實驗三-離心技術(shù)及酶學(xué)實驗ppt課件

1、目目 錄錄實驗三實驗三離心技術(shù)及離心技術(shù)及 酶學(xué)實驗酶學(xué)實驗?zāi)磕?錄錄v概念概念v 生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒( (細胞器、細胞器、生物大分子的沉淀等生物大分子的沉淀等) )以一定的速度沉降，從以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備。于各種生物樣品的分離和制備。目目 錄錄第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理v離心力離心力v 當一個

2、粒子當一個粒子( (生物大分子或細胞器生物大分子或細胞器) )在高在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F F由下式定義，即：由下式定義，即：rmamF2目目 錄錄v相對離心力相對離心力RCF）v 通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，所以稱為相對離心力。表示，所以稱為相對離心力。v 在離心場中，作用于顆粒的離心力相在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g980cm/s2）。）。目目 錄錄v RCF = 1.11910-5(rpm)2rv(rpm-revolut

3、ions per minute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min)v低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm來表示v高速離心時則以“g表示9802rRCF602rpm目目 錄錄第二節(jié)第二節(jié) 離心機的主要構(gòu)造和類型離心機的主要構(gòu)造和類型 工業(yè)用離心機離心機 制備性離心機 實驗用離心機 分析性離心機 目目 錄錄v一、制備性離心機的三類一、制備性離心機的三類v1 1 普通離心機：最大轉(zhuǎn)速普通離心機：最大轉(zhuǎn)速6000rpm6000rpm左左右右v2 2 高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速為高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速為2000020000v 25000rpm25000rpmr/minr/min）v3 3超速離心機：轉(zhuǎn)速可達超速離心機：轉(zhuǎn)速

4、可達500005000080000rpm80000rpm，v 超速離心機裝有真空系統(tǒng)，這是超速離心機裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離它與高速離 v 心機的主要區(qū)別。心機的主要區(qū)別。 目目 錄錄二、轉(zhuǎn)頭二、轉(zhuǎn)頭v1 1角式轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭 目目 錄錄v2 2蕩平式轉(zhuǎn)頭：蕩平式轉(zhuǎn)頭： v 這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4 4或或6 6個自由活動個自由活動 v 的吊桶的吊桶( (離心套管離心套管) )構(gòu)成。構(gòu)成。 v3 3區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭： v 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子v 桶和可旋開的頂蓋組成。桶和可旋開的頂蓋組成。 v4 4 垂直轉(zhuǎn)頭：垂直轉(zhuǎn)頭：v 其離心管

5、是垂直放置的。其離心管是垂直放置的。 v5 5 連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：v 轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口口和出口v 的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。目目 錄錄三、離心管三、離心管 v塑料離心管常用材料有聚乙烯塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)(PE)，聚碳酸，聚碳酸酯酯(PC)(PC)，聚丙烯，聚丙烯(PP)(PP)等，其中等，其中PPPP管性能較好。管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明塑料離心管的優(yōu)點是透明( (或半透明或半透明) )，硬度，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機

6、溶劑腐蝕性差，使用壽命短?？褂袡C溶劑腐蝕性差，使用壽命短。目目 錄錄v不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強腐蝕性抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強腐蝕性的化學(xué)藥品，如強酸、強堿等。的化學(xué)藥品，如強酸、強堿等。v離心管蓋離心管蓋v離心前必須蓋嚴，配平時需帶管蓋重量離心前必須蓋嚴，配平時需帶管蓋重量v防止樣品外泄、揮發(fā)防止樣品外泄、揮發(fā)v支持離心管，防止離心管變形支持離心管，防止離心管變形目目 錄錄v制備性超速離心的分離方法制備性超速離心的分離方法v差速沉降離心法差速沉降離心法v 逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替逐漸增加離心

7、速度，或者低速、高速交替進行離心，使不同的離心速度及不同離心時進行離心，使不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。間下分批分離的方法。v用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒v優(yōu)點：操作簡便優(yōu)點：操作簡便v缺陷：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活缺陷：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活目目 錄錄密度梯度區(qū)帶離心法區(qū)帶離心法）密度梯度區(qū)帶離心法區(qū)帶離心法）定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)分配到梯度中某些特定位置上

8、，形成不同區(qū)帶的分離方法。帶的分離方法。優(yōu)點：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不會優(yōu)點：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不會擠壓變形保持活性擠壓變形保持活性缺陷：離心時間長、需制備惰性梯度介質(zhì)溶缺陷：離心時間長、需制備惰性梯度介質(zhì)溶液、操作嚴格不易掌握液、操作嚴格不易掌握目目 錄錄五、離心操作的注意事項五、離心操作的注意事項v使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必單數(shù)的管子，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地

9、須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。v每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。目目 錄錄v裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕蝕; ;而制

10、備性超速離心機的離心管，則常常要求而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。凹陷變形。v若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。 v離心過程中不得隨意離開離心過程中不得隨意離開目目 錄錄實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容v酶的提取及比活性測定酶的提取及比活性測定目目 錄錄一、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的分離純化及比活性測定 目的目的 1 1掌握掌握AKPAKP分離

11、純化的實驗原理、方法分離純化的實驗原理、方法 及注及注意事項意事項 2 2了解檢測了解檢測AKPAKP活性測定的原理和方法?；钚詼y定的原理和方法。目目 錄錄v方法方法v酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì)酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì)v鹽析法鹽析法v有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法v層析法層析法v電泳電泳目目 錄錄酶酶組織細胞：先破碎細胞，組織細胞：先破碎細胞， 再用一定的試劑提取再用一定的試劑提取體液：直接提取體液：直接提取方法方法物理方法物理方法化學(xué)方法化學(xué)方法目目 錄錄v準繩準繩v制備的原料制備的原料v初期采用、后期采用方法初期采用、后期采用方法v影響因素影響因素目目 錄錄p影響因素影響因素ppH：最適：最適pHp溫度：低溫

12、時酶比較穩(wěn)定，有機溶劑需預(yù)冷溫度：低溫時酶比較穩(wěn)定，有機溶劑需預(yù)冷p氧化：氧化：SH對某些酶的活性必需，加入還原對某些酶的活性必需，加入還原劑劑p重金屬離子污染：與重金屬離子污染：與SH發(fā)生作用而失活：發(fā)生作用而失活：EDTAp蛋白酶的污染，蛋白酶的污染，PMSF、DFPp介質(zhì)的極性和離子強度：疏水介質(zhì)的極性和離子強度：疏水最穩(wěn)定最穩(wěn)定pHpH目目 錄錄v評估指標評估指標v酶的純度用比活性代表酶的純度用比活性代表v定義：單位重量定義：單位重量mg蛋白樣品中所含酶的活蛋白樣品中所含酶的活性單位性單位v表示方法：每表示方法：每mg蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位v測定方法：每測定方

13、法：每ml樣品中的蛋白質(zhì)樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù)數(shù)v 每每ml樣品中酶的活性單位樣品中酶的活性單位v酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時間秒、分鐘、酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時間秒、分鐘、小時內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物小時內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。所需要的酶量。目目 錄錄p酶的回收率酶的回收率p 提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴隨部分酶的損失。隨部分酶的損失。p 在保證純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的在保證純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的收率。收率。目目 錄錄( (一一) )堿性磷酸酶的分離提純堿性磷酸酶的分離提純 原理原理 機械破

14、碎法制備肝勻漿機械破碎法制備肝勻漿 勻漿液勻漿液 低濃度醋酸鈉：低滲破膜低濃度醋酸鈉：低滲破膜 低濃度醋酸鎂：保護和穩(wěn)定低濃度醋酸鎂：保護和穩(wěn)定AKP 有機溶劑沉淀法分離純化有機溶劑沉淀法分離純化AKP 加入不同有機溶劑，重復(fù)離心加入不同有機溶劑，重復(fù)離心 正丁醇：沉淀部分除正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) 33丙酮丙酮(30乙醇乙醇)：AKP溶解溶解 50丙酮丙酮(60乙醇乙醇)：AKP不溶解不溶解 目目 錄錄 操作步驟操作步驟 25g25g肝組織剪碎肝組織剪碎 +0.01M+0.01M醋酸鎂醋酸鎂- -醋酸鈉溶液醋酸鈉溶液75ml75ml，勻漿機中勻漿，勻漿機中勻漿取肝勻漿取肝勻漿

15、4ml(A4ml(A液）液） A1A1：?。喝?.1mlA0.1mlA液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性緩沖液，待測比活性A2A2：?。喝?.1mlA0.1mlA液液+4.9ml+4.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度生理鹽水，待測蛋白濃度 +2ml正丁醇，混勻正丁醇，混勻2min，室溫置，室溫置30min，離心，離心 （2500rpm)5min下清液汲?。┫虑逡杭橙。?沉淀棄）沉淀棄） +等體積丙酮，離心等體積丙酮，離心2000rpm)5min 上清液棄）上清液棄） 沉淀沉淀 +0.5M醋酸鎂醋酸鎂2ml溶解溶解B液）液）目目 錄錄 操作步驟操作步驟

16、 B B 液液 +95%+95%冷乙醇至冷乙醇至30%30%，離心，離心2500rpm2500rpm5min5min上清液汲?。┥锨逡杭橙。?沉淀棄）沉淀棄） + 95%+ 95%冷乙醇至冷乙醇至60%60%，離心，離心2500rpm2500rpm5min5min上清液棄）上清液棄） 沉淀沉淀 +0.01M +0.01M 醋酸鎂醋酸鎂- -醋酸鈉醋酸鈉2ml,2ml,溶解溶解C C液）液） C1C1：?。喝?.1mlC0.1mlC液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性緩沖液，待測比活性 C2C2：取：取0.1mlC0.1mlC液液+0.1ml+0.1

17、ml生理鹽水，待測蛋白濃度生理鹽水，待測蛋白濃度 B1B1：?。喝?.1mlB0.1mlB液液+1.9mlpH8.8Tris+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性緩沖液，待測比活性B2B2：取：取0.1mlB0.1mlB液液+0.9ml+0.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度生理鹽水，待測蛋白濃度目目 錄錄v加入有機溶劑計算公式加入有機溶劑計算公式v設(shè)加入設(shè)加入Xml95%乙醇乙醇v至終濃度至終濃度30%v 30%（B液體積液體積+X）=95%X v X=30%B液體積液體積95%-30%=0.462B液體積液體積v至終濃度至終濃度60%v 60%（上清液體積（上清液體積+X）30%上清液

18、體積上清液體積=95%Xv X=（60%-30%）上清液體積）上清液體積 95%-60%=0.867上清上清液體積液體積目目 錄錄 本卷須知本卷須知 各步加入有機溶劑量要準確。否則會影響整個各步加入有機溶劑量要準確。否則會影響整個實驗結(jié)果。實驗結(jié)果。操作要在低溫下進行操作要在低溫下進行加入有機溶劑時要慢慢滴加，充分攪拌，避免加入有機溶劑時要慢慢滴加，充分攪拌，避免局部濃度過高而引起升溫和變性。局部濃度過高而引起升溫和變性。加入有機溶劑混勻后不宜放置過久，應(yīng)立即離加入有機溶劑混勻后不宜放置過久，應(yīng)立即離心。心。離心析出的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即將溶于適量的緩離心析出的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即將溶于適量的緩沖液中

19、，以避免酶活力的喪失。沖液中，以避免酶活力的喪失。目目 錄錄( (二二) )堿性磷酸酶的比活性測定堿性磷酸酶的比活性測定 原理原理 比活性的定義比活性的定義單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位。單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位。通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位來表示。通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位來表示。用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純化成功與用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純化成功與否的評價指標之一。否的評價指標之一。目目 錄錄測定樣品的比活性必須測定：測定樣品的比活性必須測定：每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。每毫升樣品中的

20、蛋白質(zhì)毫克數(shù)。目目 錄錄磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶活性磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶活性 AKP 4- AKP 4-氨基安替比林氨基安替比林磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉 酚酚 醌衍生物紅色）醌衍生物紅色） 鐵氰化鉀鐵氰化鉀 根據(jù)紅色的深淺用比色法測定酚的含量。根據(jù)紅色的深淺用比色法測定酚的含量。3737保溫保溫1515分鐘產(chǎn)生分鐘產(chǎn)生1g1g酚者為酚者為1 1個酶活性單位。個酶活性單位。 目目 錄錄目目 錄錄考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量 回顧實驗原理實驗講義第回顧實驗原理實驗講義第6060頁）。頁）。目目 錄錄 操作步驟操作步驟 1.AKP 1.AKP活性單位測定活性單位測定 取試

21、管取試管5 5支，按下表操作：支，按下表操作：試劑（試劑（mlml）空白管空白管標準管標準管A AB BC0.04mol/L0.04mol/L基質(zhì)液基質(zhì)液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0pH10pH10碳酸緩沖液碳酸緩沖液0.50.50.50.50.50.50.50.50.53737水浴保溫水浴保溫5 5分鐘分鐘蒸餾水蒸餾水0.10.1_ _ _ _酚標準液（酚標準液（0.1mg/ml0.1mg/ml）_ _0.10.1_ _ _測定液測定液_ _ _A1A1液液0.10.1B B液液0.10.1C1液液0.1混勻，立即置于混勻，立即置于37 37 水浴保溫水浴保溫1515分鐘分鐘目目 錄錄 加加0.2M NaOH0.2M NaOH溶液溶液1ml1ml加加0.3%4-0.3%4-氨基安替比林氨基安替比林1ml, 0.5%1ml, 0.5%鐵氰化鉀溶液鐵氰化鉀溶液2ml2ml，混勻，室溫，混勻，室溫10