第十二單元移植免疫學(xué)檢測(cè)

1、第十二單元移植免疫學(xué)檢測(cè)移植免疫學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 HLA微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn) 微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（Microcytotoxicity assay）是）是在經(jīng)典的補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（在經(jīng)典的補(bǔ)體依賴的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement dependent cytotoxicity，CDC）基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)）基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于器官移植供、受者間的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于器官移植供、受者間的交叉配型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的封閉抗體檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。在交叉配型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的封閉抗體檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。在器官移植的文獻(xiàn)中提及的器官移植

2、的文獻(xiàn)中提及的CDC法多指微量淋巴細(xì)胞毒法。法多指微量淋巴細(xì)胞毒法。微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)概念微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)概念v器械器械 微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)板（泰薩奇板）、倒置熒光顯微微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)板（泰薩奇板）、倒置熒光顯微鏡、鏡、 微量移液器、吸管、溫箱、離心機(jī)、磁架等微量移液器、吸管、溫箱、離心機(jī)、磁架等 。v試劑試劑 淋巴細(xì)胞分離液淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll, 1.077)、T/B淋巴細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞分離磁珠及洗滌液、凍干補(bǔ)體、熒光染色液、供者全血磁珠及洗滌液、凍干補(bǔ)體、熒光染色液、供者全血23ml（EDTA或或ACD抗凝）、受者血清抗凝）、受者血清2ml、陰性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清（可用（可

3、用1640培養(yǎng)液或培養(yǎng)液或PBS替代）、陽(yáng)性對(duì)照血清（抗全淋替代）、陽(yáng)性對(duì)照血清（抗全淋 巴細(xì)胞抗體巴細(xì)胞抗體ALG/ATG）。）。實(shí)驗(yàn)器材和材料實(shí)驗(yàn)器材和材料v淋巴細(xì)胞的分離（淋巴細(xì)胞的分離（FicollFicoll法）：法）： 1. 將供者全血用將供者全血用PBS(pH7.4)緩沖液緩沖液 按按1:1稀釋，混勻備用；稀釋，混勻備用； 2. 取取15ml離心管一支，加入一定體積的離心管一支，加入一定體積的Ficoll液，用吸取稀釋液，用吸取稀釋后的供者全血，沿試管壁緩慢加入，使全血置于后的供者全血，沿試管壁緩慢加入，使全血置于Ficoll上層。上層。Ficoll液與稀釋后的全血體積之比為液與

4、稀釋后的全血體積之比為1:2； 3. 15002000rpm/min（半徑（半徑15cm水平轉(zhuǎn)子）離心水平轉(zhuǎn)子）離心10min； 4. 取出離心管，吸取中間白膜層，置于另一干凈離心管中；取出離心管，吸取中間白膜層，置于另一干凈離心管中； 5. 加入加入PBS，洗滌；，洗滌； 6. 2000rpm/min離心離心5min，傾出上清液；，傾出上清液； 7. 重復(fù)步驟重復(fù)步驟5、6； 8. PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為液調(diào)整細(xì)胞濃度為2109/L。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法v 淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)（一步法）淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)（一步法） 1. 于泰薩奇板每孔中加入于泰薩奇板每孔中加入5l石蠟油，以防反應(yīng)物揮發(fā)；石蠟油，以防反應(yīng)

5、物揮發(fā)； 2. 建立反應(yīng)格局，每位待測(cè)標(biāo)本均應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性建立反應(yīng)格局，每位待測(cè)標(biāo)本均應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照；對(duì)照； 3. 分別于各相應(yīng)孔中加入分別于各相應(yīng)孔中加入1l淋巴細(xì)胞（混合淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞（混合淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、1l待測(cè)血清以及待測(cè)血清以及2l補(bǔ)體；補(bǔ)體； 4. 2225溫度下孵育溫度下孵育1h； 5. 熒光染色液染色并終止反應(yīng)。熒光染色液染色并終止反應(yīng)。 結(jié)果應(yīng)在染色后結(jié)果應(yīng)在染色后10分鐘內(nèi)觀察，以防熒光猝滅。特分鐘內(nèi)觀察，以防熒光猝滅。特殊情況不能立即觀察時(shí)，應(yīng)將反應(yīng)板用避光紙包緊，置殊情況不能立即觀察時(shí)，應(yīng)將反應(yīng)板用避光紙包緊，

6、置于于4冰箱中，盡早觀察結(jié)果。死亡細(xì)胞由于熒光染料進(jìn)冰箱中，盡早觀察結(jié)果。死亡細(xì)胞由于熒光染料進(jìn)入而呈紅色（染料中的入而呈紅色（染料中的EB與與DNA結(jié)合），體積略為增大。結(jié)合），體積略為增大。活細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜完整而呈明亮的綠色（染料中的活細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜完整而呈明亮的綠色（染料中的CFDA與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合），具有強(qiáng)折光性。與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合），具有強(qiáng)折光性。結(jié)果觀察結(jié)果觀察 根據(jù)死亡細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比來(lái)計(jì)分，根據(jù)死亡細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比來(lái)計(jì)分，目前普遍采用國(guó)際通用的目前普遍采用國(guó)際通用的NIH計(jì)分方法，如下表。計(jì)分方法，如下表。判斷死細(xì)胞的百分比需要操作者具備一定的工作判斷死細(xì)胞的百分比需

7、要操作者具備一定的工作經(jīng)驗(yàn)，大致原則為：可疑經(jīng)驗(yàn)，大致原則為：可疑2分，分，30為為4，過(guò)半記，過(guò)半記6，強(qiáng)陽(yáng)寫強(qiáng)陽(yáng)寫8。結(jié)果判斷結(jié)果判斷淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)記分標(biāo)準(zhǔn)淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)記分標(biāo)準(zhǔn)死細(xì)胞（死細(xì)胞（%）記分記分意義意義0100陰性陰性11202陰性可疑陰性可疑21404陽(yáng)性可疑陽(yáng)性可疑41806陽(yáng)性陽(yáng)性808強(qiáng)陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性1. 每份標(biāo)本都必須設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照；每份標(biāo)本都必須設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照；2. 溫度過(guò)低有可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果；溫度過(guò)低有可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果；3. 只有當(dāng)陰性和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果準(zhǔn)確時(shí)，該實(shí)驗(yàn)的只有當(dāng)陰性和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果準(zhǔn)確時(shí)，該實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性結(jié)果方能成立。陽(yáng)性和陰性結(jié)果方能成立。注意事項(xiàng)

8、注意事項(xiàng)v淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)是測(cè)定患者機(jī)體內(nèi)是否含有特異性針對(duì)供淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)是測(cè)定患者機(jī)體內(nèi)是否含有特異性針對(duì)供者的淋巴細(xì)胞毒抗體，檢測(cè)的是者的淋巴細(xì)胞毒抗體，檢測(cè)的是HLA特異性的特異性的IgG和和IgM抗體，包括抗體，包括HLA-I類抗體和類抗體和II類抗體。由于混合淋巴細(xì)胞類抗體。由于混合淋巴細(xì)胞中主要為中主要為T淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，而淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，而HLA-II類類抗體在抗體在T淋巴細(xì)胞表面不表達(dá)，僅在淋巴細(xì)胞表面不表達(dá)，僅在B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，因而，利用混合淋巴細(xì)胞進(jìn)行因而，利用混合淋巴細(xì)胞進(jìn)行CDC試驗(yàn)時(shí)，對(duì)試驗(yàn)時(shí)，對(duì)HLA-I類抗類抗體陰性

9、、體陰性、II類抗體陽(yáng)性的患者，易產(chǎn)生漏檢，而造成這種類抗體陽(yáng)性的患者，易產(chǎn)生漏檢，而造成這種結(jié)果的原因是由于混合淋巴細(xì)胞中結(jié)果的原因是由于混合淋巴細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞占全部細(xì)胞淋巴細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例較少所致。的比例較少所致。 v為了更加真實(shí)、全面地反應(yīng)患者的免疫狀態(tài)，我們應(yīng)該如為了更加真實(shí)、全面地反應(yīng)患者的免疫狀態(tài)，我們應(yīng)該如何改善上述局限性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)何改善上述局限性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果造成的影響？果造成的影響？南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)科大學(xué) 裘宇容裘宇容實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 群體反應(yīng)性抗體檢測(cè)群體反應(yīng)性抗體檢測(cè) 群體反應(yīng)抗體（群體反應(yīng)抗體（Pannel reactive antibody）是指存）是

10、指存在于某些人體內(nèi)的抗人類白細(xì)胞在于某些人體內(nèi)的抗人類白細(xì)胞(HLA)抗體，可通過(guò)輸抗體，可通過(guò)輸血、輸血小板、妊娠以及器官移植等免疫途徑獲得。血、輸血小板、妊娠以及器官移植等免疫途徑獲得。PRA測(cè)定即是檢測(cè)患者體內(nèi)是否存在測(cè)定即是檢測(cè)患者體內(nèi)是否存在HLA抗體、抗體抗體、抗體的水平高低以及抗體特異性如何。的水平高低以及抗體特異性如何。PRA對(duì)于患者是否發(fā)對(duì)于患者是否發(fā)生排斥、移植物的存活狀態(tài)以及器官功能的實(shí)現(xiàn)都有著生排斥、移植物的存活狀態(tài)以及器官功能的實(shí)現(xiàn)都有著不可忽視的作用。不可忽視的作用。群體反應(yīng)性抗體的概念群體反應(yīng)性抗體的概念實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理將涵蓋不同地域、不同人種的將涵蓋不同地域、不

11、同人種的HLA-I類和類和II類純化類純化IgG抗原預(yù)先包被于泰薩奇微孔板中，與待測(cè)、血清反應(yīng)，再加抗原預(yù)先包被于泰薩奇微孔板中，與待測(cè)、血清反應(yīng)，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，孵育后加入酶作用底物，待顯色入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，孵育后加入酶作用底物，待顯色反應(yīng)完成后終止反應(yīng)。如果待測(cè)血清中存在反應(yīng)完成后終止反應(yīng)。如果待測(cè)血清中存在HLA-I類抗體，類抗體，則相應(yīng)的則相應(yīng)的HLA-I類混合抗原孔中會(huì)發(fā)生特異性的抗原抗體反類混合抗原孔中會(huì)發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，反應(yīng)孔呈現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果；若無(wú)相應(yīng)抗體，則反應(yīng)，反應(yīng)孔呈現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果；若無(wú)相應(yīng)抗體，則反應(yīng)孔中為無(wú)色陰性結(jié)果。應(yīng)孔中為無(wú)色陰

12、性結(jié)果。v器械：器械： 各種移液器、吸頭、溫箱、離心機(jī)各種移液器、吸頭、溫箱、離心機(jī) 、微量酶標(biāo)儀等。、微量酶標(biāo)儀等。v試劑：試劑： 抗原微孔板（以抗原微孔板（以LAT mix tray為例）為例） 對(duì)照血清（對(duì)照血清（10serum control） 去離子水去離子水(sterile deionized water) 酶標(biāo)二抗（酶標(biāo)二抗（100alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG) 抗體稀釋液（抗體稀釋液（1antibody diluent） 洗液（洗液（10wash buffer） 底物底物A和和B（1colorimetric enz

13、yme substrate A&B） 反應(yīng)終止液（反應(yīng)終止液（1stop reagent）實(shí)驗(yàn)器材和材料實(shí)驗(yàn)器材和材料v 試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備1. 在第一次使用時(shí)，至少提前在第一次使用時(shí)，至少提前20min取出凍干對(duì)照血清以取出凍干對(duì)照血清以2ml去離子水輕去離子水輕輕搖震使其徹底溶解。將溶解后的對(duì)照血清溶液分裝，每管輕搖震使其徹底溶解。將溶解后的對(duì)照血清溶液分裝，每管100l，儲(chǔ)存在儲(chǔ)存在-20冰箱中，每次實(shí)驗(yàn)前取出，恢復(fù)至室溫后使用；冰箱中，每次實(shí)驗(yàn)前取出，恢復(fù)至室溫后使用；2. 將洗液用去離子水將洗液用去離子水(sterile deionized water)按按1：9稀釋，可根據(jù)工

14、作頻稀釋，可根據(jù)工作頻率一次性配制一定量的工作液，率一次性配制一定量的工作液，4冰箱貯存?zhèn)溆?；冰箱貯存?zhèn)溆茫?. 將待測(cè)標(biāo)本用抗體稀釋液（將待測(cè)標(biāo)本用抗體稀釋液（antibody diluent)按按1：2稀釋，約稀釋，約60l/test；4. 酶標(biāo)二抗（酶標(biāo)二抗（alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG)在第一次在第一次洗滌之前用抗體稀釋液按洗滌之前用抗體稀釋液按1：100稀釋，稀釋，50l/test；5. 底物底物A、B (colorimetric enzyme substrate A&B)在第二次洗滌之前按在第二次洗滌之前按1：

15、1比例混勻，比例混勻，50l/test。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法v 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)1. 根據(jù)反應(yīng)格局表，將待測(cè)血清和各種對(duì)照品加入相應(yīng)的孔中，每孔根據(jù)反應(yīng)格局表，將待測(cè)血清和各種對(duì)照品加入相應(yīng)的孔中，每孔10l（陰性對(duì)（陰性對(duì)照孔加入抗體稀釋液，陽(yáng)性對(duì)照孔和質(zhì)控孔加入對(duì)照血清）；照孔加入抗體稀釋液，陽(yáng)性對(duì)照孔和質(zhì)控孔加入對(duì)照血清）；2. 蓋好反應(yīng)板，蓋好反應(yīng)板，2225孵育孵育60min；3. 用力將反應(yīng)板中的血清甩出，并在墊有紙巾的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上叩擊反應(yīng)板兩至三次，用力將反應(yīng)板中的血清甩出，并在墊有紙巾的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上叩擊反應(yīng)板兩至三次，在加入下一液體前，請(qǐng)注意加蓋，保持反應(yīng)孔濕潤(rùn)；在加入

16、下一液體前，請(qǐng)注意加蓋，保持反應(yīng)孔濕潤(rùn)；4. 于每孔中加入洗液于每孔中加入洗液(wash buffer) 20-30l， 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板，甩出洗液，叩擊輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板，甩出洗液，叩擊反應(yīng)板兩至三次；反應(yīng)板兩至三次； 5. 再重復(fù)步驟再重復(fù)步驟9兩次；兩次；6. 加入加入10ul酶標(biāo)二抗，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板酶標(biāo)二抗，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板, 2225孵育孵育40min；7. 重復(fù)步驟重復(fù)步驟9三次；三次；8. 每孔加入每孔加入10l混合好的底物，混合好的底物，37避光孵育避光孵育1015min（一般不要超過(guò)（一般不要超過(guò)15min）；）；9. 待質(zhì)控孔和陽(yáng)性對(duì)照變成深藍(lán)色后待質(zhì)控孔和陽(yáng)性對(duì)照變成深藍(lán)色后,

17、每孔加入每孔加入5l 終止液終止液(stop reagent)，蓋上反應(yīng)，蓋上反應(yīng)板，板，15分鐘后觀察結(jié)果。分鐘后觀察結(jié)果。 肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，藍(lán)色或深藍(lán)色為陽(yáng)性肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，藍(lán)色或深藍(lán)色為陽(yáng)性, 無(wú)色為陰性，無(wú)色為陰性，陽(yáng)性結(jié)果的顏色深淺程度與待測(cè)標(biāo)本陽(yáng)性結(jié)果的顏色深淺程度與待測(cè)標(biāo)本HLA抗體水平的高低抗體水平的高低成正比。有條件時(shí)可在微量酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，并根據(jù)成正比。有條件時(shí)可在微量酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，并根據(jù)陰、陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值判定標(biāo)本的陰、陽(yáng)性。盡量在顯色陰、陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值判定標(biāo)本的陰、陽(yáng)性。盡量在顯色終止反應(yīng)后終止反應(yīng)后1小時(shí)內(nèi)讀取反應(yīng)結(jié)果，上機(jī)前請(qǐng)移去反應(yīng)板蓋。小

18、時(shí)內(nèi)讀取反應(yīng)結(jié)果，上機(jī)前請(qǐng)移去反應(yīng)板蓋。如因特殊情況需延遲觀察結(jié)果時(shí)，請(qǐng)將反應(yīng)板貯存于如因特殊情況需延遲觀察結(jié)果時(shí)，請(qǐng)將反應(yīng)板貯存于25冰箱中，此情況下可能會(huì)引起反應(yīng)孔吸光度值降低，產(chǎn)生假冰箱中，此情況下可能會(huì)引起反應(yīng)孔吸光度值降低，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。陰性結(jié)果。觀察結(jié)果觀察結(jié)果注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 洗滌洗滌 洗滌是洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的步驟，如洗滌不充分，實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的步驟，如洗滌不充分，則可能出現(xiàn)本底過(guò)高的現(xiàn)象；但洗滌過(guò)度，亦可能丟失一則可能出現(xiàn)本底過(guò)高的現(xiàn)象；但洗滌過(guò)度，亦可能丟失一些陽(yáng)性反應(yīng)；些陽(yáng)性反應(yīng)；2. 溫度溫度 除二抗反應(yīng)過(guò)程外，本實(shí)驗(yàn)以除二抗反應(yīng)過(guò)程外，本實(shí)驗(yàn)以2225為宜，

19、溫度為宜，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同性質(zhì)的干擾；過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同性質(zhì)的干擾；3. 對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本，可加大稀釋倍數(shù)后再進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本，可加大稀釋倍數(shù)后再進(jìn)行檢測(cè)；4. 本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)為陽(yáng)性結(jié)果的評(píng)價(jià)和判斷，因此，如果操作本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)為陽(yáng)性結(jié)果的評(píng)價(jià)和判斷，因此，如果操作者具備豐富的者具備豐富的HLA專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)，將會(huì)大大提高本實(shí)驗(yàn)專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)，將會(huì)大大提高本實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷的可靠性和準(zhǔn)確性。結(jié)果判斷的可靠性和準(zhǔn)確性。v 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1. 依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件不同，各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果具有不同的波動(dòng)范圍；依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件不同，各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果具有不同的波動(dòng)范圍；2. 當(dāng)空白對(duì)照、

20、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及質(zhì)控孔的當(dāng)空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及質(zhì)控孔的OD值均值均在試劑盒可接受范圍時(shí)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠；在試劑盒可接受范圍時(shí)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠；3. 肉眼判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)根據(jù)反應(yīng)孔的顏色深淺計(jì)分，計(jì)分方肉眼判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)根據(jù)反應(yīng)孔的顏色深淺計(jì)分，計(jì)分方法同法同“微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)”，以，以0，2，4，6，8分來(lái)表分來(lái)表示反應(yīng)由弱至強(qiáng)的程度。示反應(yīng)由弱至強(qiáng)的程度。4. 對(duì)于對(duì)于HLA混合抗體檢測(cè)，建議混合抗體檢測(cè)，建議4分以上為陽(yáng)性。對(duì)于分以上為陽(yáng)性。對(duì)于2分結(jié)分結(jié)果的定義是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)，應(yīng)結(jié)合患者機(jī)體免疫狀態(tài)而定。果的定義是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)，應(yīng)結(jié)合患者機(jī)

21、體免疫狀態(tài)而定。結(jié)果分析結(jié)果分析vCut-off值的確定值的確定1.不同的不同的HLA抗體檢測(cè)試劑盒，可設(shè)置不同的調(diào)節(jié)抗體檢測(cè)試劑盒，可設(shè)置不同的調(diào)節(jié)Cut-off值，建議在值，建議在HLA抗體初篩時(shí)適當(dāng)下調(diào)抗體初篩時(shí)適當(dāng)下調(diào)Cut-off值；值；2.對(duì)于對(duì)于HLA抗體特異性及抗體水平的檢測(cè)，可根據(jù)試劑抗體特異性及抗體水平的檢測(cè)，可根據(jù)試劑盒類型（盒類型（LAT1240/1288/1HD/240）相應(yīng)上調(diào)）相應(yīng)上調(diào)Cut-off值。值。3.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)Cut-off值的計(jì)算：值的計(jì)算：4.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)Cut-off（陽(yáng)性孔均值空白均值）（陽(yáng)性孔均值空白均值）校正系校正系數(shù)數(shù)空白均值空白均值vPRA值的

22、計(jì)算值的計(jì)算 PRA陽(yáng)性孔數(shù)陽(yáng)性孔數(shù)/總檢測(cè)孔數(shù)總檢測(cè)孔數(shù)100%南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)科大學(xué) 裘宇容裘宇容 如孔如孔2A2E均為陽(yáng)性，根據(jù)反應(yīng)工作表格局，說(shuō)均為陽(yáng)性，根據(jù)反應(yīng)工作表格局，說(shuō)明抗體特異性為抗明抗體特異性為抗HLA-A1抗體；如孔抗體；如孔2A2E中有中有3孔強(qiáng)陽(yáng)性，而孔強(qiáng)陽(yáng)性，而2孔陰性，應(yīng)該如何分析？孔陰性，應(yīng)該如何分析？實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 病例討論病例討論v 病歷病歷 患者吳xx,女性，39歲，漢族，廣東省汕頭籍，家住汕頭市鱸崗鎮(zhèn)，2007年5月18入院。 主訴：主訴： 尿檢、腎功異常6年，加重半年。緣于2001年5月無(wú)明顯誘因出現(xiàn)頭暈，腰酸痛，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，査尿常

23、規(guī)提示尿蛋白（+），腎功異常（肌酐130umol/L左右），給予對(duì)癥治療（具體不詳），癥狀緩解。此后病情平穩(wěn)。監(jiān)測(cè)腎功肌酐逐步上升，2006年9月為200umol/L,11月再次出現(xiàn)頭暈，伴惡心，嘔吐，測(cè)肌酐達(dá)700umol/L,就診于西安某醫(yī)院，診斷“慢性腎功不全尿毒癥期”，行左前臂內(nèi)瘺術(shù)，術(shù)后內(nèi)瘺栓塞。擬行腎移植術(shù)，但因無(wú)合適供體，回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院繼續(xù)治療。2007-5-15復(fù)查肌酐1400umol/L,為行腎移植術(shù)，就診我院，門診以“慢性腎功能不全尿毒癥期”收入科。病程中精神、飲食一般。24小時(shí)尿量1400ml左右，大便正常，體重?zé)o明顯變化?；橛罚夯颊?3歲已婚，生有2子3女，流產(chǎn)1次 v

24、查體：查體： 體溫 36.6 0C，脈搏80次/分，呼吸18次/分，血壓150/100mmHg發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)中等，神志清楚，精神欠佳，慢性病容，貧血貌，全身皮膚、黏膜無(wú)黃染，全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。頸靜脈無(wú)怒張，頸動(dòng)脈無(wú)異常搏動(dòng)，未捫及包塊，甲狀腺不腫大，氣管居中，頸軟無(wú)抵抗。胸廓對(duì)稱無(wú)畸形，無(wú)局限性隆起，雙側(cè)乳房對(duì)稱，未捫及腫塊。胸壁未見(jiàn)靜脈曲張，胸式呼吸存在，節(jié)律規(guī)整，叩診呈清音，肺肝界位于右鎖骨中線第5肋間，雙肺呼吸音清，未聞及干濕性羅音及胸膜摩擦音。心前區(qū)無(wú)隆起，心尖搏動(dòng)不明顯，未見(jiàn)異常搏動(dòng)，心界不大，心率80次/分，律齊，各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及病理性雜音，無(wú)心包摩擦音。腹平坦，腹肌軟，

25、全腹無(wú)壓痛及反跳痛，未捫及包塊，肝脾肋緣下未觸及。肝脾及雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，移動(dòng)性濁音陰性，腸鳴音正常35次/分。生理反射存在，病理反射未引出。?？茩z查: 雙側(cè)肋脊角未見(jiàn)異常隆起，皮膚無(wú)紅腫，雙腎區(qū)平坦，未觸及包塊，雙側(cè)肋脊點(diǎn)無(wú)明顯壓痛，雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，未聞及血管雜音。雙側(cè)輸尿管行徑無(wú)壓痛點(diǎn)，恥骨上區(qū)無(wú)膨隆及壓痛，膀胱叩診空虛。v 實(shí)驗(yàn)室檢查：實(shí)驗(yàn)室檢查： 血常規(guī)：WBC 4.42G/L，NEU% 68.5%，RBC 2.37G/L，HGB 60g/L，HCT 0.193,PLT 132G/L；血型：“B”型；血生化：BUN 25.4mmol/L，Cr 975umol/L,GLU 4.7mmol/

26、L，K+ 3.51mmol/L，Ca22.13mmol/L，TG1.35mmol/L，Tco2 21.1mmol/L；肝功能轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素結(jié)果正常；ALB 39.8g/L；自身抗體陰性；凝血四項(xiàng)基本正常；乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病及結(jié)核相關(guān)檢查均陰性；腫瘤標(biāo)記物檢查未見(jiàn)異常；尿常規(guī)：尿蛋白（+），尿白細(xì)胞（+），尿隱血（+）。PRA40。v 心電圖：心電圖：1.竇性心律，2.左室肥厚。v 胸片：胸片：心影增大，符合尿毒癥性心肌病。v 腹部腹部B超：超：1.雙腎縮小，實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)，左腎囊腫，2.右側(cè)附件區(qū)囊性占位，建議定期復(fù)查，3.肝、膽、胰、脾未見(jiàn)明顯異常。v 超聲心動(dòng)圖：超聲心動(dòng)圖：1.左房輕

27、度增大，2.主動(dòng)脈瓣反流（輕度），3.左室順應(yīng)性減低。v 胃鏡：胃鏡：十二指腸球炎。v 討論討論 患者高PRA,腎移植術(shù)前、術(shù)后注意事項(xiàng)。 患者出現(xiàn)高患者出現(xiàn)高PRAPRA的可能原因有哪些？的可能原因有哪些？ 等待移植的患者術(shù)前如果接受過(guò)輸血治療、或者前一次移植后因排斥而導(dǎo)致移植物失功以及女性患者曾經(jīng)生育過(guò)孩子（妊娠），那么患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)有可能受到來(lái)自其他個(gè)體（同種異體）的人類白細(xì)胞抗原（HLA）分子刺激（致敏），導(dǎo)致患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)同種異體HLA分子的特異性抗體，并釋放到外周血液中，我們將這些抗體稱為群體反應(yīng)性抗體（Panel Reactive Antibody, PRA），簡(jiǎn)稱為PRA。PRA陽(yáng)性受者稱為致敏受者，PRA40%的受者稱為高致敏受者?；颊呱?子3女，流產(chǎn)1次。這可能是高PRA的主要原因。 高高PRAPRA患者的器官移植存在哪些危害？患者的器官移植存在哪些危害？ 研究表明，PRA在實(shí)體器官（腎、心、肺、肝等）移植排斥反應(yīng)中扮演了重要角色，不僅與腎移植超急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)，而且與移植物功能延遲、急性排斥、慢性排斥以及移植物存活率下降也有關(guān)系 。v PRA陽(yáng)性陽(yáng)性患者在移植配型上應(yīng)