第二章基因工程的載體和工具酶

1、第二章第二章 基因工程的載體基因工程的載體和工具酶和工具酶第一節(jié)第一節(jié) 載體載體引引 言言 基因克隆的本質(zhì)基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到是使目的基因在特定的條件下得到擴增和表達擴增和表達，而目的基因本身無法進行復(fù)制和表，而目的基因本身無法進行復(fù)制和表達、不易進入受體細胞、不能穩(wěn)定維持，所以就達、不易進入受體細胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于必須借助于“載體載體”及其及其“寄主細胞寄主細胞”來實現(xiàn)。來實現(xiàn)。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：作為基因克隆的載體必須具備以下特性：載體必須是復(fù)制子。載體必須是復(fù)制子。具有合適的篩選標記，便于重組子的篩選。具有合適的篩選標記，便于重組子

2、的篩選。具備多克隆位點（具備多克隆位點（MCS），便于外源基因插入。），便于外源基因插入。自身分子量較小，拷貝數(shù)高。自身分子量較小，拷貝數(shù)高。在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定性高。在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定性高。Characteristics of vectors for gene Characteristics of vectors for gene cloningcloningMCSMarkerForeign gene一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體（plasimid vectors）（一）質(zhì)粒載體的生物學特性一）質(zhì)粒載體的生物學特性（二）質(zhì)粒載體的制備二）質(zhì)粒載體的制備 （三）質(zhì)粒載體的三）質(zhì)粒載體的改造改造（一）質(zhì)粒

3、的生物學特性（一）質(zhì)粒的生物學特性（1）質(zhì)粒質(zhì)粒是是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的雙鏈環(huán)狀的雙鏈環(huán)狀( (少數(shù)為線形和少數(shù)為線形和RNARNA） DNADNA分子。分子。廣泛從在于細菌細胞廣泛從在于細菌細胞中，比病毒更簡單。中，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細菌的質(zhì)粒研究得對細菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。腸桿菌的質(zhì)粒。大腸桿大腸桿菌的質(zhì)粒主要有菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（質(zhì)粒（F因子）、因子）、R質(zhì)粒（抗藥性質(zhì)粒（抗藥性因子）和因子

4、）和Col質(zhì)粒（大腸質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）三種。桿菌素因子）三種。（一）質(zhì)粒的生物學特性（一）質(zhì)粒的生物學特性（2）質(zhì)粒的大小質(zhì)粒的大小差異很大差異很大，最小的只有，最小的只有1kb,1kb,只只能編碼中等大小的能編碼中等大小的2-32-3種蛋白質(zhì)分子，最大的種蛋白質(zhì)分子，最大的達到達到200kb200kb。（3）質(zhì)粒的生存質(zhì)粒的生存在寄主細胞中在寄主細胞中“友好友好”地地“借借居居”，離開了寄主它本身無法復(fù)制；同時質(zhì)，離開了寄主它本身無法復(fù)制；同時質(zhì)粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復(fù)制起粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復(fù)制起點不一定能在其它生物細胞中繁殖。點不一定能在其它生物細胞中繁殖。（一

5、）質(zhì)粒的生物學特性（一）質(zhì)粒的生物學特性（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細胞中存一種質(zhì)粒在宿主細胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：兩種復(fù)制型：“嚴緊型嚴緊型”質(zhì)粒質(zhì)粒（stigentstigent plasmid plasmid）, ,拷貝數(shù)為拷貝數(shù)為1-31-3；“松弛型松弛型”質(zhì)粒質(zhì)粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）, ,拷貝數(shù)為拷貝數(shù)為10-6010-60。不過即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不。不過即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細胞間和不同的生長環(huán)境也可能有很大的

6、變同的寄主細胞間和不同的生長環(huán)境也可能有很大的變化?；＃?）質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒的不親和性 兩種親緣關(guān)系密切的不同兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存。載體質(zhì)粒與受質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存。載體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。（一）質(zhì)粒的生物學特性（一）質(zhì)粒的生物學特性 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移移 接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒分子量大分子量大嚴緊型復(fù)制嚴緊型復(fù)制 非接合型質(zhì)非接合型質(zhì)粒粒分子量小分子量小松弛型復(fù)制松弛型復(fù)制 是否含有接是否含有接合轉(zhuǎn)移基因合轉(zhuǎn)移基因 非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含tra基因；可以為轉(zhuǎn)基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)

7、移。移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有tra基因；能通過結(jié)合基因；能通過結(jié)合作用從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。作用從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：（一）質(zhì)粒的生物學特性（一）質(zhì)粒的生物學特性（7）質(zhì)粒的存在形式質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價閉合雙螺旋共價閉合環(huán)（環(huán)（SC構(gòu)型）構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）構(gòu)型）線狀雙螺旋線狀雙螺旋（L構(gòu)型）構(gòu)型）（

8、二）質(zhì)粒DNA的制備 有多種分離質(zhì)粒的方法，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過濾法等。 目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒DNA。這個方法主要包括培養(yǎng)收集細菌菌體，裂解細胞，將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開及除去蛋白質(zhì)和RNA。堿變性法質(zhì)粒提取的原理：堿變性法質(zhì)粒提取的原理： 根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA與線性染色體與線性染色體DNADNA片斷之間，在拓撲學上的差異而發(fā)展出來片斷之間，在拓撲學上的差異而發(fā)展出來的。的。 在在pHpH值值12.012.012.512.5范圍內(nèi)時，線性的范圍內(nèi)時，線性的DNADNA會會被變性而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒被變性而共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA卻卻不

9、會被變性。不會被變性。 通過冷卻或恢復(fù)中性通過冷卻或恢復(fù)中性pHpH值使之復(fù)性，線性染值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNAcccDNA可以準確迅速可以準確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒粒DNADNA。堿變性法提取質(zhì)粒的步驟：堿變性法提取質(zhì)粒的步驟：1 1、取、取1.51.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細胞沉淀；微量離心管中，離心收集細胞沉淀；2 2、加入、加

10、入100100微升冰冷的溶微升冰冷的溶液液I I，（，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA PH=8.0, 10mM EDTA）渦旋震）渦旋震蕩懸浮菌液。蕩懸浮菌液。3 3、加入、加入200200微升新配制的溶液微升新配制的溶液II II，（，（0.2M NaOH0.2M NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）緩緩緩緩混勻置室溫混勻置室溫5 5分鐘。分鐘。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的溶液毫升冰冷的溶液IIIIII，（醋酸鉀，（醋酸鉀29.429.4克，克，冰乙酸冰乙酸11.511.5毫升，加蒸

11、餾水至毫升，加蒸餾水至100100毫升）顛倒離心毫升）顛倒離心管管1010次后，冰浴次后，冰浴5 5分鐘。分鐘。5 5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒集質(zhì)粒DNADNA。（三）質(zhì)粒載體的改造（三）質(zhì)粒載體的改造去掉不必要的去掉不必要的DNADNA區(qū)段。區(qū)段。減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的限制性酶切位點）。（單一的限制性酶切位點）。加入易于撿出的選擇性標記基因。加入易于撿出的選擇性標記基因。對質(zhì)粒進行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便對質(zhì)粒進行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便 轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。改

12、造或增加基因表達的調(diào)控序列。改造或增加基因表達的調(diào)控序列。1 1、質(zhì)粒、質(zhì)粒pBR322 pBR3224363結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：（1 1）氨芐青霉素抗性基因）氨芐青霉素抗性基因（ampampr r或或ApApr r） 3 3種限制酶單一識別位點種限制酶單一識別位點 。（2 2）四環(huán)素抗性基因）四環(huán)素抗性基因（tetr或或Tcr）內(nèi)部有內(nèi)部有7 7種，啟動區(qū)內(nèi)有種，啟動區(qū)內(nèi)有2 2種限制種限制酶單一識別位點酶單一識別位點 。（3）DNA復(fù)制起點（復(fù)制起點（ori）pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點：質(zhì)粒的優(yōu)點：（1 1）具有較小的分子量。）具有較小的分子量。 4363bp4363bp，2.62.610106 6D

13、aDa，（2 2）具有兩種抗菌素抗性）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。號。 （3 3）具較高的拷貝數(shù)，而）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后且經(jīng)過氯霉素擴增之后, ,每每個細胞中可累積個細胞中可累積1000100030003000個拷貝。個拷貝。（4 4）對多種常見的限制性）對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個能切內(nèi)切核酸酶只含有一個能切割的位點。割的位點。 pBR3224363外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端連接酶連接酶重組子重組子(ampstetr) 空載體空載體(amprtetr

14、) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (ampstets) 導(dǎo)入導(dǎo)入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重組子轉(zhuǎn)化子重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr) 空載體空載體轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空載體空載體轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(amprtetr)因插入外源因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)對比兩個平板上的菌落，凡在對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是平板上不能生長的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒

15、轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。2、pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采采用用MCS技術(shù)在技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)基礎(chǔ)上構(gòu)建的建的結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：（1）來自于）來自于pBR322的的Ori（2）氨芐青霉素的抗性基因）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化但核苷酸序列發(fā)生了變化（3） LacZ基因基因 編碼編碼半乳糖酶的半乳糖酶的肽鏈即氨基末肽鏈即氨基末端。端。（4）MCS區(qū)段區(qū)段是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)

16、切酶位點在整連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點在整個載體中是唯一的。個載體中是唯一的。2、pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體與與pBR322相比，相比， pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點：質(zhì)粒載體優(yōu)點：（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 如如pUC8為為2 750bp，pUCl8為為2 686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個細胞即可達基因的缺失，平均每個細胞即可達500700個拷貝個拷貝（2）適用于組織化學法檢測重組體）適用于組織化學法檢測重組體通過通過 -互補互補作用，利用菌落顏色篩選重組子作用，利用菌落顏色篩選重組子。（3）具有多克隆位點區(qū)段

17、（）具有多克隆位點區(qū)段（MCS）可以定向克隆防止載體自我連接?？梢远ㄏ蚩寺》乐馆d體自我連接。 -互補互補 (alpha-complementation) 大腸桿菌大腸桿菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作相互作用并且釋放出一種藍色物質(zhì)，當該酶的用并且釋放出一種藍色物質(zhì)，當該酶的 -片段片段和和 -片片段段分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株

18、系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的編碼產(chǎn)生該酶的 片段片段。這樣一來，含有功能性完整。這樣一來，含有功能性完整的的LacZ 基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細胞中時，載體編基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細胞中時，載體編碼的碼的 -片段片段就能和寄主編碼的就能和寄主編碼的 片段片段發(fā)生互補并具有發(fā)生互補并具有了對底物了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是象被成為是 alpha-complementation.X-Gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 釋放出的藍色物質(zhì)可以釋放出的藍色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍色，將整個菌落染成藍色，非 常

19、容 易 辨 別 ， 如 果非 常 容 易 辨 別 ， 如 果 LacZ插入外源基因被破插入外源基因被破壞，菌落則是無色的壞，菌落則是無色的 。組織化學法檢測重組體組織化學法檢測重組體X-Gal -半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物異丙基異丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛藍靛藍二、二、 噬菌體載體噬菌體載體（phage vectors）（一）一） 噬菌體載體噬菌體載體（二）二） M13噬菌體載體噬菌體載體（三）柯斯質(zhì)粒載體（三）柯斯質(zhì)粒載體1. 噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性溶菌周期溶菌周期指噬菌體將指噬菌體將DNADNA注入寄主細胞后很快環(huán)化

20、，然后注入寄主細胞后很快環(huán)化，然后進行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，進行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。溶源周期溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體中，注入寄主細胞的噬菌體DNADNA是整合到寄主細是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復(fù)制。胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復(fù)制。整合了一套完整的噬菌體基因組的細菌被稱為整合了一套完整的噬菌體基因組的細菌被稱為溶源性細溶源性細菌菌。在溶源性細菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體。在溶源性細菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體D

21、NADNA被被稱為稱為原噬菌體原噬菌體。噬菌體噬菌體溫和噬菌體，具有溶源生長周期和溶菌生長周期溫和噬菌體，具有溶源生長周期和溶菌生長周期烈性噬菌體烈性噬菌體, ,只具有溶菌生長周期只具有溶菌生長周期1. 噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性2. 噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性2. 噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性 組成：組成：蛋白質(zhì)外殼和蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈線狀雙鏈DNADNA分子組成。分子組成。 DNA長度為長度為48502bp48502bp，在分子兩端各有，在分子兩端各有1212個堿基的單個堿基的單鏈互補粘性末端鏈互補粘性末端。當其注入到寄主細胞中后，可以迅速。當其注入到寄主細胞

22、中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNADNA分分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為coscos位位點點（cohesive end sitecohesive end site）. .GGGCGGCGACCT2. 噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性是一個溫和噬菌體是一個溫和噬菌體一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。復(fù)制復(fù)制溶源周期隨溶源細菌染色體一起復(fù)制溶源周期隨溶源細菌染色體一起復(fù)制溶菌周期的早期是溶菌周

23、期的早期是“”復(fù)制，晚期進行滾環(huán)復(fù)制復(fù)制，晚期進行滾環(huán)復(fù)制基因組成基因組成 DNADNA至少包括至少包括6161個基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中個基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約1 13 3為非必須為非必須區(qū)段。區(qū)段。噬菌體載噬菌體載體類型體類型置換型置換型 （Replacement vectors）這種載體具有兩個對應(yīng)的酶切克隆位點，這種載體具有兩個對應(yīng)的酶切克隆位點，在兩個位點之間的在兩個位點之間的DNA區(qū)段是區(qū)段是噬菌體噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的的非必需序列，可以被外源插入

24、的DNA取代。取代。如如Charon 4 載體克隆能力大，克隆能力大，2025kb插入型插入型 （Insertion vectors ）這種載體僅僅有一個可供外源這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點。插入的克隆位點。如：如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb 噬菌體載體的噬菌體載體的類型類型 Insertion vectorsReplacement vectors 置換型載體（二）（二）M13噬菌體噬菌體 1 1、絲狀噬菌體、絲狀噬菌體M13噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性是單鏈閉合環(huán)狀噬菌體是單鏈閉合環(huán)狀噬菌體只能感染雄性細菌，只能感染雄性細菌，外

25、形成絲狀，基因組外形成絲狀，基因組DNA長約長約6.4kb，含，含9個編碼個編碼10種蛋白質(zhì)的重疊基因，基因種蛋白質(zhì)的重疊基因，基因-可分為可分為10個區(qū)和個區(qū)和基因基因、之間有之間有507 bp基因間隔區(qū)基因間隔區(qū)（IS區(qū)）區(qū)），該區(qū)可以接受外源該區(qū)可以接受外源DNADNA的插入而不會影響到的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNADNA載體的重載體的重要前提。要前提。復(fù)制與增殖（圖）復(fù)制與增殖（圖）M13噬菌體的復(fù)制與增殖噬菌體的復(fù)制與增殖“”DNACPCP脫落，脫落，“”DNA復(fù)制復(fù)制RFDNA“”型復(fù)制型復(fù)制積累積累200300份份

26、滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制SSB外溢時被包裝外溢時被包裝M13噬菌體噬菌體基因基因2. M13噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體載體的構(gòu)建這類載體的這類載體的突出優(yōu)點突出優(yōu)點在于其既在于其既可以提供單鏈可以提供單鏈DNADNA，也可以提，也可以提供雙鏈的供雙鏈的DNADNA。其。其最大的不足最大的不足在于在于插入大的插入大的DNADNA片段片段后表現(xiàn)后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過程不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過程中容易發(fā)生缺失。所以中容易發(fā)生缺失。所以一般一般克隆的片段在克隆的片段在1kb1kb之內(nèi)之內(nèi)，克，克隆隆300-400bp300-400bp的片段十分穩(wěn)的片段十分穩(wěn)定。定。 在在ISIS區(qū)內(nèi)插入?yún)^(qū)內(nèi)插入LacLacZ

27、 Z基因基因 在標記基因區(qū)內(nèi)組裝在標記基因區(qū)內(nèi)組裝MCSMCS區(qū)段區(qū)段所以能通過所以能通過 互補在互補在X-Gal/ IPTGX-Gal/ IPTG平板上平板上識別重組體。這類載體包識別重組體。這類載體包括了括了 M13mp8M13mp8、9 9 和和 M13mp18 M13mp18 、 1919等。等。（三）柯斯質(zhì)粒載體（三）柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的特點柯斯質(zhì)粒載體的特點 柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有 DNA的的cos序序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid是是cos site ca

28、rrying plasmid的縮寫。的縮寫?？滤官|(zhì)粒的大小為柯斯質(zhì)粒的大小為4-6kb，由由3部分組成：部分組成： A.多克隆位點區(qū)多克隆位點區(qū) B. 含有含有cos位點的位點的 DNA區(qū)區(qū) C. 復(fù)制起始位點和抗性標記區(qū)復(fù)制起始位點和抗性標記區(qū)pHC79OriMarkerMCScos DNA（三）（三） 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的特性柯斯質(zhì)粒載體的特性1 1、具有、具有 噬菌體的特性噬菌體的特性 柯斯質(zhì)粒連接上適宜長度的外柯斯質(zhì)粒連接上適宜長度的外源源DNADNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效

29、轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細胞。進入寄主細胞的細胞。進入寄主細胞的DNADNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會形成也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2 2、具有質(zhì)粒載體的特性、具有質(zhì)粒載體的特性 能象質(zhì)粒一樣在寄主細胞內(nèi)復(fù)能象質(zhì)粒一樣在寄主細胞內(nèi)復(fù)制，且?guī)в锌剐赃x擇標記基因，有些還帶有插入失活型的多制，且?guī)в锌剐赃x擇標記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點，為重組體的篩選提供了方便。克隆位點，為重組體的篩選提供了方便。3 3、高容量的克隆能力、高容量的克隆能力 coscos質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起點、選擇標記和點、選擇標記和co

30、scos位點等構(gòu)成，所以其克隆上限可達位點等構(gòu)成，所以其克隆上限可達45kb45kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達到左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達到30kb30kb。（三）（三） 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用 噬菌體的位點特異切割體系噬菌體的位點特異切割體系末端酶（末端酶（terminase）體系，識別兩個相）體系，識別兩個相距距38-54kb cos位點，并進行切割，后被包裝。位點，并進行切割，后被包裝。 下面的操作中缺點是：下面的操作中缺點是：cosmid自我重組、外源自我重組、外源DNA片段串聯(lián)

31、片段串聯(lián) 后重組。后重組。OriMarkerMCScos DNA質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒單鏈噬菌體單鏈噬菌體克隆克隆DNA大片段大片段*+-構(gòu)建基因組文庫構(gòu)建基因組文庫-+-構(gòu)建構(gòu)建DNA文庫文庫+-常規(guī)的亞克隆化常規(guī)的亞克隆化+-構(gòu)建新型的構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)+-序列分析序列分析+-+單鏈探針單鏈探針+*-+外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中的表達+-四種常用載體的比較* * 外源外源DNADNA如超過如超過10kb10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * * 已有個別材料可用于此目的已有個別材料可用于此目的第

32、二節(jié)第二節(jié) 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一、一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二、二、 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用三、三、 DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用四、四、 修飾性工具酶修飾性工具酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（四）四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一、一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用由寄主控制的由寄主控制

33、的限制限制和和修飾修飾現(xiàn)象現(xiàn)象-20世紀世紀60年代，年代，Linn和和Arber 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) (B) (K)大腸桿菌大腸桿菌B大腸桿菌大腸桿菌K11410 410 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of plating外源外源DNA自身自身DNA（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：切酶切酶。 E. E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 當當(k)(k)噬菌體侵染噬菌體侵染E. E.colicoliB B時，由于時，由于其其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特異識別的堿基核酸酶特異識

34、別的堿基序列，被降解掉。而序列，被降解掉。而E. E.colicoliB B的的DNADNA中雖中雖然也存在這種特異序列，但可在然也存在這種特異序列，但可在EcoBEcoB甲甲基化酶的作用下，催化基化酶的作用下，催化S- S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。的特定堿基，使之甲基化。 EcoBEcoB核酸酶核酸酶不能識別已甲基化的序列。不能識別已甲基化的序列。限制限制修飾的酶學系統(tǒng)修飾的酶學系統(tǒng) (B) (B)酶切位點酶切位點不被修飾不被修飾噬菌體噬菌體DNA被切割被切割酶切位點酶切位點被修飾被修飾基因組基因組

35、DNA不被切割不被切割最早分離出的限制內(nèi)切酶最早分離出的限制內(nèi)切酶1968年，年，Meselson和和Yuan，大腸桿菌大腸桿菌B和和K菌株，菌株，EcoB和和EcoK， 是是I型的，沒有實用價值。型的，沒有實用價值。首個首個II型限制內(nèi)切酶型限制內(nèi)切酶1970年，年，H.O.Smith等從等從Heamophilus influenzae的的Rd菌株中菌株中Hind II 。使使得得DNADNA分子的體外精確切割成為可能。分子的體外精確切割成為可能。從此，相關(guān)研究展開。如從此，相關(guān)研究展開。如NEB公司的提取和克公司的提取和克隆。目前隆。目前已純化出已純化出3000種限制性內(nèi)切酶中種限制性內(nèi)切

36、酶中，其其中有中有30%是在是在NEB發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)的 。限制性核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease ）：是一類能夠識別雙鏈）：是一類能夠識別雙鏈DNADNA分分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNADNA雙雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是3 3，5 5磷酸二磷酸二酯鍵。酯鍵。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性 特性特性1. 限制修飾活性限制修飾活性2. 內(nèi)切酶的蛋白內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)結(jié)構(gòu)3.

37、限制輔助因子限制輔助因子4. 切割位點切割位點5. 特異性切割特異性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型雙功能的酶雙功能的酶3種不同亞基種不同亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特異性位點距特異性位點5端至少端至少1000bp不是（隨機）不是（隨機）無用無用 II 型型限制酶和修飾酶分開限制酶和修飾酶分開單一成分單一成分 Mg2+位于識別位點上位于識別位點上 是是非常有用非常有用 III 型型雙功能酶雙功能酶2種亞基種亞基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸特異性位點特異性位點3端端24-26bp處處是是用處不大用處不大（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（三）限制性

38、核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為表示為Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為表示為 Hin；2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標出，比如用羅馬數(shù)字標出，比如Ec

39、o R I、 Hind III。（四）（四）IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點1、識別位點的特異性、識別位點的特異性 每種酶都有其特定的每種酶都有其特定的DNA識別識別 位點，通常是由位點，通常是由48個核苷酸組成的特定序列（靶個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。序列）。2、識別序列的對稱性、識別序列的對稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱 的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點的規(guī)范性、切割位點的規(guī)范性 交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子

40、）。分子）。幾種幾種IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 與與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念粘性末端粘性末端 cohesive ends是指是指DNA分子在限制酶的作用之下形成分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。的配對而重新環(huán)化起來。平平 末末 端端 Blunt endBlunt en

41、d在識別序列對稱處同時切開在識別序列對稱處同時切開DNADNA分子兩條鏈，分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。 同裂酶同裂酶 isoschizomersisoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。不同來源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。同尾酶同尾酶 isocaudamersisocaudamers 識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如

42、BamH I 、BclI、BglII和和Xho I 是一組同尾酶。是一組同尾酶。注注 意：意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。該兩種酶的任一種所識別。 平齊末端帶帶5P端的黏性末端端的黏性末端帶帶3OH 和和5P端的平末端端的平末端例如例如Hpa和和Msp是同裂酶，識別順序都是是同裂酶，識別順序都是5C|CGG33GGC|C5如果其中有如果其中有5-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，Hpa不能夠切割，不能夠切

43、割，MspI能切割。能切割。 經(jīng)同尾酶消化的經(jīng)同尾酶消化的DNADNA末端連接示意圖末端連接示意圖5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCT

44、AGGXXXXXX 5BamH IBgl II 一個限制酶單位一個限制酶單位（U）指：指：在理想的反應(yīng)條件（適在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37）下，）下，1h內(nèi)內(nèi)中完中完全降解全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：影響酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的純度的純度 DNA的甲基化程度的甲基化程度酶切反應(yīng)的溫度（通常為酶切反應(yīng)的溫度（通常為37 ）DNADNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 在在“非最適的非最適的”反應(yīng)條件下反應(yīng)條件下, ,有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的

45、特有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的特異性便會發(fā)生異性便會發(fā)生“松動松動”，從其，從其“正確正確”識別序列以外的其它位點識別序列以外的其它位點切割切割DNADNA分子，這種現(xiàn)象分子，這種現(xiàn)象叫星號活性叫星號活性。用。用* *表示。表示。 （五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)酶酶 切切 反反 應(yīng)應(yīng) 的的 基基 本本 步步 驟驟電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液CKMBuffer (10X) 2.0 LddH2O 約約16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT（一）一）DNA連接

46、酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn)（二）二） DNA連接酶作用特點連接酶作用特點（三）三） DNA連接酶的反應(yīng)條件連接酶的反應(yīng)條件（四）四）DNA連接的策略連接的策略二、二、 DNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用（一）（一）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn)環(huán)形環(huán)形DNADNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學家相信一定有一種能連接這種分子的發(fā)現(xiàn)使科學家相信一定有一種能連接這種 切口的酶存在。切口的酶存在。 首個首個DNADNA連接酶連接酶(ligase(ligase) )19671967年，年，大腸桿菌大腸桿菌DNA連連接酶接酶，是大腸桿菌基因編碼是大腸桿菌基因編碼 。1970年，發(fā)現(xiàn)了年，發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶連接酶 ， 由大

47、腸桿菌由大腸桿菌T4噬菌體噬菌體基因編碼的?；蚓幋a的。（二）（二）DNA連接酶作用的特點連接酶作用的特點A.A. 連接的連接的兩條鏈兩條鏈必須分別具有自由必須分別具有自由33OHOH和和55P P，而且這兩個基團彼此，而且這兩個基團彼此相鄰相鄰；B. B. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。能過程。E.coli DNA連接酶連接酶 連接具互補堿基黏性末端連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），最初研究表明），現(xiàn)在研究可連接平末端；需現(xiàn)在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。輔助因子，活性低，不常用。T4DNA連接酶連接酶連

48、接具互補堿基黏性末端和平末端，連接具互補堿基黏性末端和平末端，需需ATP輔助因子，活性高，常用。輔助因子，活性高，常用。 是兩條鏈是兩條鏈因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。環(huán)化起來。 OH P 是相鄰的是相鄰的因此不能封閉因此不能封閉gap，只能封閉，只能封閉nick.gap NONick OKDNA 連接酶連接的作用機制連接酶連接的作用機制 E(E(酶酶) )ATPEATPEAMPAMPppippi E(E(酶酶) )NADENADEAMPAMPNMNNMN E EAMPAMP DNADNADNADNAAMPAMPE EDNADNA上的上的33OH

49、OH對被活化的對被活化的磷原子進行親核攻擊，形成磷原子進行親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，同時釋放出磷酸二酯鍵，同時釋放出AMPAMP。 （三）（三）T4DNA連接酶連接反應(yīng)的條件連接酶連接反應(yīng)的條件影響連接效率的因素有：影響連接效率的因素有：A. A. 溫度（通常在溫度（通常在4-15 4-15 ）B. ATPB. ATP的濃度的濃度(10ML - 1ML )C. C. 連接酶濃度（連接酶濃度（一般平末端大約需一般平末端大約需1 12U2U，黏性末端，黏性末端僅需僅需0.1U0.1U）D. D. 反應(yīng)時間（通常連接過夜）反應(yīng)時間（通常連接過夜）E. E. 插入片段和載體片段的摩爾比（插入片段和載體

50、片段的摩爾比（ 1 1 1 15 5 1 1） （四）（四）T4 DNA連接酶對目的連接酶對目的DNA片段片段和載體連接的一般方案和載體連接的一般方案1連接反應(yīng)一般在滅菌的連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。離心管中進行。210l體積反應(yīng)體系中：取載體體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定，加入一定比例的外源比例的外源DNA 分子（一般線性載體分子（一般線性載體DNA分子與外源分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為分子摩爾數(shù)為1 15 1），補足），補足ddH2O 至至8l。3輕輕混勻，稍加離心，輕輕混勻，稍加離心，56水浴水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。冰浴。4加入含加入含

51、ATP的的10Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適連接酶合適單位，單位， 用用ddH2O 補至補至10l，稍加離心，在適當溫度，稍加離心，在適當溫度（一般（一般14-16）連接）連接8-14hr。粘性末端粘性末端DNA片段的連接片段的連接DNA連接酶連接法連接酶連接法NickNick平末端平末端DNA片段的連接末端同聚物加尾法片段的連接末端同聚物加尾法33553355末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA連接酶連接酶平末端平末端DNA片段的連接銜接物連接法片段的連接銜接物連接法 銜接物銜接物(

52、linker)(linker)，也叫接頭，也叫接頭，是有人工化學合成的一段是有人工化學合成的一段10-10-1212個核苷酸組成，具有有個核苷酸組成，具有有1 1個或幾個限制性酶切位點的平末端的個或幾個限制性酶切位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙鏈寡核苷酸短片段。GGATCCCCTAGG+BamHI切割切割GATCCG連接酶經(jīng)連接酶經(jīng)BamHI切割的切割的pBR322GCCTAGBamHI銜接物銜接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG連接酶連接酶重組重組DNA分子分子GATCCGGCCTAG（一）大腸桿菌一）大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I（二）二）Klenow片段片段酶

53、酶（三）三）T4 DNA聚合酶聚合酶（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）三、三、DNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用 （一）（一） 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I （E。Coli DNA pol I） 是是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3 3種不同的酶活力：種不同的酶活力：A. 5- 3聚合酶活性聚合酶活性 （模板，（模板， 帶帶3OH游離基團的引物、游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）B. 雙鏈特異性的雙鏈特異性的53核酸外切酶活

54、性核酸外切酶活性C. 35核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。從游離的雙鏈或單鏈從游離的雙鏈或單鏈DNA的的3端降解。不過對于雙鏈的降解可被端降解。不過對于雙鏈的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。的多聚活性所抑制。主要是校正作用。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ 4dNTPsATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+ 4dNTPsCCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+ T 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 的三種用途

55、的三種用途A. 利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的DNA探針探針 利用其利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。的外切酶活性及其聚合酶活性。B. 用于用于DNA連接前的大缺口填充連接前的大缺口填充 利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。C. 用于用于DNA的序列分析的序列分析 利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。 大腸桿菌聚合酶大腸桿菌聚合酶I的應(yīng)用示例的應(yīng)用示例缺口轉(zhuǎn)移制備探針缺口轉(zhuǎn)移制備探針Pol I + Mg2+32P dNTPs （二）（二） Klenow片段酶片段酶KlenowKlenow片段片段是大腸桿菌聚合酶是大腸桿菌聚合酶 I I 全酶經(jīng)枯草桿菌

56、蛋全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為76KD 76KD 。酶催活性：酶催活性：5 3 5 3 的聚合酶活性的聚合酶活性3 3 5 5 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性CCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTAKlenow+Mg2+ KlenowKlenow片段的主要用途（片段的主要用途（利用利用5 3 5 3 的聚合酶活性）的聚合酶活性）修補限制性酶消化修補限制性酶消化DNADNA形成的形成的33隱蔽末端隱蔽末端標記標記DNADNA片段的末端片段的末端 底物用底物用3232P PdNTPsdNTPs cDNAcDNA克

57、隆中第二鏈克隆中第二鏈cDNAcDNA的合成的合成 DNADNA序列的測定序列的測定 （三）（三） T4DNA聚合酶聚合酶T T4 4DNADNA聚合酶是聚合酶是 從從T4T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，酶催活性：酶催活性：5353的聚合酶活性的聚合酶活性3 5 3 5 的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶聚合酶 I I 的活性高的活性高200200倍。倍。比比KlenowKlenow 片段酶片段酶強強1001001,0001,000倍。倍。 因此，可以綜合利用這兩種活性進行因此，可以綜合利用這兩

58、種活性進行取代合成取代合成反應(yīng)：反應(yīng)：如果反應(yīng)體系中僅存在一種如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTPdNTP或沒有底物時，這時或沒有底物時，這時T4DNAT4DNA聚合聚合酶就會表現(xiàn)出酶就會表現(xiàn)出3 5 3 5 外切酶活力，從雙鏈外切酶活力，從雙鏈DNADNA的的33開始降開始降解，直到露出底物解，直到露出底物dNTPdNTP相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。取代反應(yīng)。CGTCGCGCAGCGCGTCGCGCAGCGdTTPMg+CGTGCAGCG32P dNTPsMg+ T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途1 1、利用取代合成反應(yīng)制備探針、利用取代合成

59、反應(yīng)制備探針2 2、標記具有平末端的或具有、標記具有平末端的或具有33隱蔽末端隱蔽末端的的DNADNA片段片段利用較強的利用較強的3 5 3 5 外切酶活性和外切酶活性和 5353聚合活性聚合活性3 3、用于、用于DNADNA序列分析序列分析 （四）（四） 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴是一種依賴RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。此酶首先是此酶首先是19701970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的個課題組的論文都發(fā)在了同一期的NatureNature雜志上。雜志上。最普遍使用的是從鳥類骨髓