生化需氧量測(cè)定方法簡(jiǎn)介

1、 稀釋與接種法 微生物傳感器快速測(cè)定法 測(cè)壓法 活性污泥曝氣降解法 增溫法生化需氧量原理測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件 樣品本身特性的影響 操作因素的影響影響因素常見(jiàn)問(wèn)題 生化需氧量又稱(chēng)生化耗氧量，英文（biochemical oxygen demand）縮寫(xiě)B(tài)OD，是表示水中有機(jī)物等需氧污染物質(zhì)含量的一個(gè)綜合指標(biāo)，它是指在規(guī)定條件下，微生物分解存在的水中某些可氧化物質(zhì)，特別是有機(jī)物所進(jìn)行的生物化學(xué)過(guò)程中消耗溶解氧的量。其值越高，說(shuō)明水中有機(jī)污染物質(zhì)越多，污染也就越嚴(yán)重。 微生物分解有機(jī)物是一個(gè)緩慢的過(guò)程，大致可分為兩個(gè)階段：第一階段主要是碳水化合物被氧化，稱(chēng)為碳化階段，在20下要720d才能完成；第

2、二階段是含氮化合物在硝化細(xì)菌的作用下被氧化為氨，當(dāng)水中的氧充足時(shí)，再被氧化為亞硝酸和硝酸，稱(chēng)為硝化階段。第二階段進(jìn)行緩慢， 20下需100多天才能完成。經(jīng)過(guò)5d的生化過(guò)程，碳化階段已進(jìn)行了大半，并開(kāi)始進(jìn)入硝化階段。對(duì)生活污水來(lái)說(shuō)，它約等于完全氧化分解耗氧量的70%，因此，目前國(guó)內(nèi)外均采用20培養(yǎng)5d的生化需氧量（簡(jiǎn)稱(chēng)BOD5），作為水體質(zhì)量的重要參數(shù)。 BOD5自作為水質(zhì)污染指標(biāo)以來(lái)，其測(cè)定方法一直在不斷改進(jìn)完善和發(fā)展。目前主要以稀釋和接種法作為經(jīng)典方法廣泛應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)、比對(duì)實(shí)驗(yàn)、仲裁分析中，以微生物傳感器法作為快速測(cè)定法應(yīng)用于快速測(cè)定分析中。此外還有測(cè)壓法、增溫法、活性污泥曝氣降解法、檢壓

3、庫(kù)侖法、坪臺(tái)值法等應(yīng)用于特定環(huán)境或研究分析中。 稀釋與接種法是指將水樣經(jīng)適度稀釋或者接種后在20培養(yǎng)5天，測(cè)定培養(yǎng)前后水樣中溶解氧的質(zhì)量濃度，由培養(yǎng)前后溶解氧的質(zhì)量濃度之差，計(jì)算每升樣品消耗的溶解氧量，以BOD5形式表示。作為測(cè)定BOD5的經(jīng)典方法，其發(fā)展歷史可以追溯至1936年，美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)將五日生化需氧量稀釋法規(guī)定為水和廢水的檢驗(yàn)方法，從而形成了標(biāo)準(zhǔn)稀釋法(BOD5法)，并為ISO/TC-147推薦，1987年我國(guó)參照ISO5815-1983，將此方法頒布為水質(zhì)分析方法標(biāo)準(zhǔn)GB7488-87，2009年環(huán)境保護(hù)部對(duì)GB7488-87進(jìn)行修訂，并頒布 HJ 5052009標(biāo)準(zhǔn)。 微生物傳

4、感器快速測(cè)定法原理是當(dāng)含有飽和溶解氧的水樣進(jìn)入流通池中與微生物傳感器接觸，水樣中溶解性可生化降解的有機(jī)物受到微生物菌膜中菌種的作用，使擴(kuò)散到氧電極表面上氧的質(zhì)量減少。當(dāng)水樣中可生化降解的有機(jī)物向菌膜擴(kuò)散速度（質(zhì)量）達(dá)到恒定時(shí)，此時(shí)擴(kuò)散到氧電極表面上氧的質(zhì)量也達(dá)到恒定，因此產(chǎn)生了一個(gè)恒定電流。由于恒定電流與水樣中可生化降解的有機(jī)物濃度的差值與氧的減少量存在定量關(guān)系，據(jù)此可換算出水樣中生物化學(xué)需氧量。1990年日本頒布了微生物電極法（JISK3602-1990）,我國(guó)于2002年頒布微生物傳感器快速測(cè)定法（HJ/T86-2002）。此法最大特點(diǎn)是水樣不需要培養(yǎng)5天，快速測(cè)定即得結(jié)果，不僅節(jié)約了實(shí)驗(yàn)

5、時(shí)間，而且可以實(shí)時(shí)掌握這一水質(zhì)污染指標(biāo)，大大提高了工作效率。 將水樣置于密閉培養(yǎng)瓶中，并放入CO2吸收劑用于吸收水樣中微生物呼吸作用所產(chǎn)生的CO2，微生物在降解有機(jī)物過(guò)程中消耗溶解氧造成此密閉系統(tǒng)內(nèi)壓力下降，測(cè)量此壓降即可換算得生化需氧量。 在溫度為3035，用活性污泥強(qiáng)制曝氣降解樣品2h，經(jīng)重鉻酸鉀消解生物降解前后的樣品，測(cè)定生物降解前后的化學(xué)需氧量，其差值即為BOD，可根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果換算為BOD5。 增溫法就是適當(dāng)提高反應(yīng)溫度，激化微生物的活性，加速微生物的分解作用，縮短培養(yǎng)周期，達(dá)到快速測(cè)定。研究人員根據(jù)BOD 反映動(dòng)力學(xué)原理，提出了增溫法快速測(cè)定BOD5 培養(yǎng)時(shí)間計(jì)算公式

6、，并計(jì)算出了適用絕大多數(shù)水樣的通用增溫培養(yǎng)時(shí)間，通過(guò)對(duì)增溫法理論上的準(zhǔn)確性和可行性的分析，證明增溫法是可行的。 以上BOD測(cè)定方法均各有優(yōu)劣：稀釋與接種法應(yīng)用廣泛最為經(jīng)典，但操作復(fù)雜，時(shí)效性差；測(cè)壓法在此基礎(chǔ)上改進(jìn)為自動(dòng)測(cè)定，但同樣需培養(yǎng)5天，難以快速通過(guò)這一指標(biāo)反映水質(zhì)狀況；微生物傳感器法測(cè)定快速方便，但菌膜需要維護(hù)且受干擾影響多；活性污泥曝氣降解法和增溫法縮短了培養(yǎng)周期，但其精密度不高，僅適用于特定水樣。 BOD是通過(guò)微生物耗氧量間接反映水中可生化有機(jī)物含量的一個(gè)指標(biāo)，而微生物的生化反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，水樣本身的特性、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件以及人員的操作等因素都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響。 實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件對(duì)微生

7、物的生化過(guò)程有很大影響。 樣品儲(chǔ)存運(yùn)輸、培養(yǎng)以及測(cè)定過(guò)程的時(shí)間與溫度均會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而影響測(cè)定結(jié)果。 一般認(rèn)為2040是微生物生長(zhǎng)的適宜溫度，在此范圍內(nèi)溫度提高10，微生物活性提高12倍。溫度升高加快反應(yīng)速率，以致培養(yǎng)溫度每相差1都會(huì)引起5%左右的誤差。稀釋與接種法規(guī)定樣品的儲(chǔ)存運(yùn)輸時(shí)間應(yīng)在采集后24 h內(nèi)，24 h內(nèi)不能分析，可冷凍保存，樣品培養(yǎng)時(shí)間為5d4h，測(cè)定前待測(cè)試樣的溫度需達(dá)到（202），培養(yǎng)溫度為（201）。 要滿(mǎn)足這樣的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件，樣品運(yùn)輸過(guò)程中可使用車(chē)載冰箱儲(chǔ)存，到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后培養(yǎng)之前，可通過(guò)水浴將樣品快速升溫至20，培養(yǎng)過(guò)程中使用誤差1的恒溫培養(yǎng)箱，整個(gè)操作室內(nèi)

8、使用空調(diào)將環(huán)境溫度控制在20左右，以保證培養(yǎng)前后測(cè)定過(guò)程中的環(huán)境溫度不會(huì)影響樣品。 嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件，可以排除外部因素的影響，而樣品本身的特性，則直接關(guān)系到微生物的生存空間，排除掉水樣中對(duì)微生物生化反應(yīng)有影響的干擾因子，才能更為真實(shí)的測(cè)定微生物耗氧量，從而更為準(zhǔn)確的反映出樣品中可生化有機(jī)物的含量。 水樣的pH值會(huì)影響微生物的活性，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)抑制其生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)pH在68之間微生物氧化作用最快6， 說(shuō)明此pH范圍適宜微生物生長(zhǎng)。稀釋與接種法標(biāo)準(zhǔn)HJ/T505-2009中規(guī)定若樣品或稀釋后樣品pH值不在68范圍內(nèi)，應(yīng)用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值至68。水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法中則要

9、求將pH值調(diào)節(jié)到6.57.5范圍內(nèi)。 由于游離氯或結(jié)合氯會(huì)影響微生物的活性，當(dāng)樣品中含有少量余氯時(shí)，需在采樣后放置12h使游離氯散發(fā)。對(duì)在短時(shí)間內(nèi)不能消失的余氯，可加入適量亞硫酸鈉溶液去除樣品中存在的余氯和結(jié)合氯。 含有大量顆粒物、需要較大稀釋倍數(shù)的樣品或經(jīng)冷凍保存的樣品，測(cè)定前均需對(duì)樣品進(jìn)行均質(zhì)化處理，否則會(huì)產(chǎn)生較大誤差。一般可攪拌使其混合均勻，對(duì)于高懸濁樣品可使用水浴超聲器對(duì)其進(jìn)行超聲波振蕩處理，使其均質(zhì)混合。 若樣品中有大量藻類(lèi)存在，藻類(lèi)生存的呼吸作用和光合作用會(huì)改變樣品中溶解氧含量，培養(yǎng)過(guò)程中藻類(lèi)死亡后會(huì)作為有機(jī)物被微生物分解，增加耗氧量，導(dǎo)致BOD5測(cè)定結(jié)果偏高。當(dāng)分析結(jié)果精度要求較

10、高時(shí)，測(cè)定前應(yīng)用濾孔為1.6m的濾膜（5.1）過(guò)濾，檢測(cè)報(bào)告中注明濾膜濾孔的大小。 若樣品含鹽量低，缺乏微生物生長(zhǎng)所需的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素，限制其生長(zhǎng)繁殖，造成沒(méi)有足夠的微生物去降解樣品中的有機(jī)物，使測(cè)定結(jié)果虛低。稀釋與接種法標(biāo)準(zhǔn)HJ/T505-2009中規(guī)定非稀釋樣品的電導(dǎo)率小于125S/cm時(shí)，需加入適量鹽溶液，使樣品的電導(dǎo)率大于125S/cm。 樣品中微生物的生存也受到其中重金屬等有毒物質(zhì)含量的影響。某些重金屬離子吸附于微生物的細(xì)胞壁后，可穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與菌體蛋白質(zhì)結(jié)合使之變性。研究人員發(fā)現(xiàn)重金屬等有毒物質(zhì)超過(guò)一定限值會(huì)對(duì)微生物活性產(chǎn)生影響，可使用經(jīng)馴化的微生物接種液稀釋水對(duì)水樣進(jìn)行稀

11、釋?zhuān)蛱岣呦♂尡稊?shù)以減少其濃度。而高濃度殺菌劑、農(nóng)藥類(lèi)等物質(zhì)還會(huì)對(duì)微生物膜內(nèi)菌種產(chǎn)生毒害作用，造成微生物傳感器測(cè)定法產(chǎn)生較大的誤差。 一般測(cè)定水樣BOD5時(shí)，主要生物氧化作用為碳化作用，硝化作用很不顯著或根本不發(fā)生，但若樣品中含有硝化細(xì)菌（如生物處理池出水）時(shí)，在測(cè)定BOD5時(shí)部分含氮化合物的耗氧量也計(jì)入其中，因此須加入硝化抑制劑，抑制硝化過(guò)程。需要注意的是硝化抑制劑也是有機(jī)物，加入后也會(huì)被微生物分解而耗氧，造成系統(tǒng)誤差，可通過(guò)測(cè)定全程序空白扣除。 除樣品本身特性和外部實(shí)驗(yàn)條件兩大影響因素之外，實(shí)驗(yàn)人員的操作也是關(guān)鍵影響因素。 樣品中的溶解氧含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡值，有可能受采集、保存、稀釋、培養(yǎng)

12、、測(cè)定等一系列操作影響。操作過(guò)程中應(yīng)注意不使水樣曝氣，并通過(guò)快速升溫或震搖方式排除過(guò)飽和氧。 操作中使用的玻璃器皿應(yīng)徹底洗凈，以防瓶壁沾染有機(jī)物或?qū)ξ⑸镉卸竞ψ饔玫奈镔|(zhì)，造成測(cè)定結(jié)果的誤差。 當(dāng)樣品無(wú)法直接培養(yǎng)測(cè)定時(shí)，可接種或稀釋后測(cè)定。接種液的作用是向樣品中提供合適的微生物以分解有機(jī)物，稀釋水的作用是提供微生物生存需要的氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素以及足夠的溶解氧，保障其新陳代謝的正常。這其中使用的接種液和接種稀釋液的配制及其質(zhì)量是影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。 稀釋水要控制水溫在(201)，曝氣1小時(shí)，使其溶解氧達(dá)到8mg/L以上。使用前每升水中加入鹽溶液混勻，20保存。在曝氣的過(guò)程中防止污染，特別是防

13、止帶入有機(jī)物、金屬、氧化物或還原物。研究發(fā)現(xiàn)稀釋水的原水選用很關(guān)鍵，離子交換水易受到樹(shù)脂床的污染，不宜采用，而一般蒸餾水作為BOD稀釋水源，其空白值可達(dá)到規(guī)定要求。稀釋水中氧的濃度不能過(guò)飽和，使用前需開(kāi)口放置1小時(shí)，且應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)使用。剩余的稀釋水應(yīng)棄去。 接種液配制的關(guān)鍵在于根據(jù)實(shí)際水樣選取能適應(yīng)該水樣的微生物。一般可購(gòu)買(mǎi)接種微生物用的接種物質(zhì)配制，也可選用未受工業(yè)廢水污染的生活污水、含有城鎮(zhèn)污水的河水或湖水、污水處理廠的出水等。分析含有難降解物質(zhì)的工業(yè)廢水時(shí)，可在其排污口下游適當(dāng)處取水樣作為廢水的馴化接種液。 而接種稀釋水則根據(jù)接種液的來(lái)源不同，每升稀釋水中加入適量接種液：城市生活污水和

14、污水處理廠出水加110 ml，河水或湖水加10100 ml，且需存放在（201）的環(huán)境中，現(xiàn)配現(xiàn)用。 測(cè)定樣品的同時(shí)，需使用葡萄糖-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液檢查接種液、稀釋水的質(zhì)量，其測(cè)定結(jié)果BOD5應(yīng)在180 mg/L230 mg/L之內(nèi)。且需檢查空白試樣的BOD5，稀釋水測(cè)定結(jié)果不能超過(guò)0.5mg/L，接種液測(cè)定結(jié)果不能超過(guò)1.5mg/L，否則應(yīng)檢查可能的污染來(lái)源。 樣品的稀釋倍數(shù)也是影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。稀釋過(guò)低則沒(méi)有足夠的溶解氧供微生物消耗，稀釋過(guò)高則樣品中微生物生存環(huán)境改變太大，失去重復(fù)性和顯著性，測(cè)定值不真實(shí)。合適的稀釋程度需使培養(yǎng)過(guò)程中耗氧量不小于2mg/L，培養(yǎng)后樣品中剩余溶解氧不

15、小于2mg/L，且剩余的溶解氧為開(kāi)始濃度的1/32/3為最佳。 BOD5實(shí)際測(cè)定過(guò)程中，常會(huì)遇到多種狀況，排除各種干擾因素，才能測(cè)出更為真實(shí)的BOD5值。而稀釋倍數(shù)的選取，一直是此實(shí)驗(yàn)操作的難點(diǎn)所在，且直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)成敗與否。 由于特定樣品的總有機(jī)碳（TOC）、高錳酸鹽指數(shù)（IMn）、化學(xué)需氧量（CODCr）、生化需氧量（BOD5）之間存在一定的比例關(guān)系，可以通過(guò)測(cè)定其他有機(jī)物污染指標(biāo)含量，間接估計(jì)BOD5值，再根據(jù)此期望值以及水樣的類(lèi)型等特性，確定樣品的稀釋倍數(shù)。但對(duì)于不同的樣品，其中各種有機(jī)物的含量不一樣，則各有機(jī)物污染指標(biāo)之間的比例關(guān)系不同，難以根據(jù)某一比例關(guān)系估計(jì)BOD5期望值。 根據(jù)

16、實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，一般情況下溶解氧含量足夠的清潔地表水BOD5值較低，可不經(jīng)稀釋直接測(cè)定，而受污染的地表水，需根據(jù)其污染物種類(lèi)與含量的不同，具體分析其稀釋倍數(shù)。 稀釋倍數(shù)的合理選取一直是從業(yè)人員的研究?jī)?nèi)容之一，國(guó)內(nèi)外就其確定方法進(jìn)行了大量的探索研究，并提出不同的經(jīng)驗(yàn)公式。 有關(guān)稀釋倍數(shù)的選擇方法主要有以下幾種：一是以高錳酸鹽指數(shù)（IMn）除以3、4、5得稀釋倍數(shù)，由于高錳酸鉀的氧化率低，對(duì)有些有機(jī)物不能完全氧化或不能氧化，因而，該法適用范圍上頗受限制，只適用于污染較輕的廢水和地面水等；二是以回歸法確定稀釋倍數(shù)，由于水質(zhì)變化復(fù)雜，故其相關(guān)性也在變化，因此所用的回歸方程也應(yīng)經(jīng)常校正，而且對(duì)于每一種不同的水

17、樣，其所用的回歸方程也不同，因此這種方法的適用局限性更大，不具有推廣價(jià)值；三是以化學(xué)需氧量（CODCr）值乘以系數(shù)0.075,0.15,0.225作為三個(gè)稀釋倍數(shù)，該法適用于工業(yè)廢水，也有一定的局限性。 當(dāng)不能準(zhǔn)確的選擇稀釋倍數(shù)時(shí)，可以多取幾個(gè)不同稀釋倍數(shù)培養(yǎng)，選擇最合適的作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果都符合稀釋與接種法標(biāo)準(zhǔn)HJ/T505-2009中的規(guī)定要求，則可以取其平均值。但在實(shí)際操作中，同一樣品幾個(gè)不同稀釋倍數(shù)測(cè)定的結(jié)果有時(shí)會(huì)出現(xiàn)稀釋倍數(shù)較大的耗氧量反而多的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種情況有可能是試樣中有微生物毒性物質(zhì)，此時(shí)選擇與稀釋倍數(shù)無(wú)關(guān)的結(jié)果，并取其平均值。 試樣測(cè)定結(jié)果與稀釋倍數(shù)的關(guān)系確定如下：一個(gè)試樣

18、要做2個(gè)以上不同的稀釋倍數(shù)，每個(gè)試樣每個(gè)稀釋倍數(shù)做平行雙樣同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中每瓶試樣氧的消耗量，并畫(huà)出氧消耗量對(duì)每一稀釋倍數(shù)試樣中原樣品的體積曲線(xiàn)。若此曲線(xiàn)呈線(xiàn)性，則此試樣中不含有任何抑制微生物的物質(zhì)，即樣品的測(cè)定結(jié)果與稀釋倍數(shù)無(wú)關(guān)；若曲線(xiàn)僅在低濃度范圍內(nèi)呈線(xiàn)性，取線(xiàn)性范圍內(nèi)稀釋比的試樣測(cè)定結(jié)果計(jì)算平均BOD5值。 由稀釋倍數(shù)造成較大誤差的出現(xiàn)也與微生物的生長(zhǎng)情況密切相關(guān)。稀釋倍數(shù)大，水體中溶解氧就高，微生物繁殖的空間就大。因?yàn)閷?duì)微生物而言，如果各方面條件滿(mǎn)足，它將以幾何速度繁殖。據(jù)有關(guān)資料表明，大腸桿菌每一代的平均繁殖時(shí)間為17min，5d培養(yǎng)期間，大腸桿菌可以繁殖400多代，當(dāng)天

19、1個(gè)菌落第5d可以繁殖成2個(gè)菌落，因此，即使當(dāng)天的微生物群落數(shù)有很大差異，經(jīng)過(guò)5天繁殖，到第5天，水體中的微生物總數(shù)就趨于相近。稀釋倍數(shù)不同，導(dǎo)致微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化，稀釋倍數(shù)越高，水體中生態(tài)結(jié)構(gòu)改變?cè)酱螅⑸锷婵臻g越大，測(cè)定值偏離真值越大。研究發(fā)現(xiàn)用“半數(shù)倍”代替“整數(shù)倍”，盡量減少稀釋倍數(shù)，據(jù)此思路測(cè)得的BOD5值較為理想。修訂的主要內(nèi)容有： 增加了檢出限； 方法原理部分明確規(guī)定培養(yǎng)溫度和時(shí)間，增加（2+5）天培養(yǎng)時(shí)間的內(nèi)容； 增加了接種液的選擇； 增加了樣品前處理方法內(nèi)容； 增加了稀釋接種法稀釋倍數(shù)的確定方法內(nèi)容； 細(xì)化了五日生化需氧量的測(cè)定方法； 增加了質(zhì)量保證和質(zhì)量控制章節(jié)。 新方法的檢出限為0.5mg/L，方法的測(cè)定下限為2mg/L，非稀釋法和非稀釋接種法的測(cè)定上限為6mg/L，稀釋與稀釋接種法的測(cè)定上限為6000mg/L。培養(yǎng)前溶解氧C1培養(yǎng)后溶解氧C2C1-C2BOD5HJ535-2009大于等于2(1/3)C1C2(2/3)C1260.56000BG/T7488-198