實驗一、機械攪拌發(fā)酵罐的使用及細菌纖維素的發(fā)酵制備

1、實驗一、機械攪拌發(fā)酵罐的使用及細菌纖維素的發(fā)酵制備一、實驗原理與目的 微生物生長受到自身代謝特性和環(huán)境的影響。在分批培養(yǎng)中，隨著微生物的生長、基質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物的積累，環(huán)境發(fā)生改變，從而對微生物代謝產(chǎn)生影響。所以測定代謝過程的參數(shù)，如菌濃、基質(zhì)濃度、pH、溶氧濃度等，并對這些參數(shù)進行分析，可以使人們對微生物培養(yǎng)過程有一個量化的了解，檢測代謝參數(shù)是過程控制與優(yōu)化的前提。本實驗使學(xué)生掌握測定菌體濃度、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成、各種參數(shù)的方法，學(xué)會分析這些參數(shù)的相互關(guān)系。 本實驗在3L發(fā)酵罐中進行細菌培養(yǎng)。通過測定菌體濃度了解細菌的生長規(guī)律，通過測定葡萄糖的消耗了解底物利用，通過測定纖維素產(chǎn)量了

2、解產(chǎn)物生成，分析菌體生長與底物消耗、產(chǎn)物生成的關(guān)系。同時檢測發(fā)酵過程中的溶氧、pH等。二、實驗步驟 1.發(fā)酵罐準備1）清洗。發(fā)酵罐培養(yǎng)前后進行清洗（空氣分布器、取樣管內(nèi)部、取樣平衡口、頂板放零件的小間隙），外壁、底板、頂板擦干凈。 2）連接：進行發(fā)酵之前要對發(fā)酵系統(tǒng)（空氣壓縮系統(tǒng)、冷卻系統(tǒng)、發(fā)酵流加系統(tǒng)及在線控制系統(tǒng)）進行調(diào)試。主要工作是檢查通氣與冷凝水管道的連接正確與否、管道是否破損堵塞、空壓機能否正常工作、在線控制系統(tǒng)是否正常。連接發(fā)酵罐、PH 控制器、DO控制器等電源。注意不漏電和接錯線。  3）空罐滅菌：將發(fā)酵罐充分清洗干凈，罐內(nèi)裝適量去離子水，

3、蓋好罐蓋，接好管路，pH 電極和溶氧電極不需要空消，連接完畢后將發(fā)酵罐整體放在滅菌鍋中，滅菌溫度121，時間 20min。 2.電極標定1）pH 電極標定 pH 電極零點和斜率要在進行滅菌以前進行，電極在使用前先用蒸餾水清洗并檢查電極信號有無故障，然后再進行標定。一般而言如果發(fā)酵液偏酸性我們用6.86 和 4.00 的緩沖液，如果偏堿性則配制 6.86 和 9.18 的緩沖液。 點擊控制器屏幕畫面下方的“標定”，彈出標定菜單，選擇相應(yīng)罐（F1-F4）下的“pH 電極”，彈出相應(yīng)的 pH 電極標定界面。先進行零點標定，以酸性為例，將 pH 電極聯(lián)好電極線用蒸餾水洗凈后插入 pH6.86

4、 的標準液中，點擊“零點值”，輸入 6.86，然后點擊“開始”，待采樣值完全穩(wěn)定后點擊“結(jié)束” 。然后用蒸餾水清洗電極探測頭后插入 pH4.01 的標準液中，同樣方法輸入斜率值 4.01 來標定斜率。接下來將 PH 電極插在發(fā)酵罐上與培養(yǎng)基一起進行滅菌，并用紗布和牛皮紙將電極的金屬頭包住，以免接觸到水。實消后，冷卻下來，連上電極線，接到灌上，這時 PH 電極將信號傳給控制系統(tǒng)并顯示發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液的 PH 值。在發(fā)酵控制臺上設(shè)定需要控制的PH，控制系統(tǒng)會通過流加酸堿控制PH。也可不控制PH，通過電極對發(fā)酵過程的 PH 變化進行檢測。2）溶氧電極的標定溶氧電極的零點要在滅菌以前標定，斜率必須在滅菌

5、后接種前，當溫度等各項培養(yǎng)條件都滿足發(fā)酵工藝的要求是進行標定。 標定方法類似于 pH 電極的標定，點擊控制器屏幕畫面下方的“標定” ，彈出標定菜單，選擇相應(yīng)罐（F1-F4）下的“溶氧電極”，彈出相應(yīng)的溶氧電極標定界面。滅菌前先標定零點，標定液一般為飽和的無水亞硫酸鈉溶液，輸入零點值為1%，點擊“開始”，待采樣穩(wěn)定后結(jié)束。在發(fā)酵罐實消之后，把通氣、攪拌轉(zhuǎn)速、溫度等參數(shù)調(diào)整到設(shè)定值，待各參數(shù)穩(wěn)定滿足發(fā)酵條件后，進入相應(yīng)罐的溶氧電極標定畫面，輸入斜率值 100%進行斜率標定。使用時與 PH 電極一樣，將溶氧電極裝入發(fā)酵罐與培養(yǎng)基一起進行實消滅菌，并用紗布和牛皮紙將電極的金屬頭包住，以免接觸到水。實消

6、完成后，待冷卻后，連接電極線，連接到發(fā)酵罐的控制系統(tǒng)。3.實罐滅菌配制培養(yǎng)基（3L 發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基 2L）及種子液，種子液體積按 8%的裝液量即160ml，置于30搖床160rpm下培養(yǎng) 24小時。 將配好的培養(yǎng)基倒入罐內(nèi)，硅膠管連接取樣管路并用彈簧夾夾住，防止培養(yǎng)基在滅菌時流出；連接補料管路（包括酸、堿、消泡、補料） ；空氣過濾器用硅膠管與罐體空氣管連接并用彈簧夾夾??；將電極裝入電極插口并用蓋子或鋁箔封好，防止插口受潮；排氣口硅膠管用紗布和牛皮紙包好；蓋緊其它罐蓋接口。將罐體和補料瓶放入滅菌鍋，滅菌 121，20 min。滅菌鍋滅菌結(jié)束需自然冷卻，禁止放氣。4. 參數(shù)設(shè)定滅菌結(jié)束后

7、應(yīng)盡快將罐放回原位，連接夾套冷卻水管路和尾氣冷凝管路，連接通氣管路，插入溫度電極，連接 pH 和溶氧電極。打開冷卻水進出水管，設(shè)定過程參數(shù)：直接點擊觸控屏上的相關(guān)參數(shù)即進入設(shè)定界面，直接手動輸入即可設(shè)定溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)，并可設(shè)置手動或自動控制。將溫度設(shè)置成“自動”，夾套進水讓培養(yǎng)基冷卻，打開通氣冷凝，調(diào)節(jié)空氣流量轉(zhuǎn)子調(diào)整適當?shù)耐饬浚葏?shù)穩(wěn)定后，進入溶氧標定界面標定溶氧斜率為 100%后，即可進入發(fā)酵過程。5. 接種旋松接種口，在火焰保護下，打開接種口，倒入種子，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。  6. 取樣接種時取第一個樣，每隔 12 小時取一次樣，每次取 10m

8、l 左右（用 15ml 離心管取并記錄取樣體積） 。將取樣管放入廢液瓶，松開取樣管彈簧夾，捏緊平衡管，當取樣管內(nèi)殘液放去15mL左右后用取樣瓶接收樣品，取樣結(jié)束后松開平衡管并夾住取樣管。如取樣困難，可以夾住排氣管，增加罐壓，加速取樣。 7. 下罐和清洗 發(fā)酵 6 天后（或還原糖含量<1%）發(fā)酵結(jié)束，進行下罐和清洗，將溫度設(shè)定設(shè)置為手動，除去溫度電極停止加熱，關(guān)閉通氣、冷凝，流加管等拔掉，把溶氧電極和 PH 電極拔掉清洗干凈收好。把發(fā)酵液倒掉并清洗。 三、實驗結(jié)果1.還原糖測定的標準曲線的制定1) 標糖的配制：將烘干至恒重的葡萄糖（在 80烘箱中過夜）稱取 0

9、.5g，溶解于250mL容量瓶中（2mg/ml），標糖必須現(xiàn)配現(xiàn)用； 2) 標糖的加樣：標糖0.1mL0.2mL0.3mL0.4mL0.5mL0.6mL0.7mL0.8mL0.9mL1.0mL水0.9mL0.8mL0.7mL0.6mL0.5mL0.4mL0.3mL0.2mL0.1mL0.1mL糖濃度（mg/ml）0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.03) 將上面表格添加的試管中（25mL 規(guī)格）加入 3mLDNS 試劑，沸水浴 5min，取出后，加去離子水補至 25mL，冷卻混勻后，在可見光分光光度計 550nm，測出被測溶液的吸光度；結(jié)果如下： 糖濃度（mg/mL）0.

10、20.40.60.81.01.21.41.61.8OD值0.16340.36030.54030.71350.89691.07361.26521.45841.61434) 以葡萄糖濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，做出標準曲線，計算回歸方程。方程如下：表.標準曲線及方程2.實際樣品的還原糖測定取50l樣品，加1950l無菌水，加入 3mL 的 DNS，方法與標準曲線的測定一樣。根據(jù)所測到的吸光值，代入標準曲線的回歸方程，再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得到殘?zhí)呛浚╣/L）。時間（h）024487296120144168OD值0.82580.72050.58050.43150.14820.25380.224

11、50.2948稀釋后含量(g/L)0.92010.80430.65030.48650.17490.29100.25880.3361殘?zhí)呛浚╣/L）36.804632.172226.013419.45856.995611.641210.352213.4448表1.實際樣品中還原糖的測定3.纖維素產(chǎn)量測定 離心后的沉淀物抽濾到定量濾紙上（事先將定量濾紙置于烘箱中 105烘干約 1h，冷卻至室溫后稱重記為W1）并放于 105烘箱中烘干至恒重（一般 12天），稱重記為W2，即可計算出所取樣品中細菌纖維素粗產(chǎn)物量為W2 W1（g/L）。至發(fā)酵結(jié)束，即可繪制出纖維素產(chǎn)量隨時間的動態(tài)變

12、化。 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液倒出測量體積，同樣方法離心收集沉淀產(chǎn)物并于 105烘干稱重。也可算得該罐產(chǎn)量（g/L） 。注意罐壁和攪拌結(jié)構(gòu)上粘附的產(chǎn)物也要收集，減少損失。 時間（h）024487296120144168取樣體積（ml）12.712.613.112.512.012.712.813.2濾紙質(zhì)量W1(g)0.50580.51140.50730.50990.51220.51130.52500.5177樣品質(zhì)量W2(g)0.50580.51580.57520.60400.58030.57790.56370.6046凈重（g）00.00440.06790.09410.068

13、10.06660.03870.0869濃度（g/L）00.34925.18327.52805.67505.24413.02346.5833表2.實際樣品中纖維素含量的測定圖1.殘?zhí)呛孔兓韴D2：纖維素產(chǎn)量變化表編號濾紙質(zhì)量（g）樣品質(zhì)量（g）凈重（g）10.51531.90371.388420.52062.26681.746230.51682.18021.663440.51462.00161.48750.51312.18221.669160.51842.13611.617770.51891.90731.388480.5211.70581.184890.51532.33111.8158100.51242.17191.6595總重5.166420.786715.6203表3.總纖維素量的測定經(jīng)測量，發(fā)酵液的總體積為：1.52L所以該罐的產(chǎn)量為=總質(zhì)量/總體積=15.6203g/1.52L=10.2765g/L四、分析與討論1.對取樣樣品進行還原糖的測定從96h至168h，還原糖