第七章細菌和噬菌體的重組和連鎖

1、第七章 細菌和噬菌體的重組和連鎖基本知識細菌是單細胞，它的遺傳物質是一個大型的環(huán)狀核酸分子，稱之為基因帶，也可稱為染色體。若細菌喪失產生某種營養(yǎng)物質（如氨基酸）的能力就稱為營養(yǎng)缺陷型，相對于缺陷型的野生菌株叫原養(yǎng)型。病毒的結構是由蛋白質外殼和包裹在中間的一個單一的核酸分子（可稱基因帶或染色體）組成。One circular chromosome (4-5Mb) 原養(yǎng)型及原養(yǎng)型及營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型鑒別鑒別: : 基因型的表基因型的表示：用它們示：用它們不能合成的不能合成的物質的前三物質的前三個字母個字母 7.1 細菌的遺傳分析細菌的雜交 以大腸桿菌為例，大腸桿菌K12中兩個菌株A和B，菌株A是

2、供體，含有F因子（F質粒），記作F+，菌株B是受體，沒有F因子，記作F-。F因子又稱性因子或致育因子，它是能獨立增殖的環(huán)狀DNA分子。 F+細菌的表面有稱作性傘毛的細長纖毛。當F+細菌與F-細菌結合時，F(xiàn)因子通過性傘毛從F+細菌轉移到F-細菌，原來的細菌還仍為F+。不過染色體很少通過結合而轉移到F-細菌，所以染色體上的基因的重組頻率很低。雜交實驗雜交實驗Lederberg 和和 Tatum 1946ABABAB回復突變回復突變or重組重組？雜交實驗雜交實驗Lederberg 和和 Tatum 1946AB CD AB CDABCD A A品系：品系：metmet biobio thithi l

3、euleu thrthr（thithi：硫胺素：硫胺素B1B1） B B品系：品系：metmet biobio thithi leuleu thrthr A A+B BA A+B B 基本培基本培 養(yǎng)基養(yǎng)基 metmet biobio thithi leuleu thrthr出現(xiàn)頻率出現(xiàn)頻率:1/10:1/107 7（示：雜交實驗）（示：雜交實驗）達爾夫達爾夫Davis U型管實驗型管實驗遺傳物質的單方向轉移遺傳物質的單方向轉移Hayes實驗實驗A: met- thr+ leu+ thi+B: met+ thr- leu- thi-Donor： AReceptor：B 大劑量鏈霉素大劑量鏈霉素

4、 A A品系品系 無影響無影響 大劑量鏈霉素大劑量鏈霉素 B B品系品系 阻止了重阻止了重組組 F細菌可以把細菌可以把F因子因子傳給后代傳給后代。 F細菌經細菌經吖啶橙處理吖啶橙處理F因子丟失因子丟失，丟失后，丟失后不再出現(xiàn)。不再出現(xiàn)。 F可以可以和和F雜交雜交，而，而不能和不能和F雜交雜交。 F和和F雜交雜交后代皆為后代皆為F，而且可以以，而且可以以107頻頻率獲得重組體后代。率獲得重組體后代。Hfr菌株 因為F因子和細菌的DNA分子都是環(huán)狀的，在環(huán)狀的細菌染色體和環(huán)狀的F因子間通過一個交換，環(huán)狀F因子就整合到環(huán)狀的細菌染色體上。 F因子整合到細菌染色體上的菌株就是高頻重組菌株，稱為Hfr菌

5、株。高頻重組菌株（Hfr菌株）跟菌株B（F-）雜交時，細菌染色體上基因的重組 頻 率 很 高 ， 即 出 現(xiàn) 重 組 子 的 頻 率 很 高 。圖示 F因子整合到細菌染色體的過程） 相同相同1、都能和、都能和F雜交。雜交。2、雜交都要通過接合管和受體菌相聯(lián)接。、雜交都要通過接合管和受體菌相聯(lián)接。3、高劑量鏈霉素處理后都不影響雜交，說明、高劑量鏈霉素處理后都不影響雜交，說明它們都是作為一種供體。它們都是作為一種供體。 不同不同1、產生重組子頻率不同，、產生重組子頻率不同，HfrF為為104，F(xiàn)F為為107。2、 FF后代后代F， HfrF后代后代F。3、 F細菌經吖啶橙處理變成細菌經吖啶橙處理變

6、成F，Hfr經吖經吖啶橙處理仍為啶橙處理仍為Hfr。中斷雜交技術：把Hfr細菌與F-細菌混合培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，將試樣攪拌并稀釋后在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其只有重組子類型可以生長，分析Hfr染色體上基因進入受體細胞（F-細菌）的順序各所需時間（分鐘），這種根據供體基因進入受體細胞的順序和時間繪制連鎖圖的技術，稱為中斷雜交技術。巴斯德實驗室，巴斯德實驗室，Elie Wolliman和和Francois Jacob（1 1）.Wollman.Wollman和和JacobJacob的實驗的實驗 要解決的問題是：要解決的問題是： HfrHfr細菌在交配中，什么時候把基因轉移給細菌在交配中，什么時候把

7、基因轉移給F F細菌。細菌。 方法：把兩個菌株混在一起，進行雜交方法：把兩個菌株混在一起，進行雜交將二菌株在培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，將二菌株在培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，HfrHfr細菌與細菌與F F細菌開細菌開始接觸，形成接合管。每隔一定時間取樣攪拌，斷開始接觸，形成接合管。每隔一定時間取樣攪拌，斷開結合管，使配對的細菌分開。然后稀釋菌液，防止再結合管，使配對的細菌分開。然后稀釋菌液，防止再度配對。度配對。將上述菌液涂布在含有鏈霉素，但不含有蘇氨酸和亮將上述菌液涂布在含有鏈霉素，但不含有蘇氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上。這樣，帶氨酸的培養(yǎng)基上。這樣，帶thrthr+ +和和leuleu+ +的的HfrHfr菌株對鏈

8、菌株對鏈霉素敏感；而帶有霉素敏感；而帶有strstrr r的的F F菌不能合成蘇氨酸和亮氨菌不能合成蘇氨酸和亮氨酸，酸，都不能生長都不能生長。只有帶。只有帶thrthr+ +和和leuleu+ +的的HfrHfr菌和帶有菌和帶有strstrr r的的F F菌的重組子可以生長。菌的重組子可以生長。 把中斷雜交的細菌放在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，顯然供體、把中斷雜交的細菌放在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，顯然供體、受體菌都能生長。影響檢測。我們只需要把發(fā)生重組的受體菌都能生長。影響檢測。我們只需要把發(fā)生重組的重組子檢出。這就必須有一個可供選擇用的供體標記基重組子檢出。這就必須有一個可供選擇用的供體標記基因。這樣可以認

9、出重組子，如在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇因。這樣可以認出重組子，如在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇thrthr+ +leuleu+ +重組子。這時重組子。這時thrthr+ +leuleu+ +為標記基因，可排除受體為標記基因，可排除受體菌株，但供體菌還能繼續(xù)存在。為了不選擇供體細胞本菌株，但供體菌還能繼續(xù)存在。為了不選擇供體細胞本身，供體細菌也應該帶有一個特殊的標記，能使自己不身，供體細菌也應該帶有一個特殊的標記，能使自己不被選擇。例如供體菌對鏈霉素敏感，這樣當結合體在含被選擇。例如供體菌對鏈霉素敏感，這樣當結合體在含有鏈霉素的培養(yǎng)基上生長時，供體菌株就被殺死了。有鏈霉素的培養(yǎng)基上生長時，供體菌株就被殺死了

10、。 如何檢出某一基因的重組子如何檢出某一基因的重組子? 把中斷雜交的細菌稀釋接種到含有鏈霉素的把中斷雜交的細菌稀釋接種到含有鏈霉素的基本培養(yǎng)基上，如能形成菌落，它的基因型基本培養(yǎng)基上，如能形成菌落，它的基因型必定是必定是thrthr+ +leuleu+ +strstrr r。因為只有這種重組子才。因為只有這種重組子才能生長。并說明供體能生長。并說明供體thrthr+ +和和leuleu+ +已進入受體已進入受體并發(fā)生重組。我們稱在供體菌中被選擇的基并發(fā)生重組。我們稱在供體菌中被選擇的基因因thrthr+ +和和leuleu+ +為為選擇標記基因選擇標記基因，而始終不被，而始終不被選擇的選擇的s

11、trstrs s為為反選擇標記基因反選擇標記基因，而那些還沒，而那些還沒有進行選擇檢定的基因為有進行選擇檢定的基因為非選擇標記非選擇標記。 對每一時刻的重組對每一時刻的重組 thr+leu+strr的菌落影印培的菌落影印培養(yǎng)接種到不同的培養(yǎng)基上（如乳糖養(yǎng)接種到不同的培養(yǎng)基上（如乳糖lae+ 伊伊紅紅+美蘭美蘭紅色，反之則是粉紅色的。紅色，反之則是粉紅色的。記錄重組子中每一非選擇標記出現(xiàn)的時間、記錄重組子中每一非選擇標記出現(xiàn)的時間、出現(xiàn)的頻率和持續(xù)時間，得圖（出現(xiàn)的頻率和持續(xù)時間，得圖（Hfr的非選的非選擇標記基因進入擇標記基因進入F-所需的時間，以及根據非所需的時間，以及根據非選擇標記在各個時

12、間出現(xiàn)的頻率作圖）。選擇標記在各個時間出現(xiàn)的頻率作圖）。在發(fā)生重組的菌落中，如何檢別非選擇標記基因在發(fā)生重組的菌落中，如何檢別非選擇標記基因各培養(yǎng)基分別具有不同的營養(yǎng)缺陷或某種抑制性物質存在。 WollmanWollman和和JacobJacob對重組子對重組子thrthr+ +leuleu+ +strstrr r進行進行菌落影印培養(yǎng)實菌落影印培養(yǎng)實驗。分析驗。分析HfrHfr染染色體上其它非選色體上其它非選擇性標記基因進擇性標記基因進入入F F細菌的順序細菌的順序和所需時間（分和所需時間（分鐘），繪制連鎖鐘），繪制連鎖圖。圖。（2 2）. . 實驗結果及分析實驗結果及分析9 9v從從HfrH

13、fr菌株某基因在菌株某基因在F F細菌中出現(xiàn)開始，隨細菌中出現(xiàn)開始，隨著時間的推移，具有該著時間的推移，具有該基因的菌落逐漸增加，基因的菌落逐漸增加，直到某一百分數(shù)為止。直到某一百分數(shù)為止。l而且某一基因出現(xiàn)的時間而且某一基因出現(xiàn)的時間愈早，它達到的頻率愈高。愈早，它達到的頻率愈高。 v如疊氮化鈉抗性基因出現(xiàn)如疊氮化鈉抗性基因出現(xiàn)最早，在最早，在24分鐘時就達到大分鐘時就達到大約約90的的F-菌落；半乳糖發(fā)菌落；半乳糖發(fā)酵基因出現(xiàn)最遲，即使在混酵基因出現(xiàn)最遲，即使在混和后和后60分鐘也只有分鐘也只有30的菌的菌落屬于能利用型。落屬于能利用型。（3 3）. .結論結論染 色 體 從 一 端 開

14、始 ， （ 這染 色 體 從 一 端 開 始 ， （ 這一端稱為原點（一端稱為原點（originorigin）或）或OO），），以線性方式進入以線性方式進入F F- -細胞中?；蚣毎??；螂x原點越遠，進入離原點越遠，進入F F細胞越遲。細胞越遲。離開原點較遠的基因，可能在轉離開原點較遠的基因，可能在轉移過程停止以前，仍未轉移，因移過程停止以前，仍未轉移，因而斜率較低，達到的最高值也而斜率較低，達到的最高值也較小。如果讓較小。如果讓HfrHfr F F雜交繼續(xù)進雜交繼續(xù)進行，長達二小時，然后使之中行，長達二小時，然后使之中斷，這樣發(fā)現(xiàn)某些斷，這樣發(fā)現(xiàn)某些F F受體轉變?yōu)槭荏w轉變?yōu)镠frHfr

15、。致育因子是最后轉移到受體。致育因子是最后轉移到受體的，并使它們成為供體其效率很的，并使它們成為供體其效率很低，是因為致育因子是線性染色低，是因為致育因子是線性染色體最后一個單位，它最晚進入體最后一個單位，它最晚進入F F細胞。細胞。（4 4）. . 作圖作圖 WollmanWollman和和JacobJacob認為，根據中斷雜交技術，用雜交認為，根據中斷雜交技術，用雜交后后HfrHfr基因最初在受體細菌中出現(xiàn)的時間作為指標，可基因最初在受體細菌中出現(xiàn)的時間作為指標，可以作連鎖圖。以作連鎖圖。 遺傳距離用時間（分鐘）為單位，譬如，遺傳距離用時間（分鐘）為單位，譬如，tonton在在aziazi

16、開始進入開始進入F F細胞后細胞后2 2分鐘進入，那么分鐘進入，那么aziazi和和tonton間的間的遺傳距離為遺傳距離為2 2單位，其它依此類推。單位，其它依此類推。細菌的交換過程 重組子(即重組類型)的產生是由于不同的DNA分子之間發(fā)生交換的結果。細菌重組子的產生是由于細菌染色體（F-染色體）與供體DNA分子（部分Hfr染色體）之間發(fā)生交換的結果。但發(fā)生單交換是沒有用的，只有發(fā)生偶數(shù)的交換才能產生有活性的重組子。 根據重組子頻率來確定兩基因之間的距離并繪制出連鎖圖，這種根據重組頻率作圖的方法稱之為重組作圖。ABbabaABABbaABba+ABba部分二部分二倍體倍體Hfr lacHfr

17、 lac+ +adeade+ +(str(strs s) ) F F- - lac lac- -adeade- -(str(strr r) )完全培養(yǎng)基混合培養(yǎng)完全培養(yǎng)基混合培養(yǎng)基本培養(yǎng)基（基本培養(yǎng)基（F F- -adeade+ + 菌落菌落）（無腺嘌呤、加鏈霉素（無腺嘌呤、加鏈霉素) )EMBEMB培養(yǎng)基（影印培養(yǎng)）培養(yǎng)基（影印培養(yǎng)）F F- -adeade+ +laclac- -基因間發(fā)生交換基因間發(fā)生交換F F- -adeade+ +laclac+ +基因間未發(fā)生交換基因間未發(fā)生交換加乳糖加乳糖實驗方法：實驗方法： 將重組子菌落影印培養(yǎng)在將重組子菌落影印培養(yǎng)在加有曙紅和美藍的培養(yǎng)基加有曙

18、紅和美藍的培養(yǎng)基上：以檢驗能否利用乳糖。上：以檢驗能否利用乳糖。如能發(fā)酵乳糖（如能發(fā)酵乳糖（lac+），），菌落是紫紅色的。菌落是紫紅色的。如不能利用（如不能利用（lac-），），菌落是粉紅色的。菌落是粉紅色的。試驗結果：試驗結果：親組合親組合 52 重組合重組合 15計算重組頻率：計算重組頻率： 重組菌落數(shù)重組菌落數(shù)/ /總菌落數(shù)總菌落數(shù)100 % 100 % =(lac- ade+)/(lac+ ade+ )+(lac- ade+) =(lac- ade+)/(lac+ ade+ )+(lac- ade+) 100% 100% = 15/(52+15) = 15/(52+15) 100%

19、20% 100% 20% 已知中斷雜交實驗該兩個基因相距已知中斷雜交實驗該兩個基因相距1分鐘分鐘, 重組作圖與中斷雜交作圖的圖距關系重組作圖與中斷雜交作圖的圖距關系: 1分鐘圖距分鐘圖距 20% 重組值重組值前面提到，時間單位接近前面提到，時間單位接近2 2分鐘時，測得的基因間的距離，分鐘時，測得的基因間的距離，不太可靠，故應采用比較穩(wěn)定的重組作圖法。不太可靠，故應采用比較穩(wěn)定的重組作圖法。 F 因子（ F 質粒）是帶有部分細菌染色體的帶有部分細菌染色體的F因因子。子。Hfr通過交換，可以形成帶有部分細菌染色體的F 因子，而F 因子又可通過交換整合到細菌染色體上的原來位置，回復到以前的Hfr狀

20、態(tài)。F 因子連同它所帶有的部分細菌染色體可一起轉移到F-細胞，并形成部分二倍體。這一特性叫做性導。F 因子轉移到F-細胞的轉移速率近于F因子。但它把細菌染色體轉移過去的效率比Hfr低得多。不過Hfr的致育因子（F因子）極少進入F-細胞。 F 品系轉變成品系轉變成Hfr品系的品系的頻率要高頻率要高于于F品系。品系。 F 變成變成Hfr時時F 因子整合到因子整合到相同位點相同位點上，而上，而F變成變成Hfr時可整合到時可整合到不同位點不同位點。 F F 高頻傳遞高頻傳遞特定的基因特定的基因，形成部分二倍，形成部分二倍體，而體，而FF產生產生F但不轉移任何基因，或但不轉移任何基因，或以以107將宿主

21、的基因轉移，將宿主的基因轉移，所轉移的基因是不所轉移的基因是不同的同的。 Hfr F將將宿主宿主的基因按順序轉入受體，的基因按順序轉入受體，產產生重組子頻率較高，生重組子頻率較高，為為10。但受體仍為但受體仍為F（？）。性別性別細菌狀態(tài)細菌狀態(tài)F因子狀態(tài)因子狀態(tài)F-無無F因子因子F+F因子為游離狀態(tài)因子為游離狀態(tài)HfrF因子整合到宿主染色體上因子整合到宿主染色體上F 帶有部分宿主染色體的帶有部分宿主染色體的F因子，因子，為游離狀態(tài)為游離狀態(tài)小結：小結：1、細菌細胞的兩種性別、四種狀態(tài)：、細菌細胞的兩種性別、四種狀態(tài)： F+F-丟失丟失雜交雜交 F+Hfr整合到整合到E.coli 染色體染色體規(guī)

22、則脫離規(guī)則脫離E.coli 染色體染色體 FHfr 回復回復到到Hfr 染色體染色體不規(guī)則脫離不規(guī)則脫離E.coli 染色體染色體2、F+、 F-、Hfr、F的關系的關系轉變關系轉變關系F+F- 低頻重組低頻重組HfrF- 高頻重組高頻重組FF- 一般為低頻重組，但對所攜一般為低頻重組，但對所攜 帶的基因是高頻重組。帶的基因是高頻重組。重組頻率區(qū)別重組頻率區(qū)別7.2 噬菌體的遺傳分析烈性噬菌體：噬菌體侵染細菌后，把宿主菌的生物合成裝置接收過來，合成更多的噬菌體，最后使細菌細胞烈解并釋放出很多子代噬菌體。這種使宿主菌烈解的噬菌體叫烈性噬菌體。如T2噬菌體。溫和噬菌體：噬菌體侵染細菌后，細菌好象未被感染一樣能繼續(xù)增殖。如不經誘導宿主菌不發(fā)生烈解，這種噬菌體叫溫和噬菌體。這種現(xiàn)象叫溶源性，這樣的細菌叫溶源性細菌或溶源菌。如P22、P1和噬菌體。 噬菌斑的鑒定（噬菌體遺傳特性的鑒定） 一個噬菌斑中的噬菌體在遺傳上是均一的，相當于一個克隆。由于噬菌體的基因型不同，噬菌斑可以是大的或小的，邊緣清晰的或模糊的；另外噬菌體的宿主范圍（host range）也可能不同，有些噬菌體可以侵染和裂解某些細菌但不能侵染和裂解另外一些細菌，根據這些就可以鑒定噬菌體遺傳特性。 T2突變型突變型r-：快速溶菌，大界限分