第3章細胞生物學研究方法

1、翟中和 王喜忠 丁明孝 主編 細胞生物學（第細胞生物學（第4版）版）Copyright 高等教育出版社 2011 第第3章章 細胞生物學研究方法細胞生物學研究方法進行初步觀察進行初步觀察形成可驗證的假說形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗設(shè)計對照試驗收集資料收集資料解釋結(jié)果解釋結(jié)果作出合理結(jié)論作出合理結(jié)論查閱已查閱已有知識有知識生物學研究模式生物生物學研究模式生物Caenorhabditis elegansDrosophila melanogasterArabidopsis thaliana生物學研究模式生物不同物種享有共同分子機制研究技術(shù)、研究工具研究技術(shù)、研究工具顯微鏡的出現(xiàn)顯微鏡的出現(xiàn)細胞學說的

2、建立細胞學說的建立電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)進入超微與分子形態(tài)水平進入超微與分子形態(tài)水平超離心技術(shù)超離心技術(shù) 細胞成分、代謝過程的細胞成分、代謝過程的同位素示蹤技術(shù)同位素示蹤技術(shù) 精確定性、定量分析精確定性、定量分析單克隆抗體、分子雜交單克隆抗體、分子雜交生物工程生物工程本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 細胞及其組分的分析方法 細胞培養(yǎng)與細胞工程 細胞及其生物大分子的動態(tài)變化 模式生物與功能基因組的研究 病毒 20-200 nm 支原體 0.1-0.3 m 細菌 0.5-5.0 m 動植物細胞 20-30 m 活細胞多是無色透明無色透明的直徑直徑第一節(jié)第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀

3、察方法細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 顯微鏡觀察范圍顯微鏡觀察范圍 肉眼觀察范圍肉眼觀察范圍 肉眼 0.2 mm 光學顯微鏡 0.2 m 電子顯微鏡 0.2 nm 掃描隧道顯微鏡 樣品制備樣品制備技術(shù)分辨率分辨率一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡 (light microscope) 從細胞的發(fā)現(xiàn)、細胞學說的建立，直至今天光學顯微鏡仍然是細胞生物學研究的重要工具1. 目鏡目鏡 2. 準焦螺旋準焦螺旋3. 物鏡物鏡 4. 載物臺載物臺5. 反光鏡反光鏡（一）普通復式光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡組成組成 由由3 部分組成：部分組成： 光學放大系統(tǒng)（目鏡光學放大系統(tǒng)（目鏡與物鏡）與物鏡） 照明系統(tǒng)（光源和照

4、明系統(tǒng)（光源和聚光鏡）聚光鏡） 鏡架及調(diào)節(jié)系統(tǒng)鏡架及調(diào)節(jié)系統(tǒng)光學顯微鏡光光學學放放大大系系統(tǒng)統(tǒng)目目鏡鏡物物鏡鏡照照明明系系統(tǒng)統(tǒng)聚聚光光鏡鏡光光源源機機械械支支持持系系統(tǒng)統(tǒng)（一）普通復式光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡成像成像 放大的倒立虛像放大的倒立虛像 經(jīng)物鏡形成倒立實像 經(jīng)目鏡進一步放大成虛像（一）普通復式光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡分辨率分辨率 分辨率是指能區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離 普通光學顯微鏡最大分辨率0.2 m: 光源波長光源波長N : 介質(zhì)折射率介質(zhì)折射率, 空氣為空氣為1, 油為油為1.4: 物鏡鏡口角物鏡鏡口角(樣品對物鏡鏡口的張樣品對物鏡鏡口的張角角,最大最大14

5、0o,Sin/2 最大最大0.94 )甲醛甲醛石蠟石蠟5m（一）普通復式光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡樣品制備樣品制備發(fā)明： 19341935 荷蘭物理學家Zernike 設(shè)計和發(fā)明相差顯微鏡，并獲得諾貝爾獎。優(yōu)點：樣品不需染色，可以觀察活細胞。原理：利用光線干涉的原理把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比，從而提高了各種結(jié)構(gòu)之間的對比度，使標本的各種結(jié)構(gòu)變得更清晰。（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡相差顯微鏡（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡 利用光線干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實現(xiàn)對非染色活細

6、胞非染色活細胞的觀察 A. 當兩束光的相位相同時，相互干涉的結(jié)果使光波的振幅增加，亮度增強。 B. 當兩束光的相位相反時，則導致光波的振幅降低（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡 相差顯微鏡是在普通光學顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加 “環(huán)狀光闌”和 “相差板”，將光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差。 這是在構(gòu)造上，相差顯微鏡不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。體外培養(yǎng)MDCK 細胞在普通（明視場）光學顯微鏡（A）和相 差顯微鏡（B）下拍攝圖像效果的比較微分干涉相差顯微鏡 （DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。

7、標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細胞中較大的細胞器。（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡1、分辨率比普通光鏡提高了一個數(shù)量級2、錄像增差顯微鏡可以用來直接觀察顆粒物質(zhì)沿著微管運輸?shù)膭討B(tài)過程特點：特點：Four types of light microscopy (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the

8、cell, a technique known as bright-field microscopy（光學顯微鏡）（光學顯微鏡） (B) phase-contrast microscopy(相差顯微鏡相差顯微鏡) (C) differential-interference-contrast microscopy(微分干涉相差顯微鏡微分干涉相差顯微鏡) (D) dark-field microscopy(暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡)正置顯微鏡與倒置顯微鏡比較正置顯微鏡與倒置顯微鏡比較組成一樣，倒置顯微鏡的組成一樣，倒置顯微鏡的物鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之

9、下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡實物實物（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡基本原理基本原理 熒光：熒光：分子吸收入射光能量后電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)而發(fā)出的可見光(波長比入射光長)特點：特點：1. 利用利用汞燈或氙燈作為熒光激汞燈或氙燈作為熒光激發(fā)光源發(fā)光源，波長較短，分辨，波長較短，分辨率高于普通顯微鏡；率高于普通顯微鏡；2 .核心部件是核心部件是濾光片系統(tǒng)濾光片系統(tǒng)及及專專用物鏡鏡頭用物鏡鏡頭；3. 濾光片系統(tǒng)由濾光片系統(tǒng)由激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片和和阻斷濾光片阻斷濾

10、光片組成。組成。應(yīng)用：應(yīng)用： 對細胞內(nèi)生物大分子進行對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位研究。定性、定位研究。反射波長低于510nm的光520560nm的綠色熒光透過450490nm藍光透過透過波長超過510nm的光物鏡物鏡樣品樣品目鏡目鏡激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片阻斷濾光片阻斷濾光片（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡基本原理基本原理（三）熒光顯微鏡（三）熒光顯微鏡樣品制備樣品制備 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 熒光素直接標記技術(shù)熒光素直接標記技術(shù) 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白(GFP)的基因與編碼某種蛋白質(zhì)的基因相融合表達融合表達 兩種以上熒光素標記同一樣品，可同時顯示不同成分在細胞中的定位（三）熒光顯微鏡（三

11、）熒光顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用 在光鏡水平上，對細胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂質(zhì)以及某些離子等組分進行定性定位研究的有力工具熒光顯微鏡顯示出在有絲分裂中期細胞中，紡紡錘體微管（綠色）錘體微管（綠色）、中期染色體（藍色）中期染色體（藍色）和原原纖維狀蛋白（纖維狀蛋白（fibrillarin）（紅色）（紅色）等結(jié)構(gòu)成分共聚焦顯微鏡及其顯微圖像共聚焦顯微鏡及其顯微圖像（四）激光掃描共焦顯微鏡（四）激光掃描共焦顯微鏡 以激光為光源 聚光鏡和物鏡同時聚焦到同一點上，排除焦平面以外的成像 利用激光掃描裝置和計算機高速采集與處理匯聚每一個點上的信息，形成清晰的二維圖像 分辨率比普通熒光顯微鏡1.41.7 倍（四）

12、激光掃描共焦顯微鏡（四）激光掃描共焦顯微鏡 可通過“光學 切片” 疊加后重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)zxy3D Image Reconstruction熒光顯微鏡（熒光顯微鏡（a）和激光掃描共焦顯微鏡（）和激光掃描共焦顯微鏡（b）藍色為細胞核，綠色為微管藍色為細胞核，綠色為微管 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM C CW V 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡特點特點 電子束電子束作為光源 電磁透鏡電磁透鏡聚焦 鏡筒高度真空真空 圖像通過熒光屏或感光膠片記錄顯微鏡顯微鏡分辨本領(lǐng)分辨本領(lǐng)光源光源透鏡透

13、鏡真空真空成像原理成像原理光學顯微鏡光學顯微鏡電子顯微鏡電子顯微鏡200nm近近0.1nm可見光（波長約可見光（波長約400700nm） 電子束電子束（0.010.9nm）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光的吸利用樣品對光的吸收形成明暗反差和收形成明暗反差和顏色變化顏色變化利用樣品對電子的利用樣品對電子的散射和透射形成明散射和透射形成明暗反差暗反差* *電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別電子束的波長與加速電壓有關(guān)。當加速電壓為電子束的波長與加速電壓有關(guān)。當加速電壓為50100千伏

14、時，電子束波長約為千伏時，電子束波長約為0.00530.0037納米納米1電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別2電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù) 電子顯微鏡分辨率分辨率可達0.2 nm 電鏡的分辨本領(lǐng)分辨本領(lǐng)是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率3電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造 電子束照明系統(tǒng)電子束照明系統(tǒng) 成像系統(tǒng)成像系統(tǒng) 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 記錄系統(tǒng)記錄系統(tǒng)（二）透射電鏡制樣技術(shù)（二）透射電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)戊二醛和四氧化鋨環(huán)氧樹脂厚度40-50nm重金屬鹽超薄切片黑白圖像超薄切片技術(shù)顯示的細胞超微結(jié)構(gòu)超薄切片

15、技術(shù)顯示的細胞超微結(jié)構(gòu) 應(yīng)用超薄切片技術(shù)，幾乎可以觀察細胞的各種超微結(jié)構(gòu)Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)l用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，染料，樣品干燥后，凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而樣品凸出的地方則沒有染料沉積，結(jié)果在圖像中而樣品凸出的地方則沒有染料沉積，結(jié)果在圖像中背景是黑暗的背景是黑暗的，而，而樣品樣品像像“透明透明”地地光亮光亮。*負染色是負染色是只染背景而不染樣品只染背景而不染樣品，與光學

16、顯微鏡樣，與光學顯微鏡樣品的染色正好相反。品的染色正好相反。（二）透射電鏡制樣技術(shù)（二）透射電鏡制樣技術(shù)負染色技術(shù)負染色技術(shù)（二）透射電鏡制樣技術(shù)（二）透射電鏡制樣技術(shù)負染色技術(shù)負染色技術(shù) 觀察線粒體基粒、核糖體、蛋白顆粒及細胞骨架纖維甚至病毒等 重金屬鹽沉積在銅網(wǎng)上，而樣品未被染色樣品未被染色（故名負染） 分辨率可達1.5 nm 左右（二）透射電鏡制樣技術(shù)（二）透射電鏡制樣技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù) 包括冰凍斷裂冰凍斷裂與蝕刻復型蝕刻復型兩步 觀察膜斷裂面上的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面形貌特征，圖像有立體感 樣品不需固定包埋 冰凍蝕刻電鏡照片細胞斷裂面結(jié)構(gòu) 透射電鏡照片與冰凍蝕刻電鏡照片比較透射電

17、鏡照片與冰凍蝕刻電鏡照片比較電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù) 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 低溫電鏡技術(shù)低溫電鏡技術(shù) 電子掃描斷層成像技術(shù)電子掃描斷層成像技術(shù)核孔復合物核孔復合物（三）掃描電鏡技術(shù)（三）掃描電鏡技術(shù) 利用電子“探針”在樣品表面進行“掃描”激發(fā)樣品表面放出的二次電子成像，可以得到樣品表面的立體形貌（三）掃描電鏡技術(shù)（三）掃描電鏡技術(shù) 樣品利用CO2 臨界點干燥法處理 樣品觀察前噴鍍一層金膜 一般掃描電鏡的分辨本領(lǐng)僅為3 nmFigure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland S

18、cience 2008)Red blood cell Yeast Sperm小結(jié)：光鏡、透射電鏡與掃描電鏡原理比較小結(jié)：光鏡、透射電鏡與掃描電鏡原理比較注意樣品制備技術(shù)的差異！三、掃描隧道顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡 探測微觀世界物質(zhì)表面形貌 利用量子力學中的隧道效應(yīng) 具有原子尺度的高分辨本領(lǐng) 可以在真空、大氣、液體等多種條件下工作 非破壞性測量 直接觀察生物大分子結(jié)構(gòu)第二節(jié)第二節(jié) 細胞及其組分的分析方法細胞及其組分的分析方法 一、用超離心技術(shù)分離細胞組分 二、細胞成分的細胞化學顯示方法 三、特異蛋白抗原的定位與定性 四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 五、定量細胞化學分析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 細胞及其組

19、分的分析方法細胞及其組分的分析方法一、用超離心技術(shù)分離細胞組分一、用超離心技術(shù)分離細胞組分 差速離心：差速離心：利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種質(zhì)量和密度不同的亞細胞組分和各種顆粒分開差速離心差速離心一、用超離心技術(shù)分離細胞組分一、用超離心技術(shù)分離細胞組分 密度梯度離心：密度梯度離心：通過離心力的作用使樣品中不同組分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降帶1. 速度沉降速度沉降 velocity sedimentation 用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2.等

20、密度沉降等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分離密度不等的顆粒。 特點：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。用超速離心技術(shù)分離細胞組分用超速離心技術(shù)分離細胞組分 組織勻漿組織勻漿 分離出各組分分離出各組分差速離心密度梯度離心差速離心：差速離心：分離密度不同的細胞組分分離密度不同的細胞組分密度梯度離心：密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離精細組分或生物大分

21、子的分離用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物二、細胞成分的細胞化學顯示方法二、細胞成分的細胞化學顯示方法 顯色劑與細胞組分中特殊基團的結(jié)合 通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)在細胞中的分布和相對含量福爾根反應(yīng)福爾根反應(yīng) Feulgen stain 特異顯示特異顯示細胞內(nèi)呈紫紅色的DNA 的分布的分布 原理：原理：酸水解可以去除RNA，僅保留 DNA，并除去DNA 上嘌呤脫氧核糖核苷鍵的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基與希夫試劑 （Schiffs reagent）反應(yīng)呈紫紅色。DNA Feulgen反應(yīng)反應(yīng)多

22、糖多糖 PAS反應(yīng)反應(yīng) 如淀粉、纖維素及動物如淀粉、纖維素及動物 細胞中的糖原、粘蛋白等。細胞中的糖原、粘蛋白等。脂類脂類 蘇丹染色等蘇丹染色等蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 米倫反應(yīng)米倫反應(yīng)三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性 細胞內(nèi)特異蛋白的顯示可通過抗原抗體特異結(jié)合抗原抗體特異結(jié)合的方法得以實現(xiàn) 若抗體偶聯(lián)熒光染料抗體偶聯(lián)熒光染料，則可以通過熒光顯微鏡、激光共焦顯微鏡觀察 為了觀察特異蛋白在細胞內(nèi)的精細定位，抗體需偶聯(lián)電子致抗體需偶聯(lián)電子致密物密物(膠體金)，用電鏡觀察抗原：抗原：能刺激機體產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。能刺激機體產(chǎn)生抗體的物質(zhì)?？贵w：抗體：由抗原刺激在機體內(nèi)產(chǎn)生，并與抗原發(fā)生特異性

23、結(jié)合的蛋由抗原刺激在機體內(nèi)產(chǎn)生，并與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱。白質(zhì)的總稱。多克隆抗體：多克隆抗體：由不同的由不同的B淋巴細胞產(chǎn)生的抗體混合物。淋巴細胞產(chǎn)生的抗體混合物。（一）免疫熒光技術(shù)（一）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)：免疫熒光技術(shù)：l將免疫學方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標記技術(shù)結(jié)合將免疫學方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來，研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。起來，研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。l利用熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對利用熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。抗原進行細胞定位。（一）免疫熒光技術(shù)（一）免疫熒光技術(shù)

24、（一）免疫熒光技術(shù)（一）免疫熒光技術(shù) 直接間接免疫熒光直接間接免疫熒光技術(shù)（A） 間接免疫熒光間接免疫熒光技術(shù)（B）免疫熒光染色觀察腫瘤細胞骨架免疫熒光染色觀察腫瘤細胞骨架l將抗體進行特殊標記后用電子顯微鏡觀察免疫反將抗體進行特殊標記后用電子顯微鏡觀察免疫反應(yīng)的結(jié)果。應(yīng)的結(jié)果。l免疫膠體金技術(shù)：將抗體與金顆粒偶聯(lián)，經(jīng)免疫免疫膠體金技術(shù)：將抗體與金顆粒偶聯(lián)，經(jīng)免疫染色后，在電鏡下金顆粒所在部位即為抗原位置。染色后，在電鏡下金顆粒所在部位即為抗原位置。（二）免疫電鏡技術(shù)（二）免疫電鏡技術(shù)（二）免疫電鏡技術(shù)（二）免疫電鏡技術(shù) 在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位 免疫膠體金技術(shù)受到越來越多的青睞四

25、、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 原位雜交：原位雜交：用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù) 光鏡水平 同位素標記或熒光素標記的探針 電鏡水平 生物素標記的探針與抗生物素抗體相連膠體金標記結(jié)合 人類染色體端粒人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片的熒光原位雜交照片 五、定量細胞化學分析與細胞分選技術(shù)五、定量細胞化學分析與細胞分選技術(shù)主要應(yīng)用：主要應(yīng)用： 用于定量測定細胞中的用于定量測定細胞中的DNADNA、RNARNA或某一特異或某一特異蛋白的含量；蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；測定細胞群體中

26、不同時相細胞的數(shù)量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離分離DNADNA含量不同的中期染色體。含量不同的中期染色體。流式細胞術(shù)（流式細胞術(shù)（Flow CytometryFlow Cytometry）排列成單列的細胞通過激光排列成單列的細胞通過激光束時，儀器可測定出標記細束時，儀器可測定出標記細胞上的熒光強度；胞上的熒光強度；儀器使帶有熒光細胞的小水儀器使帶有熒光細胞的小水滴充電；滴充電；帶電水滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板偏帶電水滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板偏離原來方向，收集細胞；離原來方向，收集細胞；未含標記的細胞或不含有細未含標記的細胞或不含有細胞的水滴不偏轉(zhuǎn)。胞的水滴不

27、偏轉(zhuǎn)。五、定量細胞化學分析與細胞分選技術(shù)五、定量細胞化學分析與細胞分選技術(shù) 流式細胞術(shù)是對細胞進行快速定量分析與分選流式細胞術(shù)是對細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和和熒光熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純

28、度的細胞亞群，分離純度可達高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。（。（flow cytometer）。）。第三節(jié)第三節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞工程細胞培養(yǎng)與細胞工程http:/ 細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學研究方法中細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學研究方法中最有價值的技術(shù)，通過細胞培養(yǎng)可以獲得大最有價值的技術(shù)，通過細胞培養(yǎng)可以獲得大量的細胞，也可通過細胞培養(yǎng)研究細胞的運量的細胞，也可通過細胞培養(yǎng)研究細胞的運動、細胞的信號傳導、細胞的合成代謝等動、細胞的信號傳導、細胞的合成代謝等。 一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng) 體外培養(yǎng)細胞必須注意三個環(huán)節(jié)：物質(zhì)營養(yǎng)、生存環(huán)境和廢物的排除。物質(zhì)營養(yǎng)、生存環(huán)境和廢物的排除。體外培養(yǎng)的動物

29、細胞可分為體外培養(yǎng)的動物細胞可分為*原代細胞培養(yǎng)步驟：原代細胞培養(yǎng)步驟：一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) *仍保持原來染色仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量體的二倍體數(shù)量及接觸抑制行為及接觸抑制行為染色體改變，呈亞染色體改變，呈亞二倍體或非整倍性，二倍體或非整倍性，失去接觸抑制失去接觸抑制*腫瘤細胞失去接觸抑制行為腫瘤細胞失去接觸抑制行為 * 一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) 基本形態(tài)：成纖維樣成纖維樣細胞和上皮樣上皮樣細胞 貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)HelaCHO成纖維細胞 上皮樣細胞目前實驗室中常用的幾種細胞系目前實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞系名

30、稱細胞類型細胞類型來源來源3T33T3成纖維細胞成纖維細胞小鼠小鼠HeLaHeLa宮頸癌上皮細胞宮頸癌上皮細胞人人BHK21BHK21成纖維細胞成纖維細胞敘利亞倉鼠敘利亞倉鼠PtKlPtKl上皮細胞上皮細胞袋鼠袋鼠L6L6成肌細胞成肌細胞大鼠大鼠PC12PC12嗜鉻細胞嗜鉻細胞大鼠大鼠SP2SP2漿細胞漿細胞小鼠小鼠SP2SP20 0骨髓瘤漿細胞骨髓瘤漿細胞小鼠小鼠CHOCHO卵巢細胞卵巢細胞中國地鼠中國地鼠 利用植物細胞具有的利用植物細胞具有的全能性全能性。 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)植物細胞

31、培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng) 單倍體細胞培養(yǎng)：單倍體細胞培養(yǎng)：用花藥或花粉在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，通過發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者通 過愈傷組織誘導分化出芽和根，最終長成植株一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)：原生質(zhì)體培養(yǎng)：體細胞經(jīng)纖維素酶處理去掉細胞壁的原生質(zhì)體經(jīng)誘導分化長成植株二、細胞工程二、細胞工程細胞融合 （一）細胞融合與單克隆抗體技術(shù)（一）細胞融合與單克隆抗體技術(shù)（一）細胞融合與單克隆抗體技術(shù)（一）細胞融合與單克隆抗體技術(shù) 細胞融合細胞融合 滅活的病毒 化學物質(zhì)（如PEG） 電融合 同核體同核體（homokaryon） 異核體異核體（heterokaryon

32、） 合核體合核體（synkaryon）單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)1975年英國科學家年英國科學家Milstein和和Kohler所發(fā)明，所發(fā)明， 并獲得并獲得1984年諾年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。貝爾醫(yī)學和生理學獎。原理：原理：B淋巴細胞淋巴細胞能夠能夠產(chǎn)生抗體產(chǎn)生抗體， 但在體外不能進行無限分裂但在體外不能進行無限分裂; 而而瘤細胞瘤細胞雖然可以在體外進行雖然可以在體外進行無限無限傳代傳代， 但不能產(chǎn)生抗體。將這兩但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細胞融合后得到的雜交瘤細胞種細胞融合后得到的雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性。具有兩種親本細胞的特性。 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備把細胞核與細胞質(zhì)分離

33、開來，然后把不同把細胞核與細胞質(zhì)分離開來，然后把不同來源的細胞質(zhì)和細胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細胞。來源的細胞質(zhì)和細胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細胞。物理法：機械法或短波光物理法：機械法或短波光細胞拆合分為細胞拆合分為化學法：細胞松弛素化學法：細胞松弛素（二）顯微操作技術(shù)與動物的克?。ǘ╋@微操作技術(shù)與動物的克隆顯微操作儀顯微操作儀正在進行核移植操作正在進行核移植操作（二）顯微操作技術(shù)與動物的克隆（二）顯微操作技術(shù)與動物的克隆克隆羊多莉的培育克隆羊多莉的培育第四節(jié)第四節(jié) 細胞及生物大分子的動態(tài)變化細胞及生物大分子的動態(tài)變化Martin D N , Baehrecke E H Developmen

34、t 2004;131:275-284一、熒光漂白恢復技術(shù)一、熒光漂白恢復技術(shù) 親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián) 高能激光束的照射使某一區(qū)域熒光不可逆淬滅 由于生物膜的流動性，淬滅區(qū)熒光強度逐漸恢復 測定脂質(zhì)或蛋白質(zhì)在細胞中運動速率fluorescence photobleaching recovery， FPRFigure 10-36a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)二、單分子技術(shù)與細胞生命活動的研究二、單分子技術(shù)與細胞生命活動的研究 指在單分子水平上對生物分子的行為(構(gòu)象變化、相互作

35、用、相互識別等）的實時動態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上的操縱調(diào)控等use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesinFluorescent image of single motor proteins (left): Motion of two diffusing kinesin molecules (green) on a microtubule (red) shown as a time series kymograph. Schematic (right): By dragging diffusing kin

36、esin molecules with laser tweezers over a microtubule, the friction force between the motor and its microtubule track can be measured very precisely三、酵母雙雜交技術(shù)三、酵母雙雜交技術(shù) 在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用 利用轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA 結(jié)合域(DB)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)結(jié)合在一起才具有完整轉(zhuǎn)錄激活功能的原理四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)分子具有不同能級：分子中的外層電子，一般處于電子的基

37、態(tài)S0 (electronic ground state ) 的最低振動能級吸收光能以后，它可以被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)S1的任意振動能級。這過程發(fā)生在10-15s時間內(nèi)被激發(fā)的分子，首先釋放能量回到S1的最低振動能級，此過程發(fā)生在10-12s內(nèi)；然后從S1的最低振動能級回到S0的各振動能級，并以光子的形式釋放能量，即發(fā)射熒光FRET產(chǎn)生的條件產(chǎn)生的條件 D、A都能發(fā)熒光 D的發(fā)射光譜和A的激發(fā)（或吸收）光譜必須有部分重疊 D和A之間的距離必須小于10nm。 檢測活細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子是否直接相互作用 如果兩個蛋白相互作用，其中一個蛋白激發(fā)后發(fā)出的熒光可激發(fā)另一蛋白產(chǎn)生熒光兩個蛋白未相互作用相互

38、作用五、放射自顯影技術(shù)五、放射自顯影技術(shù) 利用放射性同位素的電離射線對乳膠(含AgBr 或 AgCl)的感光作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究 兩個主要步驟：兩個主要步驟：即同位素標同位素標記的生物大分子前體的摻入記的生物大分子前體的摻入和細胞內(nèi)同位素的顯示細胞內(nèi)同位素的顯示根據(jù)實驗要求選擇合適的同位素根據(jù)實驗要求選擇合適的同位素 研究DNA 合成時通常用氚（3H）標記的3H-TdR 研究RNA 合成用3H-U 在研究含硫蛋白分子代謝時，用 35S 標記的蛋氨酸和半胱氨酸 對細胞或生物體內(nèi)生物大分子動態(tài)研究和追蹤：持續(xù)標持續(xù)標記記、脈沖標記脈沖標記 顯微放射自顯影顯微放射自顯影 電鏡放射自顯影電鏡放射自顯影胰島胰島B細胞電鏡放射