)源BmimicsA三、檢測三、檢測miRNA在兩組人群中的表達差異在兩組人群中的表達差異Coronary artery heart disease （CHD）25例例Healthy contron30例例3.1、研究的一般資料、研究的一般資料年齡年齡3.2、研究的一般資料、研究的一般資料性別性別P=0.

6、1553.3、血漿循環(huán)、血漿循環(huán)has-miR-126的表達量的表達量3.4、血漿循環(huán)、血漿循環(huán)has-miR-16的表達量的表達量四、進一步的機制探討四、進一步的機制探討1、培養(yǎng)人心肌細(xì)胞、培養(yǎng)人心肌細(xì)胞AC16，進，進行行miR-126 inhibitor 的轉(zhuǎn)染，的轉(zhuǎn)染，Q-PCR檢測檢測miR-126和和血管內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子皮生長因子( (VEGF)的表達。的表達。 2、Tunel 檢測心肌細(xì)胞凋檢測心肌細(xì)胞凋 亡情況。亡情況。四、四、Q-PCR檢測檢測VEGF的表達結(jié)果的表達結(jié)果VEGF有促進血管生成的作有促進血管生成的作用，在冠心病患者中用，在冠心病患者中miR-126的表達下降

7、，可能跟的表達下降，可能跟VEGF調(diào)節(jié)血管生成有關(guān)，調(diào)節(jié)血管生成有關(guān)，其具體的機制還有待進一其具體的機制還有待進一步的研究。步的研究。三、三、TUNEL凋亡結(jié)果分析（一）凋亡結(jié)果分析（一）圖圖 1 AC16 細(xì)胞細(xì)胞-正常正常A：細(xì)胞形態(tài)；：細(xì)胞形態(tài)；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定位）；染色（核定位）；D：B 和和 C 的重的重疊圖疊圖三、三、TUNEL凋亡結(jié)果分析（二）凋亡結(jié)果分析（二）圖圖 3 AC16 細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染 mir-126 inhibitorA：細(xì)胞形態(tài)；：細(xì)胞形態(tài)；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定染色（核定位）；位）；D：B 和和 C 的重疊圖的重疊圖四、本文結(jié)論：結(jié)論：采用結(jié)論：采用Trizol LSTrizol LS提取血漿總提取血漿總RNARNA的方法可行，的方法可行，miRNAmiRNA檢測方法的特異性和靈敏性較好，血漿檢測方法的特異性和靈敏性較好，血漿hsa-miR-126hsa-miR-126表達表達的差異可能在冠心病的發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用的差異可能在冠心病的發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用機制可能與影響血管生成和心肌保