實驗十三 螺旋體檢驗(1稿)

1、實驗十三 螺旋體檢測一、臨床意義1、螺旋體(Spirochaeta)廣泛分布在自然界和動物體內(nèi)，分5個屬：包柔氏螺旋體屬（Borrelia），又名疏螺旋體屬，密螺旋體屬（Treponema），鉤端螺旋體屬（Leptospira），脊螺旋體屬（Cristispira），螺旋體屬（Spirochaeta）。前三屬中有引起人患回歸熱、梅毒、鉤端螺旋體病的致病菌，后二屬不致病。梅毒螺旋體（Treponema Pallidun）是人類梅毒的病原體，主要經(jīng)性接觸直接傳染，也可通過接觸污染物、手術(shù)、輸血等途徑傳染?；济范镜脑袐D可通過胎盤感染胎兒，致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)或患先天性梅毒。人體感染梅毒螺旋體后，體內(nèi)可產(chǎn)

2、生多種抗體（抗類脂質(zhì)抗體、抗梅毒螺旋體抗體等），其中一類是特異性制動抗體，為lgM，當(dāng)有補體存在和厭氧條件下，對活螺旋體的動力有抑制作用，并可將螺旋體殺死或溶解，對機體的再感染有保護作用；另一類是反應(yīng)素，為lgA與lgM的混合物，可與正常生物組織中的類脂抗原發(fā)生非特異性結(jié)合，對人體無保護作用。用血清學(xué)試驗檢測這些抗體，對診斷梅毒有意義。但梅毒血清學(xué)試驗陽性，只能提示有反應(yīng)素或抗梅毒螺旋體抗體存在，不能作為患者感染梅毒螺旋體的絕對依據(jù)，陰性結(jié)果也不能排除梅毒螺旋體感染，檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床綜合分析。用活的或死的梅毒螺旋體或其他成分作為抗原檢查抗梅毒螺旋體抗體 這種方法敏感性及特異性都高，用于證實試

3、驗，尤其適用晚期梅毒。但血和腦脊液行RPR試驗均為陰性者，由于這類方法檢測的是抗梅毒螺旋體IgG抗體 即使患者已經(jīng)經(jīng)過充分的治療 IgG抗體仍保持陽性，所以不能用以觀察療效、復(fù)發(fā)及再感染。 熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS試驗)：用間接免疫熒光法檢查血清中抗梅毒螺旋體抗體 梅毒螺旋體抗體微量血凝試驗(MHA-TP)：用梅毒螺旋體提取物致敏的紅細胞微量血凝分析法檢查相應(yīng)的抗梅毒螺旋體抗體 其滴度在180以上則可判定為抗體陽性 此試驗的特異性與敏感性均高 而且方法比FTA-ABS試驗簡便 故應(yīng)用廣泛 梅毒螺旋體制動試驗(TPI)：活的梅毒螺旋體加入患者血清 在補體參與下 梅毒螺旋體活動可受

4、到抑制 臨床上主要采用RPR和TPHA 兩種方法檢測，RPR的敏感性和特異性均低于TPHA檢測。這主要是由于RPR是非特異性試驗，受某些自身抗體免疫疾病和傳染病的影響，常常會出現(xiàn)假陽性. 同時，RPR試驗對一期梅毒早期、治療后梅毒及潛伏性梅毒往往出現(xiàn)假陰性 ，因此它的敏感性和特異性有一定的局限性，且肉眼判斷易受檢驗者主觀因素的影響。而TPHA檢測特異性強，靈敏度高，并可實現(xiàn)自動化、標(biāo)準(zhǔn)化，適應(yīng)大量標(biāo)本的檢測。梅毒是由梅毒螺旋體引起的慢性感染性疾病。梅毒螺旋體可以通過接吻、哺乳、性接 觸、胎盤或接觸有傳染性的患者的日常用品等方式而傳染。在性傳播疾病中，梅毒的患者 數(shù)相對較低，但由于其病程長，危害

5、性大，早期檢出具有一定的意義。獲得性梅毒分三期： 第一期（初期）梅毒，下疳分泌物中有大量螺旋體，傳染性極強；第二期梅毒，梅毒疹及淋巴 結(jié)中有大量螺旋體；第三期（晚期）梅毒，病灶中螺旋體數(shù)量很少。梅毒螺旋體在體外不易 培養(yǎng)，至今尚不能在無生命的培養(yǎng)基上生長，也不能用常規(guī)方法染色，可通過直接鏡檢和血 清中抗體進行實驗室檢測。實驗室常用的檢測方法有：梅毒螺旋體暗視野顯微鏡檢查法， 非密螺旋體抗原試驗（初篩試驗）和梅毒螺旋體抗原試驗（確證試驗）等，不同的感染階段應(yīng) 選用不同的檢測方法。2、鉤端螺旋體病是由鉤端螺旋體所致的一種自然疫源性疾病。鉤端螺旋體在自然界廣泛存在，尤其是在降雨量多的熱帶國家，它可在

6、淡水、潮濕的土壤、植物和淤泥存活很久，可感染人類、野生動物和家畜（尤其是嚙齒目動物）。動物受感染后，大多無癥狀而呈帶菌狀態(tài)，但鉤體可以在腎中長期存在并繁殖，從尿中排菌，污染水源、食物和土壤。人類若接觸被鉤體污染的水源、食物、土壤，鉤體可經(jīng)皮膚破損處、黏膜表面（譬如眼睛或鼻子）進入人體，引起鉤體病，大雨后的洪水有助將細菌在周圍環(huán)境傳播，但一般不會在人與人之間傳播。疾病潛伏期是2天到4個星期。病情可持續(xù)幾天到3個星期或更久。征狀包括發(fā)高燒、嚴重頭痛、冷顫、肌肉疼痛和嘔吐，亦可能出現(xiàn)黃疸(眼球和皮膚呈黃色)、紅眼、肚痛、腹瀉或出疹。如果病人不及早接受治理，可能會出現(xiàn)腎臟損傷、腦膜炎、肝臟功能衰竭和呼

7、吸困難；有些罕見的例子更會導(dǎo)致死亡。 二、螺旋體的檢驗程序（一）梅毒螺旋體檢驗程序滲出液、皮疹、淋巴結(jié)或組織穿刺液等直接鏡檢 鍍銀染色檢查 血清學(xué)檢查 暗視野檢查 圖13-1 梅毒螺旋體檢驗程序（二）鉤端螺旋體檢驗程序血液、尿液、腦脊液等直接鏡檢 分離培養(yǎng) 動物接種（豚鼠） 血清學(xué)檢查 觀察發(fā)病情況 暗視野檢查 鍍銀染色檢查 抽心血 顯微鏡凝集試驗等暗視野檢查圖13-2 鉤端螺旋體檢驗程序三、試驗?zāi)康囊螅}前空二格，五號宋體加粗）1熟悉梅毒螺旋體、鉤端螺旋體的形態(tài)特征、暗視野及其染色檢查方法。2掌握梅毒螺旋體的血清學(xué)篩選和證實試驗的原理、方法、臨床意義。3熟悉鉤端螺旋體的培養(yǎng)特性、分離培養(yǎng)方

8、法。4了解鉤端螺旋體顯微鏡凝集試驗原理、方法、結(jié)果判定。四、器材與試劑（題前空二格，五號宋體加粗）1培養(yǎng)基：柯氏（Korthof）培養(yǎng)基、含100400g/ml 5-氟尿嘧啶（5-Fu）的柯氏培養(yǎng)基等。2試劑：與上述菌種同型的鉤體抗血清。RPR試劑盒、FTA-ABS試劑盒、ELISA試劑盒等。馮泰那（fantana）鍍銀染色液，負染色液(2%剛果紅、1%鹽酸酒精)。3其他：暗視野顯微鏡、無菌吸管、熒光顯微鏡、水浴箱、載玻片等。載玻片、牙簽、生理鹽水、暗視野顯微鏡等。暗視野顯微鏡、試管、吸管、滴管、載玻片、蓋玻片、生理鹽水、火柴、酒精燈、接種環(huán)、記號筆、吸水紙、擦鏡紙、二甲苯、香柏油等。4已知血

9、清型的鉤瑞螺旋體液體培養(yǎng)物。五、步驟與方法（題前空二格，五號宋體加粗）（標(biāo)題層次詳見編寫須知）（一）采集標(biāo)本：1、期梅毒患者取硬下疳潰瘍滲出液，期梅毒取梅毒疹滲出液或局部淋巴結(jié)抽出液，用于直接鏡檢。2、疑似鉤體患者血，尿標(biāo)本；發(fā)病10日內(nèi)取血液，2周后取尿液，有腦膜刺激癥狀者取腦脊液。3、采集病人靜脈血液，分離血清進行血清學(xué)診斷（二）染色及形態(tài)觀察螺旋體細長、柔軟、彎曲呈螺旋狀的運動活潑的單細胞原核生物。全長3500微米，具有細菌細胞的所有內(nèi)部結(jié)構(gòu)。由核區(qū)和細胞質(zhì)構(gòu)成原生質(zhì)圓柱體，柱體外纏繞著一根或多根軸絲。軸絲的一端附著在原生質(zhì)圓柱體近末端的盤狀物上，原生質(zhì)圓柱體和軸絲都包以外包被，軸絲相互

10、交疊并向非固著端伸展，超過原生質(zhì)圓柱體，類似外部的鞭毛，但具外包被。在生物學(xué)上的位置介于細菌與原蟲之間。它與細菌的相似之處是：具有與細菌相似的細胞壁，內(nèi)含脂多糖和胞壁酸，以二分裂方式繁殖，無定型核（屬原核型細胞），對抗生素敏感；與原蟲的相似之處有：體態(tài)柔軟，胞壁與胞膜之間繞有彈性軸絲，借助它的屈曲和收縮能活潑運動，易被膽汁或膽鹽溶解。在分類學(xué)上由于更接近于細菌而歸屬在細菌的范疇。用暗視野顯微鏡觀察含活菌的新鮮標(biāo)本，可看到運動活潑的螺旋體。運動有三種類型：繞螺旋體的長軸迅速轉(zhuǎn)動、細胞屈曲運動以及沿著螺旋形或盤旋的線路移動。橫斷分裂繁殖；化能異養(yǎng)；好氧、兼性厭氧或厭氧；自由生活、共棲或寄生。1、梅

11、毒螺旋體形態(tài)觀察：（1）原理：依據(jù)梅毒螺旋體的生物學(xué)基本特征。梅毒螺旋體（Treponema Pallidun）是梅毒的病原體，因其透明，不易著色，故又稱蒼白螺旋體。梅毒螺旋體細長，515×0.10.2um，形似細密的彈簧，螺旋彎曲規(guī)則，平均814個，兩端尖直。電鏡下顯示梅毒螺旋體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從外向內(nèi)分為：外膜（主要由蛋白質(zhì)、糖及類脂組成）、軸絲（主要由蛋白質(zhì)組成）、圓柱形菌體（包括細胞壁、細胞膜及胞漿內(nèi)容物）；一般染料不易著色。梅毒螺旋體有生活發(fā)育周期，分為顆粒期、球形體期及螺旋體期，平均約30小時增殖一代，發(fā)育周期與所致疾病周期、隱伏發(fā)作及慢性病程有關(guān)。未經(jīng)染色的梅毒螺旋體在普通光

12、學(xué)顯微鏡下不易看清，如將顯微鏡換裝上特制的暗視野集光器，該集光器中央不透光，光線只能從周圍邊緣斜射出來，由反光鏡庋射的光線不能直接上升進入鏡筒，故背景黑暗無光，但斜射到菌體上的光線由于散射作用進入物鏡，即在暗視野顯微鏡下，黑暗的視野上可看到具有螺旋狀及特征性運動方式發(fā)光的螺旋體。（2）方法 取滲出液涂片后直接于暗視野顯微鏡下觀察，或采取初期及二期梅毒硬性下疳、梅毒疹的滲出物等用暗視野或墨汁顯影，如查見有運動活潑的密螺旋體即可診斷；或鍍銀染色鏡檢。暗視野顯微鏡觀察法1）制作玻片：先在玻片上加無菌鹽水1滴，用無菌鹽水棉球擦凈病變部位，用鈍刀刮破病損處表面組織（避免出血），再用棉球擦干擠壓周圍組織使

13、組織液滲出，用毛細管吸取下疳的滲出液，將組織滲出液與玻片上無菌鹽水混合，加蓋玻片后鏡檢。取自皮疹、淋巴結(jié)或組織穿刺液等也可用于檢查，但陽性率較低。2)打開暗視野顯微鏡，在聚光器上加一滴蒸餾水（濕式）。3)將玻片置于載物臺上。4)上升聚光器使蒸餾水接觸玻片的底部，先用低倍鏡調(diào)焦，再用高倍物鏡觀察。馮泰那鍍銀染色法：取玻片于中央加生理鹽水1滴，用牙簽取樣本少許與鹽水混勻做涂片；待涂片干燥后滴加固定液，固定1分鐘后，用水沖洗；滴加媒染劑，加熱至有蒸汽出現(xiàn)，作用0.5分鐘，水洗；加硝酸銀染液，微加溫，染色約0.5分鐘，水洗，待干鏡檢。剛果紅染色法（負染色法）：置2%剛果紅水溶液一小滴于載玻片上，用牙簽

14、取樣本與之混勻，涂布成均勻厚片，待干，以1%鹽酸酒精洗滌，待其自然干后鏡檢。 （3）結(jié)果判定在暗視野顯微鏡下，如有發(fā)光的典型螺旋狀螺旋體及特征性運動方式（旋轉(zhuǎn)運動、伸身移行、彎曲前行）為陽性結(jié)果。直接鏡檢適用于初期梅毒的檢查，如見形態(tài)特征典型，有特殊運動方式的密螺旋體，結(jié)合臨床癥狀及病史，可初步報告：“找到彈簧狀螺旋體（疑為梅毒螺旋體）”。直接涂片鏡檢可見梅毒螺旋體移行、屈伸、翻滾等運動方式。鍍銀染色可見背景呈淡黃褐色，梅毒螺旋體呈棕褐色，菌體小而纖細，中間略粗，兩端尖直，有814個規(guī)則的、緊密纏繞的螺旋。經(jīng)馮泰那鍍銀染色，形態(tài)為疏螺旋體，即在油鏡下梅毒螺旋體呈棕褐色或棕黑色，菌體直硬、兩端尖

15、直，螺旋較細密而規(guī)則。經(jīng)剛果紅染色法，螺旋體無色，背景為藍色。螺旋體顯微鏡下形態(tài)見表13-1。 2、鉤端螺旋體形態(tài)觀察：（1）原理：依據(jù)鉤端螺旋體的生物學(xué)基本特征。渡銀染色的鉤端螺旋體鏡下背景呈淡黃褐色，鉤端螺旋體經(jīng)渡銀染色后呈棕褐色，菌體如小珍珠般連接成的細鏈，一端或兩端彎曲如鉤狀，使菌體呈S或C形。在黑暗的背景中可見鉤體閃爍發(fā)光，一端或兩端彎曲成鉤狀，運動活潑，呈現(xiàn)翻轉(zhuǎn)、滾動等運動特征。（2）方法 鉤端螺旋體暗視野顯微鏡觀察 1)取鉤鉤端螺旋體培養(yǎng)物制成壓滴標(biāo)本。 2)在暗視野聚光器上滴加鏡油，將標(biāo)本片置載物臺上，上升聚光器使鏡油與標(biāo)本片緊密接觸。先用低倍鏡對光，至能清楚觀察到標(biāo)本中的物體

16、為止。然后在標(biāo)本上滴加鏡油。用油鏡觀察。 鉤端螺旋體fantana鍍銀染色檢查 1)取清潔玻片一張，加鉤端螺旋體培養(yǎng)物一滴。 2)待涂片自然干燥后滴加固定液，固定1min，用無水乙醇沖洗。 3)滴加媒染劑，加溫至有蒸汽冒出，作用30s，水洗。 4)加硝酸銀染液，微加溫，染色約30s，水洗，待干鏡檢。鉤端螺旋體負染色法（剛果紅法）檢查取20%剛果紅水溶液一滴于載玻片上，加鉤端螺旋體培養(yǎng)物與之混勻，涂布成均勻厚片，待干，以1%鹽酸酒精洗滌沖洗至藍色，待其自然干后鏡檢。（3）結(jié)果觀察鍍銀染色結(jié)果的形態(tài)特征：鏡下背景為淡黃褐色，鉤端螺旋體呈棕褐色或棕黑色，一端或兩端呈鉤狀彎曲，呈S或C形，細密的螺旋看

17、不清楚。暗視野顯微鏡觀察結(jié)果 在黑的背景上，可見鉤體像一串發(fā)亮的微細珠粒，一端或兩端彎曲成鉤狀，有時菌體屈曲呈“S或C”等字型，以長軸為中心，做回旋運動，或以波浪式朝直端方向前進。負染色法（剛果紅法）結(jié)果 油鏡下鉤端螺旋體無色，背景藍色。表13-1 螺旋體顯微鏡下形態(tài)馮泰納鍍銀染色吉姆薩染色暗視野顯微鏡觀察鉤端螺旋體鏡下背景為淡黃褐色至棕黑色，菌體為棕褐色，一端或兩端呈鉤狀彎曲，珍珠點狀連接成S或C形螺旋體，螺旋不太清楚，表體整齊，粗細均勻取鉤端螺旋體培養(yǎng)物制成壓滴標(biāo)本，在黑暗的背景上可見鉤體閃爍發(fā)光，一端或兩端彎曲成鉤狀，運動活潑，出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)、滾動等運動。梅毒螺旋體與鉤端螺旋體呈色相似。其特征

18、為小而纖細，兩端尖直，有812個規(guī)則彎曲且纏繞緊密?；貧w熱螺旋體螺旋體為紫紅色或紅色，纖細柔軟，有48個稀疏而不規(guī)則彎曲。（三）分離培養(yǎng)1981年，F(xiàn)ieldsteel等采用棉尾兔單層上皮細胞，在微氧條件下培養(yǎng)成功，在人工培養(yǎng)基上尚不能培養(yǎng)。梅毒螺旋體一般不進行培養(yǎng)，鉤端螺旋體分離培養(yǎng)方法如下：（1）血液標(biāo)本的培養(yǎng) 采集可疑鉤端螺旋體病人發(fā)病第一周內(nèi)的靜脈血液23ml，取血液標(biāo)本0.250.5ml接種于5ml的柯氏（ Korthof）液體培養(yǎng)基中，血液量與培養(yǎng)液的比例以1: 101：20為宜。（2）尿液標(biāo)本的培養(yǎng) 采集可疑鉤端螺旋體病人發(fā)病第一周后（發(fā)病25周內(nèi)）的尿樣（無菌尿或中段尿），立即

19、接種或者經(jīng)低溫離心（10、4000r/min離心30min）后，取沉淀物接種于5-Fu的柯氏液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中的5-Fu可抑制尿液中的雜菌）。（3）培養(yǎng)：每份標(biāo)本應(yīng)接種23管平行樣，將培養(yǎng)基置28恒溫箱培養(yǎng)12周。(4)結(jié)果觀察：從分離培養(yǎng)的第三天起，每天或每隔35天，用暗視野顯微鏡檢查一次；大部分陽性標(biāo)本可在714天有生長表現(xiàn)（一般在培養(yǎng)的第710天為繁殖高峰）。如果培養(yǎng)基液面部分呈現(xiàn)出半透明、云霧狀混濁，輕輕搖動可見絮狀物泛起，則疑為鉤端螺旋體生長，可進一步進行鑒定；若培養(yǎng)四周無鉤體生長，則為陰性。（四）血清學(xué)檢驗1、梅毒螺旋體的血清學(xué)診斷（1）原理 梅素螺旋體有三類抗原成份。一是螺旋體

20、表面特異性抗原：刺激機體產(chǎn)生特異的凝集抗體及密螺旋體制動或溶解抗體，后者加補體可溶解螺旋體。二是螺旋體內(nèi)類屬抗原：可產(chǎn)生補體結(jié)合抗體，與非病原性螺旋體有交叉反應(yīng)。三是螺旋體與宿主組織磷脂形成的復(fù)合抗原：當(dāng)螺旋體侵入組織后，組織中的磷脂可粘附在螺旋體上，形成復(fù)合抗原，此種復(fù)合抗原可刺激機體產(chǎn)生抗磷脂的自身免疫抗體，稱為反應(yīng)素（Aegagin），可與牛心肌或其他正常動物心肌提取的類脂質(zhì)抗原起沉淀反應(yīng)（康氏試驗）或補體結(jié)合反應(yīng)（華氏試驗）。其中，第一類是特異性抗體（抗TP抗體），后兩類為抗類脂質(zhì)的非特異性抗體。（2）方法快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR）：是利用吸附于活性炭顆粒上的類脂質(zhì)抗原（由從

21、牛心肌中提取的心磷脂、膽固醇和卵磷脂組成的RPR抗原，與梅毒螺旋體有共同抗原），可與患者血清中的反應(yīng)素結(jié)合，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。（當(dāng)血清在RPR卡片的圓圈中混合，如出現(xiàn)碳粒凝集說明是陽性血清）。此類試驗采用的抗原是非特異性類脂質(zhì)，檢測成本低，簡易快速，不需顯微鏡，可進行半定量檢測，易于觀察結(jié)果，適合于大量人群的血清篩選。但敏感性、特異性較差，有時會出現(xiàn)生物學(xué)假陽性和假陰性反應(yīng)，容易造成漏檢和誤檢，所以不用于一期梅毒、先天性梅毒、神經(jīng)梅毒的診斷。目前，國內(nèi)常用RPR和TRUST這兩種試驗。根據(jù)情況選用其中一個進行梅毒螺旋體抗體篩選試驗。1）取待檢血漿或血清、陽性控制血清、陰性控制血清各50l，分別加入

22、到卡片的三個圓圈內(nèi)，并使血清擴散到整個圓圈內(nèi)。（每張卡片應(yīng)有10個或12個反應(yīng)圈），2）在每份血清上滴加1滴RPR抗原。3）旋動卡片8min（約100r/min），立即觀察結(jié)果。4）在RPR白色卡片上觀察有無黑色凝集顆?；蛐跗?。無凝集為陰性結(jié)果（陰性血清反應(yīng)圈內(nèi)不出現(xiàn)黑色碳顆粒凝集），出現(xiàn)明顯黑色凝集顆?；蛐跗瑸殛栃裕栃匝宸磻?yīng)圈內(nèi)可出現(xiàn)明顯黑色凝集碳顆粒或絮片）。定性試驗呈陽性的標(biāo)本，如需要可將血清作1:21:32等6個稀釋度的倍比稀釋，然后按上述定性試驗方法再做半定量試驗，再記錄出現(xiàn)陽性（+）反應(yīng)的最高血清稀釋倍數(shù)，即抗體效價。甲苯胺紅不加熱血清試驗( TRUST)：是將從牛心肌中提取的

23、心磷脂、膽固醇、卵磷脂組成的性病研究室抗原重懸于含有特制的甲苯胺紅溶液制成，可與血清中的抗類脂質(zhì)抗體反應(yīng)素結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊。該試驗為篩選試驗。操作方法：按試劑盒說明書進行。（1）取待檢血清、陽性控制血清、陰性控制血清各50l，加入試驗卡的圓圈內(nèi)，并擴散到整個圈內(nèi)。（2）在每份血清上滴加1滴抗原試劑。（3）旋轉(zhuǎn)搖動8min，速度約lOOr/min，立即用肉眼觀察結(jié)果。（4）甲苯胺紅不加熱血清試驗結(jié)果 在試驗卡上，陰性質(zhì)控血清反應(yīng)圈內(nèi)不出現(xiàn)紅色凝集，呈均勻分散狀態(tài)。陽性質(zhì)控血清反應(yīng)圈內(nèi)可出現(xiàn)明顯紅色顆粒凝集成快。參照質(zhì)控血清即可判斷患者血清的試驗結(jié)果。如果試驗為陽性，可在試驗卡上將血清作

24、1:21:32等6個稀釋度，然后按上述試驗方法再做半定量試驗。這兩種試驗（RPR和TRUST）是非螺旋體抗原試驗。是用正常牛心肌的心類脂（Cardiolipin）作為抗原，檢測病人血清中的反應(yīng)素。國際上常用性病研究實驗室（UDRL）的玻片試驗法；該法是一種簡單的玻片沉淀試驗，試劑及對照已標(biāo)準(zhǔn)化。另外，還可用不加熱血清反應(yīng)素試驗（USR），其抗原是UDRL抗原的改良，敏感性和特異性與UDRL相似。反應(yīng)素在第一期梅毒病變出現(xiàn)后12周就可測出，第二期陽性率幾乎達100，第三期陽性率較低。雖敏感性較高，但所用抗原是非特異性類脂抗原，除梅毒病以外，其他螺旋體?。ㄑ潘尽⒒貧w熱）、麻風(fēng)、紅斑狼瘡、非典型肺炎

25、、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肝硬化等亦可查出反應(yīng)素，稱梅毒血清生物學(xué)假陽性。檢測的抗體時應(yīng)排除假陽性反應(yīng)，結(jié)合病史，臨床表現(xiàn)及多次的試驗結(jié)果進行分析。為進一步確證梅毒的感染，需做如下血清學(xué)檢驗。即以梅毒螺旋體為抗原，以檢測血清中的特異性抗體，該試驗特異性高，目前常用下述兩種方法。一種是梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）、一種是熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTAABS），其敏感性和特異性均高，常用于梅毒的早期診斷。 明膠顆粒凝集試驗（TPPA）：(1)原理 將梅毒螺旋體Nichols株的精制菌體成分包被于人工載體明膠顆粒上，這種致敏的顆粒一旦與被檢查樣品中的抗梅毒抗體相遇時，即可產(chǎn)生肉眼可見的凝集顆粒（p

26、article agglutination test ,PA法）。由此可以檢測人血清或血漿中的梅毒螺旋體特異性抗體，并且可用來測定抗體效價。(2)方法 按試劑盒說明書進行。定性試驗只做4孔，半定量試驗做10孔（表13-2）。1）用微量加樣器加標(biāo)本稀釋液至反應(yīng)板。2）用微量加樣器加待檢血清至第1孔，混勻后進行倍比稀釋。3）用試劑盒內(nèi)專用滴管于第3孔加未致敏粒子25l，第4孔至最后一孔加致敏粒子25l。4）將反應(yīng)板置震蕩器震蕩30s，或用手輕輕拍打混勻。5）加蓋后于室溫(1825)水平靜置，2h4h后觀察結(jié)果。 表13-2 TPPA試驗操作程序表 孔號_ _ _1 2 3 4 5 6 7 8 9

27、10 標(biāo)本稀釋液（l） 100 25 25 25 25 25 25 25 25 25待檢血清（l） 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25棄25 標(biāo)本稀釋倍數(shù) 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560未致敏粒子(l) 25致敏粒子（l） 25 25 25 25 25 25 25標(biāo)本最終稀釋度 1:40 l:80 1:160 1:320 l:640 1:1280 1:2560 1:51206）明膠顆粒凝集試驗結(jié)果 血清在1：80以上稀釋度與致敏顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)（+）與未致敏顆粒（第3孔）不發(fā)生凝集反應(yīng)者為陽

28、性反應(yīng)；血清與致敏顆粒和未致敏顆粒均不發(fā)生凝集反應(yīng)者為陰性反應(yīng)。-（不凝集）：明膠顆粒集中在孔中央，呈紐扣狀，邊緣光滑；±（可疑）：明膠顆粒濃集呈邊緣光滑、圓整的小圓環(huán)：+（凝集）：明膠顆粒形成較大的環(huán)狀凝集，外周邊緣不光滑：+（強凝集）：明膠顆粒覆蓋在整個孔底，呈多形性膜狀，邊緣粗糙。陽性結(jié)果判定：第三孔為陰性（-）、第四孔為陽性(+)時，以顯示反應(yīng)為陽性(+)時的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價。陰性結(jié)果判定：無論第三孔呈現(xiàn)何種反應(yīng)，只要第四孔的反應(yīng)顯示為陰性（-），最終判斷即為陰性?？梢桑旱谌诪殛幮裕?）、第四孔為可疑(±)時，最終判斷為可疑。結(jié)果為可疑時，需要用FTA

29、ABS等其他方法進一步復(fù)檢。熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）：此法是間接熒光抗體法，將待檢血清先用非致病性密螺旋體進行吸收，除去能與梅毒螺旋體發(fā)生非特異性結(jié)合的抗體成分。經(jīng)吸收處理的血清，在玻片上與梅毒螺旋體抗原結(jié)合，再加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體，于熒光顯微鏡下觀察，若有發(fā)熒光的螺旋體即為陽性。方法：1）制備抗原片 用Nichols株梅毒螺旋體（每高倍鏡視野20條）抗原懸液，在玻片上涂數(shù)個直徑為5mm的菌膜，待干后用甲醛（醇）固定。2）待檢血清預(yù)處理：待檢血清先經(jīng)5630min滅活，取50l血清與200l吸附劑（Reiter株非致病性密螺旋體）混勻，37作用30min，以充分吸除

30、非特異性抗體。3）熒光染色 吸附后的待檢血清用PBS液作1:201:320的倍比稀釋，將已稀釋的血清分別滴加于抗原片上，置于濕盒內(nèi)37作用30min，然后將玻片在PBS液中浸洗，換液3次，每次5min，吸水紙吸干。于各抗原反應(yīng)片上滴加熒光素標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，置濕盒內(nèi)37作用30min，再用PBS液洗片（方法如前），待玻片干后用甘油緩沖液封片。試驗同時，應(yīng)設(shè)陽性、陰性及非特異性血清對照。陰性標(biāo)準(zhǔn)血清無熒光菌體或偶見熒光菌體出現(xiàn)；陽性對照可見多數(shù)（高倍視野15條）熒光菌體出現(xiàn)。并以此為參照作出待檢標(biāo)本的判定。4）觀察結(jié)果 將染色片置于熒光顯微鏡下，熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）參

31、照陽性標(biāo)準(zhǔn)血清的熒光強度判定結(jié)果。每高倍鏡視野若半數(shù)（10條左右）出現(xiàn)熒光，則為+；多于半數(shù)（15條左右）出現(xiàn)熒光，則為+；全部（約20條）出現(xiàn)強熒光，則為+?！翱梢伞苯Y(jié)果參照非特異性血清的熒光強度判定為+或+，陰性結(jié)果參照陰性對照血清判定為-或+。凡+者，可確證為梅毒螺旋體感染。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：采用雙抗原夾心法。將高度純化的TP抗原包被反應(yīng)板之后加入待測血清，若待測血清中存在TP抗體，則與TP抗原特異性結(jié)合。再加入酶標(biāo)記的高純度TP抗原，即在固相載體上形成“TP抗原-抗TP抗體-酶標(biāo)記TP抗原”夾心復(fù)合物，當(dāng)加入酶底物后，可呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。顏色深淺與血清中抗TP抗體成正比。方法

32、：1）分別取待測血清、陰性及陽性對照血清各50l，加于反應(yīng)板相應(yīng)凹孔中；每孔再加入酶標(biāo)記TP抗原各50l?；靹?，放3730min。2）取出反應(yīng)板，棄盡孔中液體。用洗滌液洗板6次，拍干液體。3）與每孔加酶底物各100l，放3715min后，加終止液50l。4）用酶聯(lián)儀于450nm波長處讀取吸光度值（A），以空白校零。分別測定陰性、陽性對照及待測血清的A值。結(jié)果 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 待測血清A值CO值，為陽性；待測血清A值CO值，為陰性。CO=0.20 + 陰性對照平均A值。陰性對照A值應(yīng)0.12，陽性對照A值應(yīng)0.30；陰性對照0.03時按0.03計算。梅毒螺旋體制運試驗（TPI）：

33、用來檢測血清中是否存在抑制螺旋體活動的特異性抗體。用活梅毒螺旋體（Nichol株）加病人新鮮血清，35培養(yǎng)16小時，同法作正常血清對照，然后用暗視野顯微鏡觀察活動的螺旋體數(shù)目，如試驗標(biāo)本活動的螺旋體數(shù)目小于或等于對照血清標(biāo)本內(nèi)的40%，即為陽性。2、鉤端螺旋體血清學(xué)檢驗（1）原理：鉤端螺旋體可與同型免疫血清結(jié)合產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清高倍稀釋時，鏡下可見鉤體呈蜘蛛樣凝集（數(shù)根鉤體的一端鉤連在一起，另一端呈放射狀散開）；當(dāng)血清作低倍稀釋時，血清中的補體可導(dǎo)致凝集的鉤體溶解破壞（血清中的補體使凝集的菌體在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生溶解），因而鏡下見鉤體呈殘絮狀、顆粒狀、蝌蚪狀。本試驗既可鑒定鉤體的型別，又可用于測定

34、病人血清中特異性抗體的效價。（2）方法 微孔板法顯微鏡凝集試驗1）稀釋血清：用生理鹽水將病人血清稀釋為1:50、1:100、1:150、1:200、1:400、1:800等，依次加入微孔板每排的16孔，100l/孔，第7孔加100l生理鹽水作為對照；所設(shè)稀釋血清排數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)株鉤體型的數(shù)目而定。2）加抗原：于每排各孔內(nèi)分別加入一種已知不同型別的鉤體培養(yǎng)液，100l/孔?；靹蚝笾?7作用2h。3）結(jié)果判斷 反應(yīng)結(jié)束后，取出微孔板，用毛細管取各孔中懸液1滴于潔凈載玻片上，覆以蓋玻片，在暗視野顯微鏡下觀察，以凝集情況與游離活動鉤體的比例來判定結(jié)果。-：鉤體正常分散存在，完全無凝集現(xiàn)象，與對照孔相同。+：

35、25%左右的鉤體凝集呈蜘蛛狀，75%的鉤體游離且運動活潑。+：50%左右的鉤體凝集呈蜘蛛狀，余50%的鉤體游離且運動活潑。+：75%左右的鉤體凝集或被溶解，呈蜘蛛狀、蝌蚪狀或塊狀，其余鉤體游離分散。+：幾乎全部鉤體溶解成蜘蛛狀或折光率較高的團塊及點狀，偶見極少活鉤體游離。血清效價按最終血清稀釋度計算。以出現(xiàn)+現(xiàn)象的最高血清稀釋度為該血清的凝集效價。凝集效價在1:300以上有診斷價值。根據(jù)待檢菌與相應(yīng)型別血清發(fā)生凝集反應(yīng)效價則可判定待檢菌的型別。顯微鏡凝集試驗方法見表13-3表13-3 顯微鏡凝集試驗方法1234567血清稀釋度15011001150120014001800對照被檢血清（l）10

36、0100100100100100生理鹽水（l）100鉤體培養(yǎng)液（l）100100100100100100100血清最終稀釋度110012001300140018001160037作用2h，暗視野顯微鏡觀察結(jié)果假定結(jié)果4+4+3+3+2+-（六）注意事項與小結(jié)1、使用暗視野顯微鏡觀察時，需注意：載玻片和蓋玻片應(yīng)清凈無污，載玻片宜薄，不超過1.2mm；聚光器的高度應(yīng)適當(dāng)，以背景較暗物象清晰為好；觀察完畢后將集光器上的鏡油拭凈；進行鍍銀染色時，銀染溫度不宜太高，時間不宜太長，否則會影響染色結(jié)果；應(yīng)多取組織液提高陽性率，但要盡量避免出血；取材后應(yīng)立即觀察，以免影響螺旋體的運動活力；注意觀察梅毒螺旋體的

37、形態(tài)及特有的運動姿態(tài)，以鑒別其他螺旋體；暗視野未發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體，不能排除梅毒感染，應(yīng)稍后復(fù)查或做血清學(xué)檢查；此法主要適用于初期梅毒的檢查，因患者下疳分泌物中有大量螺旋體。2、RPR和TRUST試劑盒勿冰凍，于28保存，使用前恢復(fù)至室溫；RPR抗原用時應(yīng)充分搖勻后垂直滴加；在規(guī)定時間內(nèi)及時觀察結(jié)果。本試驗僅為過篩試驗，陰性結(jié)果不能排除梅毒感染，陽性結(jié)果需進一步做抗梅毒螺旋體抗體試驗確認。3、FTA-ABS熒光染色洗片時，每浸洗1次后，必須換液；每次試驗均應(yīng)同時設(shè)陽性、陰性及非特異性血清對照。4、ELISA血清標(biāo)本應(yīng)新鮮、無污染；加入試劑力求準(zhǔn)確，一般用微量加樣器加樣；反應(yīng)板洗滌必須充分、徹底，以免影響判定結(jié)果；結(jié)果測定應(yīng)以酶聯(lián)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。5、試驗所用標(biāo)本、試劑及廢棄物應(yīng)按生物危險品進行處理。6、由于各種梅毒血清學(xué)檢測方法，并非都能在梅毒的不同病期檢測出抗類脂質(zhì)抗體或