生物物理技術(shù)的PPT

1、 鄒晶露 121601背景背景目的目的各種檢測(cè)方法各種檢測(cè)方法展望展望1234隨著科技的快速發(fā)展，納米材料因其特殊物理化學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于化妝品、電學(xué)器件、染料、涂料及醫(yī)藥診斷等各個(gè)領(lǐng)域，尤其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的作用及其顯著，因此而備受關(guān)注，而人們對(duì)于納米材料對(duì)環(huán)境安全和人體健康所潛在的影響卻知之甚少。納米毒理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。 納米毒理學(xué)是專門研究納米顆?；虿牧隙拘缘膶W(xué)科, 運(yùn)用一系列方法來分析納米材料在體內(nèi)和體外所產(chǎn)生的影響。本文就如何檢測(cè)這些毒性作用導(dǎo)致出現(xiàn)的特征對(duì)磁性納米顆粒的毒性檢測(cè)方法作一簡(jiǎn)要綜述, 以供大家對(duì)納米材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)作為參考。磁性納米顆粒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響導(dǎo)致細(xì)胞的變

2、化有：炎癥、凋亡小體的產(chǎn)生、線粒體功能障礙、膜破裂導(dǎo)致乳酸脫氫酶的泄露、活性氧的產(chǎn)生、DNA損傷、染色體的濃縮等。圖1. 細(xì)胞毒性的反應(yīng)1.1.針對(duì)線粒體功能障礙的檢測(cè)針對(duì)線粒體功能障礙的檢測(cè)1.1 MTT1.1 MTT法法原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性 的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。優(yōu)缺點(diǎn)： 靈敏度高，簡(jiǎn)單，快速又簡(jiǎn)單。 產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。生成的甲瓚不易 充分溶解。測(cè)試后的細(xì)胞不能

3、繼續(xù)培養(yǎng)。 圖3. Morteza等用此法檢測(cè)到不同濃度SPIONs處理下心臟細(xì)胞，腦細(xì)胞，腎細(xì)胞數(shù)量的變化圖2.MTT處理后的顯微圖像2 CCK-82 CCK-8試劑盒法試劑盒法原理： WST-8是一種類似MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體的脫氫酶還原成橙黃色的formazan，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長處測(cè)定其光吸收值，不需要裂解細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色。細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。優(yōu)點(diǎn)： 產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟CCK一8法檢測(cè)后細(xì)胞可重復(fù)利用，將細(xì)胞用生理鹽水洗2遍，加入培養(yǎng)液可繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行傳代，還

4、可進(jìn)行染色和組化實(shí)驗(yàn)等。3 3 Alamar Blue Alamar Blue 法法原理： 此試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑其在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，其吸收峰為530560nm。在細(xì)胞增殖過程中，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細(xì)胞內(nèi)的染料被這些線粒體酶還原后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色。最后用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。優(yōu)點(diǎn)： Alamar blue 法對(duì)細(xì)胞的毒性

5、小，對(duì)樣品破壞小、試劑用量少、操作簡(jiǎn)單，特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好。圖4.2. 2. 針對(duì)乳酸脫氫酶泄露的檢測(cè)（針對(duì)乳酸脫氫酶泄露的檢測(cè)（LDHLDH法）法）原理： LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外。此時(shí)培養(yǎng)液中 LDH 活性與細(xì) 胞死亡數(shù)目成正比。LDH 可使乳酸脫氫，進(jìn)而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H被還原成紫紅色甲臜類化合物。在酶標(biāo)儀上用490nm比色測(cè)定。優(yōu)缺點(diǎn)： 此法測(cè)定迅速, 并且能夠進(jìn)行定量分析。

6、但是乳酸脫氫酶是大分子, 只有靶細(xì)胞膜完全被破壞后才能釋放出來，不能較早的反映細(xì)胞的存活狀況。影響因素較多, 例如, 培養(yǎng)基、測(cè)定環(huán)境的溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間等。圖5.Soenen等用此法檢測(cè)了超順磁性納米顆粒等不同納米顆粒對(duì)PC 12細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化。3. 針對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)（形態(tài)學(xué)觀察）針對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)（形態(tài)學(xué)觀察）在熒光顯微鏡下，吖啶橙染色后，活細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光, 胞質(zhì)呈橘紅色熒光，而凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側(cè)。圖6.凋亡細(xì)胞的熒光顯微圖像4. 針對(duì)細(xì)胞壞死的檢測(cè)（細(xì)胞膜不完整）針對(duì)細(xì)胞壞死的檢測(cè)（細(xì)胞膜不完整）4.1 中性紅染色中性紅染色原理：

7、中性紅不帶電荷，可以被活細(xì)胞所攝入，并在溶酶體中積累。在細(xì)胞增殖加快時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多，可以攝入的中性紅的量就會(huì)增加。在細(xì)胞受到損傷時(shí)，中性紅的攝入能力會(huì)下降。這樣通過對(duì)于中性紅攝入量的不同就可以確定細(xì)胞的增殖或毒性情況，它在540nm出有較高的吸收值。4.2 臺(tái)盼藍(lán)染色臺(tái)盼藍(lán)染色原理： 臺(tái)盼藍(lán)是帶電荷的分子，不能進(jìn)入正常的胞膜結(jié)構(gòu)完整的活細(xì)胞；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，臺(tái)盼藍(lán)就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞染成藍(lán)色，并且在605 nm 波長處有較強(qiáng)的吸收。通過顯微鏡下直接計(jì)數(shù)或顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)，就可以對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量。優(yōu)點(diǎn)： 借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活

8、細(xì)胞和死細(xì)胞。用此方法檢測(cè)細(xì)胞毒性，可重復(fù)性好。圖7.臺(tái)盼藍(lán)染色后的顯微圖像4.3 乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠原理： 乙酰氧甲基鈣黃綠素，是電中性的酯分子，可以通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，一旦進(jìn)入細(xì)胞就會(huì)被酯酶轉(zhuǎn)化為帶綠色熒光的鈣黃綠素分子。相反，若細(xì)胞損壞或死亡，本身不能滲透進(jìn)入細(xì)胞的溴化乙錠與核酸結(jié)合，可激發(fā)發(fā)紅色熒光，在495nm出激發(fā)，乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠分別在515nm、635nm熒光信號(hào)最明顯。圖8.熒光顯微圖像5. 針對(duì)針對(duì)DNA損傷的檢測(cè)（彗星電泳法）損傷的檢測(cè)（彗星電泳法）原理： 將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解、堿化處理后，再在電場(chǎng)中進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段，在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案。 正常的無DNA斷裂的核在泳動(dòng)時(shí)保持圓球形，彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。圖9.熒光顯微圖像大量研究表明，多種納米顆粒顯示其細(xì)胞生物毒性效應(yīng)，因而納米材料的細(xì)胞生物毒性效應(yīng)研究工作廣泛開展，但是其細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法仍有缺陷，對(duì)于納