微生物實驗報告

1、動物微生物及免疫學(xué)實驗報告一、實驗?zāi)康模ㄒ唬┱莆找话闩囵B(yǎng)基的制備原理及要求，掌握培養(yǎng)基酸堿度的測定，熟悉一般培養(yǎng)基的制備過程和各種器皿滅菌方法。（二）掌握細菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和方法，掌握細菌抹片的制備方法和革蘭氏染色法及油鏡的使用方法，并認識革蘭氏染色的反應(yīng)特性。（三）掌握學(xué)習(xí)用微生物學(xué)原理診斷疾病的一般方法及步驟。二、實驗用品（一）器材量筒、燒杯、電子天平、漏斗、三角燒瓶、空試劑瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、試劑瓶瓶塞、扎純、放大鏡、包裝紙、洗耳球、酒精燈、載玻片、火柴、吸水紙、剪刀、記號筆、接種環(huán)、注射器、鑷子、鉗子、毫米尺、培養(yǎng)箱、水浴培養(yǎng)箱、高壓

2、蒸汽滅菌鍋、油鏡（二）試劑及材料肘胨、蛋白胨、豬膽鹽、氯化鈉、瓊脂、乳糖、0.01%結(jié)晶紫水溶液、0.5%中性紅水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氫氧化鈉、鹽酸、牛血清、革蘭氏染色液、蒸餾水、小白鼠、病豬內(nèi)臟三、實驗步驟（一）培養(yǎng)基的制備（所有用到的器皿都已 121c高壓滅菌1530min,傾注平板在無菌操作臺內(nèi)完成，并放在無菌操作臺內(nèi)）1、麥康凱培養(yǎng)基（1）組成：蛋白陳17g、肘陳3g、豬膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂17g、乳糖10g、0.01淘晶紫水溶液10ml、0.5%中性紅水溶液5ml、蒸儲水1000ml（2）方法：將蛋白陳、肘陳、豬膽鹽和氯化鈉溶解于 400ml蒸儲水中，調(diào)節(jié)pH至

3、7.2。將瓊脂加入600ml 蒸餾水中，并加入乳糖，加熱熔化。將兩液混合，分裝于燒瓶內(nèi)，用紗布、扎繩等捆好后，121c高壓滅菌1530min。待冷卻至50 55 c時，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。注：結(jié)晶紫和中性紅水溶液配好后需經(jīng)高壓滅菌。2、血清平板（ 1） 組成：營養(yǎng)瓊脂、牛血清（ 2） 方法：將滅菌的營養(yǎng)瓊脂加熱熔化，冷卻至4550時，加入牛血清，并混勻，傾注平板。注：不得將牛血清一并加入后再滅菌。3、LB培養(yǎng)基（1）組成：胰化蛋白陳10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g（ 2） 方法：在950ml 蒸餾水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、瓊脂和氯化鈉，調(diào)節(jié)pH至 7

4、.4，加熱熔化，分裝于瓶中，用紗布、扎繩等捆好后，121高壓滅菌1530min。待冷卻至50 55 時，傾注平板。4、液體培養(yǎng)基（在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，裝入大試劑瓶中，不加瓊脂，不分裝）（二）病料取材在病豬死亡后，首先用顯微鏡檢查其末梢血液膜片中是否有炭疽桿菌存在，未發(fā)現(xiàn)，則立即用消毒的器械對其進行生理解剖，觀察其病理特征現(xiàn)象，取出病豬的十二指腸、胃、肝臟三處的組織物，并注意組織的完整性，用儲物袋密封保存。（三）細菌粗培養(yǎng)1、消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作臺內(nèi)桌面及用酒精燈外焰對待用器械進行火焰滅菌。2、接種（ 1） 在無菌操作臺酒精燈旁打開用儲物袋密封

5、保存的病料，先左手持鑷子右手持剪刀，把病料剪出一個小口。20 左2） 右手持滅過菌的接種環(huán)，左手持平板，并用拇指、食指及中指將平皿揭開約右，然后將接種環(huán)前端插入小口旋轉(zhuǎn)一下后，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板上。（ 3） 用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、部位等標(biāo)記，并將平板倒放。以此方法，分別接種十二指腸、胃粘膜、肝臟于血清平板上，各接種2 個血清平板。3、培養(yǎng)：將接種好的血清平板倒扣放入37培養(yǎng)箱中，反向培養(yǎng)24小時。注：劃線接種時盡量劃開，以保證長出單個菌落，且劃線時接種環(huán)應(yīng)盡量傾斜，以免劃破培養(yǎng)基（后同）；待接種完畢后熄滅無菌操作臺內(nèi)酒精燈，關(guān)閉好無菌操作臺窗口，打開無菌操作臺

6、內(nèi)的紫外燈。（四）細菌純培養(yǎng)1、菌落特征判斷待粗培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)24 小時后，取出用放大鏡觀察記錄單個小菌落的形態(tài)特征并用實驗報告紙記錄好，并在平板底部上做好觀察標(biāo)記，其形態(tài)特征包括大小、形狀、菌落邊緣、表面構(gòu)造、隆起度、濕潤度、透明度、顏色等。2、取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢（ 1） 取干凈的載玻片，用記號筆在其一面做好正反面標(biāo)記，再在載玻片另一面中央滴上一小滴蒸餾水。（ 2） 將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷卻后，在酒精燈旁從標(biāo)記的單個小菌落中取少許細菌置于蒸餾水中混勻（同時蓋好平板倒扣置于一旁），用接種環(huán)涂成直徑約1.5cm 的菌膜，再在酒精燈火焰上方以鐘擺速度通過固定好細菌，待冷卻進行染色。（

7、3）先滴加草酸結(jié)晶紫溶液染色12min,再水洗；然后滴加革蘭氏碘液溶液染色 12min, 再水洗；隨后滴加95%勺酒精脫色3060s,再水洗；最后滴加稀釋的品紅進行復(fù)染 3060s,再水洗；待干燥或吸水紙吸干后鏡檢。（ 4） 將干燥的載玻片放在1000 倍油鏡下，滴加一滴松柏油進行鏡檢，觀察其形態(tài)特征，判斷細菌的種屬。3、細菌接種培養(yǎng)（ 1） 消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作臺內(nèi)桌面及用酒精燈外焰對待用器械進行火焰滅菌。（ 2） 接種：右手持滅過菌的接種環(huán)，左手持平板，并用拇指、食指及中指將平皿揭開約20。 左右，然后將接種環(huán)插入揭開的平板口內(nèi)蘸去一下鏡檢

8、標(biāo)記的小菌落，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板、LB平板或麥康凱平板上。并用記號筆在平板底 部作好日期、操作人員、菌種、部位等標(biāo)記，將平板倒放。（ 3） 將接種好的平板倒扣放入37培養(yǎng)箱中，反向培養(yǎng)24 小時。注：油鏡用完后應(yīng)立即清理物鏡上的松柏油；劃線接種時盡量劃開，以保證長出單個菌落；待接種完畢后熄滅無菌操作臺內(nèi)酒精燈，關(guān)閉好無菌操作臺窗口，打開無菌操作臺內(nèi)的紫外燈。（五）菌液的制備1、鏡檢：用革蘭氏染色法在1000 倍油鏡下鏡檢，觀察并記錄是否為純培養(yǎng)的細菌。2、分裝液體培養(yǎng)基：先對無菌操作臺及需要使用的器械進行消毒滅菌，然后用鉗子揭開一個空試劑瓶，用傾倒的方法在酒精燈旁從液體培養(yǎng)基

9、大試劑瓶中分裝于空試劑瓶內(nèi)，并立即蓋上液體培養(yǎng)基大試劑瓶瓶塞。3、接種：右手持接種環(huán)，用火焰對其進行滅菌，待冷卻后，取出純培養(yǎng)的平板，在無菌操作臺內(nèi)酒精燈旁，蘸去少許細菌，左手傾斜液體培養(yǎng)基，將接種環(huán)，伸入液體培養(yǎng)基內(nèi)攪動，然后取出對接種火焰環(huán)滅菌，并用滅菌的包裝紙捆綁好后，用記號筆做好相應(yīng)標(biāo)記，置于一旁。4、培養(yǎng)搖菌：將接種好的液體培養(yǎng)基置于水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時。注：分裝一個培養(yǎng)基就接種一個培養(yǎng)基，不得全部分裝完后再一個一個接種。（六）小鼠致病性實驗1、保定：選擇健康的青壯年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋轉(zhuǎn)數(shù)周讓其眩暈，然后用左手的拇指和食指捏住兩耳及頭部皮膚，并翻轉(zhuǎn)左手，使其頭部朝下，

10、以達到內(nèi)臟前移的目的。2、接種：先用酒精棉球蘸取酒精對注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml 菌液注射于小白鼠腹腔中。3、觀察：將接種的小白鼠放在適宜的環(huán)境下生活，并在鼠籠處用記號筆標(biāo)記好接種時間、菌種等。4、再培養(yǎng)鑒定：待小白鼠死亡后，對其進行解剖，觀察其內(nèi)臟病變情況，并取肝臟直接涂在相應(yīng)培養(yǎng)基上，在適宜條件下反向培養(yǎng)24 小時后，取菌落細菌進行鏡檢觀察判斷。注：在注射小白鼠2 小時候需要觀察小白鼠是否因注射時傷害到內(nèi)臟而死亡。（七）生化試驗取生化試驗管將培養(yǎng)液用力甩在一邊，在酒精燈旁再用鉗子將生化試驗管另一邊剪斷，并在酒精燈旁將純培養(yǎng)的細菌用接種環(huán)接種在生化試驗管培養(yǎng)液中，倒放固定

11、在塑料板上，并在塑料板上用記號筆做好菌種等標(biāo)記，置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，觀察生化管內(nèi)的反應(yīng)變化。注：在剪斷生化管時要小心，以防劃破手指，且要注意不要將生化管上的標(biāo)簽剪掉了。（八）藥敏實驗1、接種：先將無菌操作臺臺面及需要用的器械消毒滅菌，用鉗子將菌液瓶打開，然后在酒精燈旁用接種環(huán)蘸取菌液將其均勻地接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基上。2、貼片：用滅菌的鑷子將各種藥敏紙片小心均勻地貼于接種好的培養(yǎng)基上，做好相應(yīng)的記錄，并用記號筆在平板底部做好相應(yīng)的標(biāo)記，置于適宜條件培養(yǎng)箱中反向培養(yǎng)24 小時，再觀察測量其生長抑菌圈的直徑。注：接種完一個平板后，應(yīng)立即將菌液瓶蓋??；貼片時，可在一張滅菌的白紙上做好貼片位置的

12、標(biāo)記，以保持藥敏紙片的均勻。（九）實驗完畢，整理器械先對各步驟的實驗材料、平板、器械等進行滅菌，然后將廢料等倒入指定的廢料回收處，清洗并整理好各種器材（小心清洗玻璃器皿，以防損壞被劃傷），并將玻璃器皿放入烘箱中以備下次使用。四、實驗結(jié)果（以十二指腸為主）1、病豬病理特征現(xiàn)象：有咳嗽癥狀，用某藥后停止咳嗽，但出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象，并在3天內(nèi)死亡了30 頭左右，且糞便為水樣，用某藥以后癥狀消除。有神經(jīng)癥狀，前肢不能站立。解剖后肺內(nèi)發(fā)生病變，全身淋巴月中大，胃粘膜出血。此豬打過豬瘟 疫苗，未打過偽狂犬疫苗。2、各菌落特征結(jié)果(血清平板培養(yǎng) 24小時后)(1)十二指腸：呈淡黃色半透明圓形小菌落，圓突狀，邊緣整

13、齊，表面扁平光滑 濕潤，質(zhì)地粘稠；純化后接種在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細菌使麥康凱培養(yǎng)基 變紅。(2)胃：呈淡黃或白色圓形不透明菌落，大小不一，形成菌苔，圓突狀，邊緣整 齊，表面光滑。(由于在短時間內(nèi)形成菌苔，和鏡檢觀察，可斷定其中無致 病菌，則停止了以后的實驗)(3)肝臟：呈淡黃色和白色不透明的圓形小菌落，圓突狀，邊緣整齊，表面光滑。 (由于有兩種菌落，則分別進行分離實驗)3、各菌鏡檢特征結(jié)果(1)十二指腸分離培養(yǎng)細菌：為革蘭染色陽性，圓形或橢圓形、呈鏈狀排列，未 發(fā)現(xiàn)鞭毛及芽胞。(2)肝臟分離培養(yǎng)細菌A:為革蘭染色陰性，單個存在的短小桿狀細菌。(3)肝臟分離培養(yǎng)細菌B:為革蘭染色陽性，菌體呈矛

14、頭狀，成雙或成短鏈狀排 歹I。4、小鼠接種致死性結(jié)果(1)十二指腸分離培養(yǎng)細菌接種：死亡(2)肝臟分離培養(yǎng)細菌 A接種：死亡(3)肝臟分離培養(yǎng)細菌B接種：存活，但精神萎靡5、生化試驗結(jié)果生化管接種前接種一十二指腸肝月莊A肝臟B硫化氫無色透明一一一葡錮糖紫色一血清菊糖淡綠色+一0麥芽糖紫色后一一一甘露醇紫色一一山梨醇紫色一一0紫色乳糖紫色+6、藥敏實驗結(jié)果(1)十二指腸藥片直徑(mn)藥片直徑(mn)藥片直徑(mn)先鋒霉素6恩諾沙星6r多粘霉素b12奧氟星6慶大毒素6新霉素18先鋒必素10氯霉素7頭抱膚歷6氯潔霉素6青霉素6r氨卞四林6氨卡青霉素6丙氟哌酸14氟苯尼考6磺胺異惡唾6桿菌肽6復(fù)達欣18復(fù)方新潔明6苯口坐青霉素6唆年青霉素6頭抱曲松8麥迪菌素6阿奇霉素10(2)肝臟A藥片直徑(mn)藥片直徑(mm)藥片直徑(mm)竣辛青霉素6桿菌肽6氟銀酸6氨霉素6兩性霉素B6奧氟星6青霉素 先鋒必素610痢利靈 先鋒霉素IV28 9淋必治 氨卞四林16.513(3)肝臟B藥片新霉素恩諾沙星氟霉素直徑(mrm26288五、結(jié)果分析討論(一)十二指腸中細菌：經(jīng)過鏡檢及生化試驗結(jié)果分析，判定疑是糞腸球菌(二)肝臟中細菌A:由于生化試驗只