生物安全管理體系文件

1、實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度目的：確保實(shí)驗(yàn)人員生物安全，環(huán)境不受污染，樣品質(zhì)量不受影響特制定該 管理制度。一、人員準(zhǔn)入條件1、實(shí)驗(yàn)室人員、輔助人員和外來人員必須具備相應(yīng)的專業(yè)技能、受過相關(guān)的實(shí) 驗(yàn)室生物安全培訓(xùn)、了解實(shí)驗(yàn)室潛在的生物危害和特殊要求， 經(jīng)負(fù)責(zé)人審批后方 可進(jìn)入相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室工作。2、未成年人、孕婦和有免疫缺陷的人員不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，處于易受感染狀態(tài)或 感染后果嚴(yán)重的額人員也不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。3、實(shí)驗(yàn)室人員必須在身體狀況良好、穿戴好防護(hù)服（白大衣）的情況下，方能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的污染區(qū)域工作。但當(dāng)身體出現(xiàn)較大的開放性損傷、 處于較重的疾病 感染狀態(tài)或呈重度疲勞狀態(tài)時(shí)不得進(jìn)入。4、外來參觀人員需經(jīng)科室

2、負(fù)責(zé)人同意并在相關(guān)人員陪同下方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。二、生物安全日常管理：（一）生物安全行為規(guī)范1 .進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前要摘除首飾，修剪指甲，以免刺破手套。長(zhǎng)發(fā)應(yīng)束在腦后，禁 止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)穿露腳趾的鞋。不得佩戴有可能被卷入機(jī)器或可隨人傳染性物質(zhì)的 飾物。2 .在實(shí)驗(yàn)室里工作時(shí)，要始終穿著實(shí)驗(yàn)服，實(shí)驗(yàn)室外禁止穿防護(hù)服（白大衣）。 大白衣應(yīng)定期清洗、更換，清洗時(shí)應(yīng)使用具有殺菌消毒的洗液或其他相應(yīng)方法。3、操作感染性物質(zhì)、腐蝕性或毒性物質(zhì)時(shí)須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并佩戴相關(guān)的安 全防護(hù)用品，如安全鏡、面罩或護(hù)目鏡。皮膚受損時(shí)應(yīng)以防水敷料覆蓋。4、當(dāng)有必要保護(hù)眼睛和面部以防實(shí)驗(yàn)對(duì)象噴濺、或紫外線輻射時(shí)，必須要配戴 護(hù)目鏡

3、，面罩（帶護(hù)目鏡的面罩）或其它防護(hù)用品。5、實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)不允許吃、喝、化妝和操作隱形眼鏡，禁止在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi) 的任何地方貯存人用食品及飲料。6、實(shí)驗(yàn)室防護(hù)服不應(yīng)和日常服飾放在同一柜子。個(gè)人物品、服裝和化妝品不應(yīng) 放在有規(guī)定禁放的和可能發(fā)生污染的區(qū)域。7、不得涉及呼吸道傳播疾病樣品室，要佩戴符合要求的防護(hù)口罩。（二）操作準(zhǔn)則1、所有樣本、培養(yǎng)物均可能有傳染性，操作時(shí)均應(yīng)帶手套。在認(rèn)為手套已被污 染時(shí)應(yīng)脫掉手套，馬上洗凈雙手，再換一雙新手套。2、當(dāng)實(shí)驗(yàn)過程可能涉及到直接或意外接觸到血液、有傳染性的材料或被感染的 動(dòng)物時(shí)，必須要戴上合適的手套，脫手套后必須洗手。在實(shí)際或可能接觸了血液、 體液或其他

4、污染材料后，即使戴有手套也應(yīng)立即洗手。3、不得用戴手套的手觸摸自己的眼、鼻子或其他暴露的黏膜或皮膚。不得帶手 套離開實(shí)驗(yàn)室或在實(shí)驗(yàn)室來回走動(dòng)。4、嚴(yán)格禁止用嘴操作實(shí)驗(yàn)器材，包括吸液、吹酒精燈等。實(shí)驗(yàn)材料禁止放入嘴 里。禁止舔標(biāo)簽。5、盡量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。破損的玻 璃不能直接用手直接操作，必須用機(jī)械方法清除，如刷子、夾子、銀子等。破裂 的玻璃器具和比例碎片應(yīng)丟棄在有專門標(biāo)記的、單獨(dú)的，不易刺破的容器里。6、所有的實(shí)驗(yàn)步驟都應(yīng)盡可能使氣溶膠或氣霧的形成控制在最小程度。任何使 形成氣溶膠的危險(xiǎn)性上升的操作都必須在生物安全柜里進(jìn)行。有害氣溶膠不得直接排放。7、應(yīng)盡

5、可能減少使用利器和盡量使用替代品。包括針頭、玻璃、一次性手術(shù)刀 在內(nèi)的利器，應(yīng)在使用后立即放在耐扎容器中。尖利物容器應(yīng)在內(nèi)容物達(dá)到三分 之二前置換。8、所有濺出事件、意外事故和明顯或潛在的暴露于感染性材料，都必須向?qū)嶒?yàn) 室負(fù)責(zé)人報(bào)告。此類事故的書面材料應(yīng)存檔。9、所有棄置的實(shí)驗(yàn)室生物樣本、培養(yǎng)物和被污染的廢棄物應(yīng)被假定有傳染性， 在從實(shí)驗(yàn)室中取走之前，應(yīng)以安全方式處理和處置，使其達(dá)到生物學(xué)安全。10、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持整潔、干凈，當(dāng)潛在的危險(xiǎn)物濺出或一天的工作結(jié)束后，所有 操作臺(tái)面、離心機(jī)、加樣槍、試管架必須擦拭、消毒。11、每日工作完畢，最后一個(gè)離開實(shí)驗(yàn)室的人員需關(guān)好水、電、門、窗。（三）監(jiān)督與檢

6、查1、涉及病原體的科室負(fù)責(zé)人要經(jīng)常對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的生物安全性進(jìn)行檢查和監(jiān)督。2、各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目主管人員要定期對(duì)所開展的實(shí)驗(yàn)工作進(jìn)行監(jiān)督與檢查，及時(shí)發(fā)現(xiàn) 并報(bào)告安全隱患事件。三、常見實(shí)驗(yàn)室廢棄品處理實(shí)驗(yàn)室廢棄品按物理類型而言可分為固體廢棄品、液體廢棄品及氣體廢 棄品，就危害類型而驗(yàn)分為化學(xué)毒性廢品和病原性廢品，由于廢棄物品具有潛在的致病性、傷害性，如不妥善處理會(huì)造成很大的人身危害、環(huán)境污染和社會(huì)危害。 根據(jù)國(guó)家危險(xiǎn)廢物品名錄、醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例、衛(wèi)生部和國(guó)家環(huán)境保護(hù) 總局制定的醫(yī)療廢物分類目錄有關(guān)規(guī)定的要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)室廢棄物進(jìn)行分類， 主要包括感染性廢棄物、病理性廢棄物、損傷性廢棄物、化學(xué)性和放射性廢棄物分

7、類特征常見廢棄物名稱處理程序感染性廢棄物攜帶病原微生物具有引發(fā)感染性疾病傳播危險(xiǎn)的廢棄物包括被感染性實(shí)驗(yàn)材料等污染的物品與器材，如手套、口罩與白大衣、試管、平皿、吸管等實(shí)驗(yàn)器材以及廢棄的感染性實(shí)驗(yàn)標(biāo)本、培養(yǎng)液、培養(yǎng) 基等。放入盛有適宜消毒液的不易碎 裂的容器中浸泡。注意消毒劑 的種類、濃度及浸泡時(shí)間，浸 泡后放入合適的容器內(nèi)進(jìn)行高 壓滅菌或焚燒處理病理性廢棄物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體等廢棄物包括廢棄的質(zhì)粒、細(xì)胞、單克 隆課題、臨床、組織樣本及實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物組織、尸體等。集中與實(shí)驗(yàn)室指定位置，嚴(yán)格 與感染性生物材料區(qū)分，高壓 火菌后廢棄。盛放容器宜浸泡Wo損傷性廢棄物能刺傷或割傷人體的銳器等廢棄物包括醫(yī)用枕頭、

8、縫合針、手術(shù)刀及破碎玻璃等高壓火菌或焚燒處理，盛放銳 器的一次性容器不易刺破，不 宜將容器裝得過滿（小于四分之三），如感染性廢棄物進(jìn)行局壓火菌及焚燒處埋化學(xué)性、具毒性、腐蝕包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等有毒有害的強(qiáng)酸強(qiáng)堿等化學(xué)性物品須經(jīng)中放射性廢性、易燃易爆化學(xué)性廢棄物一級(jí)放射性廢和消除腐蝕行后方可廢弁，其棄物的化學(xué)性廢棄棄物等。他物品經(jīng)稀釋對(duì)環(huán)境與人體無物及放射性廢毒后可廢弁。含有毒、有害化棄物學(xué)物品的實(shí)驗(yàn)材料在使用后應(yīng)置于帶明顯危險(xiǎn)標(biāo)志的容器內(nèi)送至指定地點(diǎn)統(tǒng)一處理。四、支持文件1 .中華人民共和國(guó)傳染病防治法2 .病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例3 .實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求（改變9489-2004）4

9、.微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則（WS233-20035 .實(shí)驗(yàn)室生物安全守則（WHO三版，2004年）6 .病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全（生物安全培訓(xùn)衛(wèi)生部規(guī)劃教材，第 2版）7 .醫(yī)療廢棄物管理?xiàng)l例8 .實(shí)驗(yàn)室生物安全病毒制備質(zhì)量管理體系目錄原始病毒的擴(kuò)增大量病毒制備的滅菌操作病毒制備程序痘苗病毒的收獲和純化腺病毒的收獲和純化病毒滴度測(cè)定病毒質(zhì)控細(xì)菌污染及檢測(cè)支原體污染及檢測(cè) 基因檢測(cè)病毒活性檢測(cè)體外細(xì)胞殺傷復(fù)制能力檢測(cè)原始病毒的擴(kuò)增-病毒種子制備一般原始病毒的擴(kuò)增用優(yōu)質(zhì)（無污染-須通過細(xì)菌和支原體檢測(cè)）CV1 / JH293 細(xì)胞，每種原始病毒的擴(kuò)增需要在一個(gè)細(xì)胞融合度呈80% （細(xì)

10、胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活性好，感染效率高）的T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行：1 .細(xì)胞計(jì)數(shù)： 培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，鏡下觀察，將狀態(tài)良好，融合度呈80%的細(xì)胞移至超凈工作臺(tái)。 去除細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基。 PBS?中洗：從無細(xì)胞一側(cè)加入適量（約 10ml） PBS沖洗細(xì)胞后棄上清, 酌情反復(fù)12次，以達(dá)到徹底洗掉培養(yǎng)基中的血清成份。 消化細(xì)胞：加入1ml 0.25%胰酶消化液，使之鋪滿細(xì)胞表面，放入培養(yǎng) 箱（37C）作用數(shù)分鐘后，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì) 胞間隙增大；或肉眼觀察，見到瓶底出現(xiàn)細(xì)針孔間隙傾斜瓶子出現(xiàn)流沙樣現(xiàn)象即 可終止消化。 終止消化：輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，從無細(xì)胞面?zhèn)?/p>

11、加入適量完全 培養(yǎng)基（含血清的DMEM）終止消化，并用移液管吸吹數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混 合均勻，使之成為單細(xì)胞混合液 計(jì)數(shù)板準(zhǔn)備：用酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。 加樣：用移液管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液（可酌情稀釋），在計(jì)數(shù)板上蓋玻片一側(cè)靠虹吸現(xiàn)象加入微量 （約10ul）細(xì)胞懸液，使之充滿玻璃 槽，不可產(chǎn)生氣泡，不可溢出外側(cè)亦不可溢入對(duì)側(cè)玻璃槽。 如產(chǎn)生上述情況需對(duì) 計(jì)數(shù)板沖洗拭干重新加樣。 計(jì)數(shù)：靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移，將細(xì)胞計(jì) 數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn)， 先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡 觀察并計(jì)數(shù)。由于活細(xì)胞的遮光率和液體的折

12、光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng) 度。 計(jì)數(shù)時(shí)計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)中方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下 的4個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)，為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)江隆在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定計(jì)數(shù)原則：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右！如細(xì)胞位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。按下式計(jì)算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml =4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4 X 10對(duì)00釋倍數(shù)2 .感染種子：取平行對(duì)照培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)融合度呈80%的細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基并 加入含病毒種子的30mL感染培

13、養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+1pfu/cel）,輕輕晃動(dòng)培 養(yǎng)瓶，使病毒在培養(yǎng)基中充分混勻。3 .收集種子：標(biāo)記病毒種類和培養(yǎng)日期，在37°C, 5% CO條件下培養(yǎng)。 定時(shí)（24h/48h/60h/72h）檢查CPE（田胞變圓變亮脫壁，漂?。?0%ffl胞出現(xiàn) CPE即可收集。將含病毒細(xì)胞懸液加入50mL離心管中，標(biāo)記病毒種類和日期， 凍存于-80 C備用，并測(cè)定病毒滴度，以備感染病毒使用。大量病毒制備的滅菌準(zhǔn)備工作1,用過的500mL離心瓶泡入酸液中，過夜，沖洗干凈，烤干，高溫滅 菌。2,準(zhǔn)備足量T175培養(yǎng)瓶必須泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥, 滅菌包布包被滅菌

14、。3,培養(yǎng)細(xì)胞所用的移液管，離心管必須泡入酸液中，過夜，用沖洗干 凈，干燥，滅菌包布包被滅菌。4,離心管泡入酸液中，過夜后再處理，針頭直接滅菌，在移除針頭錢， 確保離心管實(shí)在一個(gè)大燒杯上，這樣漏液不會(huì)污染操作臺(tái)。5,研磨器泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥，滅菌包布包被滅 菌。6. Beckman超高速離心機(jī)及特制轉(zhuǎn)子和離心管準(zhǔn)備。7. V型槽，96孔板，排槍準(zhǔn)備。病毒制備程序細(xì)胞準(zhǔn)備:1 .建立細(xì)胞種子庫(kù)：復(fù)蘇細(xì)胞（CV1用于痘苗病毒病毒；JH293用于腺病毒 病毒）分別于與第3/5/7/14天取上清兩份，一份用于支原體檢測(cè)，另一份加至 培養(yǎng)基中放于培養(yǎng)箱中定時(shí)鏡下觀測(cè)，用于細(xì)菌檢測(cè)，保證

15、細(xì)胞質(zhì)量。待細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞融合度呈80%?肖化傳代擴(kuò)增并凍存足量細(xì)胞種子于液氮中，凍存管上須準(zhǔn) 確標(biāo)記所凍細(xì)胞名字，代數(shù)，凍存人以及凍存日期等相關(guān)信息。（慢凍速溶）2 .細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)： 當(dāng)1瓶T175培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)融合度呈80%時(shí)，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出， 各加入1ml胰酶消化，37 C, 2-3分鐘；加入適量（5ml）完全培養(yǎng)基終止消化， 全部轉(zhuǎn)移至50ML離心管中，總量為6ml。分別抽取2ml此混合液加入含18ml 完全培養(yǎng)基（含10%血清）的T175培養(yǎng)瓶中共三瓶繼續(xù)培養(yǎng)（1傳3）,原瓶繼 續(xù)培養(yǎng)待下一次傳代。 繼而同上方法擴(kuò)增至12瓶T175培養(yǎng)瓶培養(yǎng)（1傳4）細(xì)胞生長(zhǎng)融合度 呈80%寸

16、同上方法擴(kuò)增至36瓶為一批（1傳3）,其中1瓶T175培養(yǎng)瓶中細(xì)胞作 為平行對(duì)照，放入37c CQ孵育箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)。平行對(duì)照培養(yǎng)瓶同時(shí)放入 孵育箱，直至融合度呈80%。:.病毒感染: 觀察平行對(duì)照培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)率呈80%時(shí)，準(zhǔn)備進(jìn)行病毒感染；同時(shí) 也觀察其它所有細(xì)胞，對(duì)比細(xì)胞增殖速度是否一致。 取平行對(duì)照瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算需要感染病毒量(1pfu/cell)0 -80C冰箱中取出測(cè)定過病毒滴度的病毒種子，按計(jì)算好的病毒量配制1080ml (30ml /瓶刈6瓶)含2%血清的DMEM培養(yǎng)基。放入37c二氧化碳孵育 箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)，或直到 留0%細(xì)胞都出現(xiàn)CPE痘苗病毒的收獲和

17、純化二.病毒收獲：1）從37c二氧化碳孵育箱中取出達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)的 36瓶T175培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng) 培養(yǎng)瓶，少量貼壁細(xì)胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺(tái)用移液管輕輕吹打未 脫落細(xì)胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。2） 移至高速離心機(jī)中配平，3500rpm, 15min, 4c離心。3）棄上清，移液管取10ml冷PBS加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉(zhuǎn)入 50ml離 心管中。4）方法同上，用冷PBS反復(fù)清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉(zhuǎn)致同一 50ml 離心管中。5） 移至高速離心機(jī)中配平，3500rpm, 15min, 4c離心。6）棄上清，4 c取7ml冷VV-Buffer

18、重懸混勻，并凍存于-80 C待純化。四.病毒純化：1）將待純化病毒溶液在液氮與37c水浴鍋中反復(fù)凍融三次，使包含于細(xì)胞內(nèi)的 病毒顆粒完全釋放。2）將完全融化的病毒液移至超凈工作臺(tái)，加入滅菌的研磨器中勻速緩慢反復(fù)研磨60次。3）將研磨好的病毒液轉(zhuǎn)入 50ml離心管中配平，1200rpm, 5min , 4c離心。4）吸取上清 于另一 50ml離心 管中，取3ml VV-Buffer 重懸沉淀，2ml VV-Buffer沖洗離心管，加至同一 50ml離心管，將混合液再次加入研磨器中 反復(fù)研磨60次。5）將研磨好的病毒液轉(zhuǎn)入 50ml離心管中配平，1200rpm, 5min , 4c離心。6）取上清

19、于一新的無菌離心管中，移至超聲儀中超聲（破碎）兩次，每次20s。7）在SW41Beck man離心機(jī)專用離心管中加入 7ml 36%蔗糖（w/v） K10MM Tris-Hcl（ PH 9Q配制R ,再沿管壁緩慢加入3.5ml研磨超聲處理過的病毒液， 使之形成分層。8）用VV-Buffer稱重配平，誤差須小于 0.5g （誤差越小越好），移至Beck man 離心機(jī)中（14 / 25 / 36 轉(zhuǎn)子對(duì)應(yīng)配平）13500rpm/32900xg , 80min , 4C。9）待離心結(jié)束，將轉(zhuǎn)子移至超靜工作臺(tái)打開，用銀子小心拿掉轉(zhuǎn)子蓋子，切勿 污染，再用無菌銀小心取出離心管，去除上清，取6mlVV-

20、Buffer重懸沉淀。10）梯度蔗糖：底層為4ml 40%蔗糖溶液（用10mM Tris-HCL pH9.CK制），依次向上分別為4ml 35%蔗糖溶液；4ml 30%蔗糖溶液和4ml 25%蔗糖溶液（最上層）。每個(gè)病 毒樣本制備至少兩份梯度，分別小心在上層加入病毒懸液，使之形成分層。11）用10mM Tris-Hcl （PH 9.0）稱重配平，誤差須小于0.5g （誤差越小越好），移 至Beck man離心機(jī)中（14 / 25 / 36轉(zhuǎn)子對(duì)應(yīng)配平）20000rpm ,60min ,4 C。12）待離心結(jié)束，將轉(zhuǎn)子移至超靜工作臺(tái)打開，用銀子小心拿掉轉(zhuǎn)子蓋子，切勿 污染，再用無菌銀小心取出離心

21、管，去除上清，取2mlVV-Buffer重懸沉淀。13）病毒分裝與儲(chǔ)存：取滅菌 EP管，取少量病毒液進(jìn)行滴度測(cè)定，其余根據(jù)實(shí) 驗(yàn)需要按20ul / 50ul /100ul /支并按規(guī)定明確標(biāo)記病毒名稱，日期等信息后， 冰上分裝凍存于-80 C冰箱病毒庫(kù)。腺病毒的收獲和純化二.病毒收獲：7）從37c二氧化碳孵育箱中取出達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)的 36瓶T175培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng) 培養(yǎng)瓶，少量貼壁細(xì)胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺(tái)用移液管輕輕吹打未 脫落細(xì)胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。8） 移至高速離心機(jī)中，2000rpm, 10min, 4c離心。9）棄上清，移液管取10ml冷PB

22、S加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉(zhuǎn)入 50ml離 心管中。10）方法同上，分別用冷PBS5ml反復(fù)清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉(zhuǎn)致同50ml離心管中 11）移至高速離心機(jī)中配平，1000rpm, 10min, 4c離心。12）棄上清，4c取12ml冷的10mM Tris.HCI（Ph8.0g懸混勻，并凍存于-80C待 純化。四.病毒純化：1 .將制備的含病毒溶液在液氮和37 c水浴中反復(fù)凍融三次。2 .將該溶液37c水浴融化，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，室溫，6000 rpm離心10 分鐘。保留上清，凍存于-80C冰箱或立即進(jìn)行CsC梯度離心。3 .將6只超高速離心用離心管中分別先加入10ml1

23、.25g/mlCsCI再小心輕輕加入7.6ml1.4g/mlCsCL,然后將病毒混合液平均輕輕加入 CsC腋面上。4 .稱重，用滅菌的Tris.HCI（Ph8.0）己平，誤差 0.1g。5 .將離心管放入 Beckman SW32轉(zhuǎn)子中，放入LE-80曲速離心機(jī)中（14 / 25 / 36轉(zhuǎn)子對(duì)應(yīng)配平）離心，25000rpm, 15C, 2小時(shí)。6 .小心取出離心管放于無菌操作臺(tái)中，將離心管夾于管夾上，用 19號(hào)針頭 刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物（病毒條帶呈乳白色），盡量多抽，將 所抽出液體轉(zhuǎn)入50ml離心管中。7 .將50ml離心管中含病毒液體順液面輕輕平均分配加入至已加入3ML1.35g

24、/mlCsCI溶液的5ml超高速離心用離心管中。8 .用 Tris.HCI(Ph8.琳重配平，誤差 0.1g。9 .將離心管放入Beckman SW41轉(zhuǎn)子中，放入LE-80曲速離心機(jī)中(14 / 2-5 / 36轉(zhuǎn)子對(duì)應(yīng)配平)離心，40000rpm, 15 C, 15小時(shí)。10 .小心取出離心管放于無菌操作臺(tái)中，將離心管夾于管夾上，用 19號(hào)針頭 刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物(病毒條帶)，盡量少抽，將所抽出液 體轉(zhuǎn)入50ml離心管中。11 .將液體注入透析袋中，放入透析液中，于冷室中透析 24小時(shí)。12 .病毒分裝與儲(chǔ)存：透析結(jié)束后，將透析袋轉(zhuǎn)至無菌工作臺(tái)中，取少量病毒液進(jìn)行滴度測(cè)定，其余

25、病毒液根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按20ul / 50ul /100ul /支并按規(guī)定明確標(biāo)記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝儲(chǔ)存于-80C冰箱病毒庫(kù)。病毒滴度測(cè)定(TCID5Q1 .培養(yǎng) CV-1 (VV)或 JH293(AD)細(xì)胞。2 .當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)率呈80%寸，將各培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，各加入少量 胰酶消化，37C, 2-3分鐘；冉各加入5mL10% FBS勺DMEM培養(yǎng)基混勻，細(xì)胞 計(jì)數(shù)。3 .根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞鋪入 96孔板，每孔3M03細(xì)胞于200微升10%FBS的DMEM,過夜。4 .第二天早晨，按比例稀釋病毒，一般是 1: 105稀釋：10ul病毒原液3ul混合液990ul DMEM2

26、997ul DMEM20ul排槍加至96孔板第一排第一排用排槍加入20微升，輕輕混勻5次，去掉槍頭;從第一排吸取22微升加入到的第二排，輕輕混勻 5次；同樣從第二排吸取22微升加入到第三排，輕輕混勻5次;依次到倒數(shù)第二排，最后一排做對(duì)照。5.從感染病毒起，第810天觀察。先觀察最后一排細(xì)胞狀態(tài)，長(zhǎng)滿時(shí)，計(jì)每排 CPE的數(shù)值。計(jì)算病毒滴度。6.代入以下表格計(jì)算病毒滴度:DilutionsNo. infected w ellsNo. uninfected w ellsTotal no. Total no. uninfectedinfected% totalAbove 0.5% above 0.5

27、% binfectedelow 0.5 log abodilut ve 51.00E-051206901TRUE0001.00E-061205701TRUE0001.00E-071204501TRUE0001.00E-081113310.9705882TRUE0001.00E-091022230.88TRUE0001.00E-1057121005454545TRUE 0.5)4545450-101.00E-117571503181818FALSE00.31818180# of Wells12mls/well0.020.50.5)454545 0.3181818-10Prop. Dist.0.2

28、Log TCID50-10.2TCID506.3096E-111/TCID501.5849E+10TCID50/ml7.9245E+11pfu/ml5.4679E+11cell number90000volume2pfu/cell12150848一、細(xì)菌污染及檢測(cè)；二、支原體污染及檢測(cè);三、基因檢測(cè)；四、病毒活性檢測(cè)；五、體外細(xì)胞殺傷復(fù)制能力檢測(cè)細(xì)菌污染及檢測(cè):1.1 背景介紹：細(xì)菌是一種元和細(xì)胞微生物，具大小以微米計(jì)。常見的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和假單胞菌等， 革蘭氏陰性菌中白色葡萄菌等 比較常見。純化后的病毒有細(xì)菌污染時(shí)并不容易發(fā)現(xiàn)。所以，做病毒的細(xì)菌質(zhì)控 非常必要。1.2 實(shí)驗(yàn)步驟：當(dāng)做

29、細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，可以取10ul已經(jīng)純化好的病毒加入無抗生素 4ml的培養(yǎng)基 （目前實(shí)驗(yàn)室所用的是LB培養(yǎng)基）試管中，將試管置于 37C, 1800rpm的搖床 上搖過夜（12-16h）,如果有細(xì)菌污染，16h內(nèi)就可獲得陽(yáng)性結(jié)果。1.3 結(jié)果判讀:多數(shù)情況下當(dāng)受到細(xì)菌污染時(shí)，培養(yǎng)基短時(shí)間內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)， 出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，此時(shí)的培養(yǎng)基稍加振蕩就會(huì)有混濁物懸起。在倒置顯微鏡下 觀察，可見培養(yǎng)基有大量圓球狀顆粒漂浮， 此種情況即可判定為陽(yáng)性，病毒受到 細(xì)菌污染。若無，則判讀為陰性。二、支原體污染及檢測(cè)：2.1 背景介紹：支原體是一種介于細(xì)胞和病毒之間、能獨(dú)立生活的最小微生物，最小的直徑0.

30、2um,約有1%可通過濾菌器，無細(xì)胞壁，形態(tài)呈多形性，可為圓形、絲狀或梨形。在光鏡下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)， 其中央有電 子密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體的污染是一個(gè)常見又棘手的問題。支原體污染后，因它可與病毒長(zhǎng)期共存， 培養(yǎng)基一般不發(fā)生混濁，外觀上往往給人以“正常”的感覺，實(shí)則可能對(duì)后期實(shí) 驗(yàn)產(chǎn)生潛在影響，所以對(duì)支原體的污染必須嚴(yán)加防范。支原體污染常用檢測(cè)方法有相差顯微鏡法、DNA熒光處理法、電鏡檢測(cè)法、低張 處理地衣紅染色觀察、支原體PCR檢測(cè)法等。實(shí)驗(yàn)室目前使用的是PCR僉測(cè)法。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟：(1)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：樣本和對(duì)照準(zhǔn)備：樣本：收集待檢測(cè)病毒樣本

31、，若為病毒原液則可用5ul原液加495ul細(xì)胞培養(yǎng)基(確定無污染)進(jìn)行100倍稀釋。陽(yáng)性對(duì)照：從醫(yī)院取得支原體陽(yáng)性樣本，高壓滅菌后(可分裝50ul一支)做陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：滅菌蒸儲(chǔ)水。引物的準(zhǔn)備：Fwd-1.: ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT AFwd-2.: CCT AAA GGA ATT GAC GGG AAC CCGRev: TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC以上引物可以檢測(cè)出常見的14種不同支原體。按要求稀釋為50pmol/ul ,分裝為50ul/管，-20c保存，待使用。(2) PCR 反應(yīng)：配置全過程需在冰上操作：1st

32、 Round band at 720bp按下列組分配置PCR反應(yīng)液：滅菌蒸儲(chǔ)水up to 20ul -10*PCR Buffer2ulDntp(2.5mM) MgC2(25mM) Fwd-1.Rev.Taq酶 樣本/對(duì)照1.6ul1.2ul1ul1ul0.3ul1ulMIX1st反應(yīng)條件95 c x 30s95 C x 30 s56 C x 30 s72 c x 1min35 cycles72 c x 1min反應(yīng)大約需1.5小時(shí)，由此得到第一輪相應(yīng)的 PCR產(chǎn)物，在打開PCR管前先離心甩一下，接著進(jìn)行第二輪 145bp的PCR鑒定。2nd Round - Band at 145bp按下列組分

33、配置PCR反應(yīng)液：滅菌蒸儲(chǔ)水10*PCR Bufferup to 20ul2ulDntp(2.5mM)1.6ulMgC2(25mM)1.2ulFwd-2.1ulRev.1ulTaq 酶0.3ul第一輪PCR勺產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)樣本/對(duì)照)1ulMIX加過模板，第一輪產(chǎn)物可加1ul 10*loding buffer,混勻后先放置4c冰箱。待跑瓊脂電泳膠。2nd反應(yīng)條件（與第一輪相同） 95 x 30s95 C x 30 s-56 C x 30 s _35 cycles72 c x 1min_72 x 1min第二輪產(chǎn)物加1ul 10*loding buffer ,終止反應(yīng)，跑瓊脂電泳膠。（3）瓊脂電泳跑

34、膠：配置1%的瓊脂糖凝膠即可。首先將錐形瓶洗干凈，然后根據(jù)樣本量和膠的大小取一定量的電泳緩沖液 （1XTAE至錐形瓶中，再稱取相應(yīng)量的 AGAROSE瓊脂糖）倒入錐形瓶中， 搖勻，最后放入微波爐加熱，煮膠的過程中需注意安全，應(yīng)適當(dāng)搖勻，防止爆沸。 煮好的凝膠需無氣泡、色澤及質(zhì)地均勻。將煮好的凝膠放入均勻冷卻至50c左右時(shí)，加入相應(yīng)EB混勻，及時(shí)將凝 膠倒入裝好的干凈模具中。待凝膠完全凝固（約30min）后，垂直方向拔梳子。此時(shí)，凝膠需平整、不 漏孔，可以用于電泳檢測(cè)。膠前準(zhǔn)備：先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標(biāo)記，然后把凝膠連同膠托一起放入電泳 槽正中央。膠孔的方向朝向負(fù)極（注意：放凝膠前，需將

35、膠托底部的凝膠抹干凈，防 止膠托在電泳槽中滑動(dòng)；此時(shí)，可順便觀察凝膠是否漏孔）。再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩沖液（1XTAE至剛好將凝膠淹沒。（注 意保持桌面衛(wèi)生，防止緩沖液灑到桌。上樣:將兩輪的產(chǎn)物和loding buffe混合后，輕甩，按照規(guī)定的順序上樣，上樣 順序應(yīng)與電泳槽上的標(biāo)記一致。注息：上樣時(shí)必須確保上樣順序正確無誤，樣品間不混淆，點(diǎn)樣后的空管子先放 在電泳槽旁邊，用于核查；點(diǎn)樣時(shí)不戳孔、不外漏、不溢出；點(diǎn)樣時(shí)需小心槍頭不要碰到凝膠，以免凝膠挪動(dòng)，若凝膠已經(jīng)挪動(dòng)，需等 樣品完全沉到底部后，再固定凝膠.樣品上完后，加陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照。每排膠上留一孔加 Maker （D2000 b

36、p） ,5 ul.跑電泳：確認(rèn)已經(jīng)正確上樣后，雙手同時(shí)蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽（注 意：確認(rèn)電極正確連接），設(shè)置電泳參數(shù)：電壓：100V,電流：400mA,時(shí)間： 25min；注意確認(rèn)電極、電泳參數(shù)完全正確之后，最后按 star鍵開始電泳。凝膠成像：帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時(shí)的那個(gè) PE手套上（注 意：撈膠時(shí)需小心防止凝膠斷裂、滑落，盡量把多余的 EB染液甩干），將凝膠放 入凝膠成像系統(tǒng)中，按照“ Tanon凝膠成像系統(tǒng)操作規(guī)程”進(jìn)行操作拍照。（注 意：拍照時(shí)需嚴(yán)格區(qū)分EB污染區(qū)與非污染區(qū)，防止EB污染區(qū)污染電腦、鍵盤及 鼠標(biāo)），最后保存膠圖信息至規(guī)定的文件夾內(nèi)，命

37、名規(guī)則為：日期 +姓名+工號(hào)+ 部門+電泳銅人陣考核。注意事項(xiàng) 1、電泳中使用的澳化乙錠（EB）為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì), 務(wù)必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。操作時(shí)戴上乳膠手套，必要時(shí)戴上 PE手套和口罩。三.基因檢測(cè)：試驗(yàn)1: BioTTT00也因組測(cè)序試驗(yàn)一、目的檢測(cè)BioTTT001序歹U信息、試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌存儲(chǔ)BioTTT001深圳S160324A -80度QIAmp DNA blood mini kitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號(hào)離心機(jī)ThermoIEC MICROMAX微量分光光度計(jì)Ther

38、moNANODROP ONE恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEX GENIX2四、試驗(yàn)過程1 .病毒基因組提取1.1 向200ul BioTTT001原液中力口入10ul蛋白酶K,混勻。1.2 加入200ulAL Buffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入 56度水浴鍋內(nèi)，孵 育10分鐘。1.3 加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉(zhuǎn)移樣品到新吸附柱中。1.4 離心8000轉(zhuǎn)1分鐘，轉(zhuǎn)移吸附柱到新2ml離心管中。1.5 加入 500ul Buffer AW1,離心 8000 轉(zhuǎn) 1 分鐘。1.6 棄廢液，向吸附柱中加入 50

39、0ul Buffer AW2, 14000轉(zhuǎn)離心3分鐘。1.7 棄廢液，空轉(zhuǎn)1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。1.8 向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉(zhuǎn)離心1分鐘2 .濃度測(cè)定2.1 吸取2ul超純水，滴到樣品檢測(cè)孔處，進(jìn)行校準(zhǔn)。2.2 抬起測(cè)量臂，擦拭殘留液體。2.3 吸取1ul待檢測(cè)樣品，滴加到樣品檢測(cè)處，放下測(cè)量臂，記錄數(shù)據(jù)3 .送華大基因測(cè)序3.1 準(zhǔn)備總量為2.5ug,濃度不低于80ng仙的樣品，進(jìn)行測(cè)序。3.2 華大基因進(jìn)行樣品檢測(cè)，并出示檢測(cè)報(bào)告。3.3 樣品檢測(cè)合格后，建立樣品庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。3.4 數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)2: BioTTT001基因組酶

40、切試驗(yàn) SOP、目的通過酶切驗(yàn)證BioTTT001的構(gòu)建儀器品牌型號(hào)、試劑來源、配制及保存條件試齊來源/品牌存儲(chǔ)BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmp DNA blood mini kitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度EcoR VNEBR1095S-20度Buffer 3.1NEBB7203S-20度瓊脂糖Invitrogen75510-019室溫DNA MarkerTIANGEN100bp4度三、儀器設(shè)備離心機(jī)ThermoIEC MICROMAX微量分光光度計(jì)ThermoNANODROP ONE恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTI

41、FIC INDUSTRIESVORTEX GENIX2瓊脂糖凝膠電泳儀:北京六一DYY-6c瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500四、試驗(yàn)過程1 .病毒基因組提取1.1 向200ul BioTTT001原液中力口入10ul蛋白酶K,混勻。1.2 加入200ulAL Buffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入 56度水浴鍋內(nèi)，孵 育10分鐘。1.3 加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉(zhuǎn)移樣品到新吸附柱中。1.4 離心8000轉(zhuǎn)1分鐘，轉(zhuǎn)移吸附柱到新2ml離心管中。1.5 加入 500ul Buffer AW1,離心 8000 轉(zhuǎn) 1 分鐘。1.6 棄廢液，向吸附柱中加入 500

42、ul Buffer AW2, 14000轉(zhuǎn)離心3分鐘。1.7 棄廢液，空轉(zhuǎn)1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。1.8 向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉(zhuǎn)離心1分鐘2 .濃度測(cè)定2.1 吸取2ul超純水，滴到樣品檢測(cè)孔處，進(jìn)行校準(zhǔn)。2.2 抬起測(cè)量臂，擦拭殘留液體。2.3 吸取1ul待檢測(cè)樣品，滴加到樣品檢測(cè)處，放下測(cè)量臂，記錄數(shù)據(jù)。3.酶切3.1配制酶切體系基因組40ul （約500ng）EcoR V1ulBuffer 3.15ul超純水4ul總體積50ul3.2混勻后，放于37度水浴鍋中，過夜酶切，約16-18小時(shí)4.電泳4.1 配制2%®脂糖凝膠

43、，120V電泳，約25-30分鐘，4.2 成像觀察。試驗(yàn)3: BioTTT00也因組PCRM插入基因IL-12 PCR僉證SOP一、目的禾I用PCR驗(yàn)證BioTTT001的構(gòu)建、試劑來源、配制及保存條件試齊來源/品牌存儲(chǔ)BioTTT001深圳S160324A1-80度QIAmp DNA blood mini kitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度2XMixVazyme102151-20度引物（詳見附注）一DNA MarkerTIANGEN100bp4度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號(hào)離心機(jī)ThermoIEC MICROMAX微量分光光度計(jì)ThermoNANODROP ON

44、E恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEX GENIX2PCR儀Life technologies2720 Thermal cycler瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500四、試驗(yàn)過程1 .病毒基因組提取1.1 向200ul BioTTT001原液中力口入10ul蛋白酶K,混勻。1.2 加入200ulAL Buffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入 56度水浴鍋內(nèi)，孵 育10分鐘。1.3 加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉(zhuǎn)移樣品到新吸附柱中。1.4 離心8000轉(zhuǎn)1分鐘，轉(zhuǎn)移吸附柱到新2ml

45、離心管中。1.5 加入 500ul Buffer AW1,離心 8000 轉(zhuǎn) 1 分鐘。1.6 棄廢液，向吸附柱中加入 500ul Buffer AW2, 14000轉(zhuǎn)離心3分鐘。1.7 棄廢液，空轉(zhuǎn)1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。1.8 向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉(zhuǎn)離心1分鐘2 .濃度測(cè)定2.1 吸取2ul超純水，滴到樣品檢測(cè)孔處，進(jìn)行校準(zhǔn)。2.2 抬起測(cè)量臂，擦拭殘留液體。2.3 吸取1ul待檢測(cè)樣品，滴加到樣品檢測(cè)處，放下測(cè)量臂，記錄數(shù)據(jù)。PCR3.4.電泳4.1 配制2%®脂糖凝膠，120V電泳，約25-30分鐘,4.2 成像觀察。

46、附注：引物信息-Frimer set| , . / * ' . _ ,' O' " I'' iDirectionKequenc.41°- '«J ?u,.a» ,|- -r« . L _ ,- -* , r ： .一 - j151 forwardCCCGGJGAGATTCCTCAAGAGtiCCACV reverseCC G ； A CCC A AG GCTC TC1G C fCTCCGG CTG C1CG UG C251 furwardGTAATGTTGOCGQTOCAGGAAGGGATTGV

47、reviseGfiGTCCCCCGTA riCtrrt'CGGTCiA J AA IGAC3S1 JbrwpardMl GfTCCiCTTTGCTATATG AGG ACCTGTGG C3* reverseCCTCGAlACArrCCACAGCCTGGCGACGCCCACC4I5' forwardCCTGTGATTGCGTGTGTGG3' reverseGACAACA GT AG CAGGCG ATTC55, forwardGCATCTGTGGAGAGCGG H'GTOAGACAC3' reverseGCGCCACJCAGA TCA A G CTCATT

48、A GCCC65' forwardGCTTA ATG ACC A GA CACCGTCCTG AC TG3, reverseGCACCA AGTG ATCCGGCCTC AG CTCC75' fens ardCAC：CICACGCrCAlVlGUAGCCJCAIVACrGJ；3' reverseCKJ C AG A CG er FCTTGCG CGCTTCATCTG Cg51 forwardCGCTGGGGTCGCCACCCAAGATG ATTAG G31 reverseGAGTAGGG1 ACGACCAAAGCtiAOCACTO95" forward第8對(duì)E

49、3-gp19k上游3" reverse第11對(duì)nsIL12下游105" forward第11對(duì)nsIL12上游3" reverse第8對(duì)E3-gp19k下游115" forwardATGatatgggaactgaagaaag3" reverseTTAGGAAGCATTCAGATAGPi iiiicr 轉(zhuǎn)tS' Mnriin sift3' binding si，©Targel 舅equenctFxpecterf Ad5 size (bp)-1476&53,'' IA t3772 .7671021)

50、E1A-CK22623206g1453El A end38441554208%EIB-1PKFS32520732440R1R-55K367623833431E1B-55K105721531。%E3BH23E2871529135Ek即19區(qū).42092871530109E3-gp19k+nsIL121394102853429135nsIL12+E3-gp19k601112853430109nsIL121575試驗(yàn) 4: BioTTT00lff入基因 IL-12表達(dá)檢測(cè) SOP (ELISA)、目的 禾I用ELIS賬測(cè)BioTTT001插入基因IL12的表達(dá)水平、試劑來源、配制及保存條件試齊來源/

51、品牌貨號(hào)/配制存儲(chǔ)Biolll001深圳S160324A-80 度一DMEMGibco75510-0194度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin- Glutamine (100X)Gibco10378-016-20度Human IL12 ELISA KITeBioscien ce88-7126-884度三、儀器設(shè)備儀器品牌型號(hào)生物安全柜Thermo1300SERIES A2細(xì)胞培養(yǎng)箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA 8800 SERIES水浴鍋晶玻SS-H2酶標(biāo)儀BECKMANDTX880四、試驗(yàn)過程1 .細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板1.

52、1 復(fù)蘇JH293一支，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%寸進(jìn)行傳代。1.2 傳代3-5次，觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。1.3 利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。1.4 使用含10%FBS-DMEMt養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞溶度為1.0 X10/ml ,2ml/孔進(jìn)行鋪板1.5 將六孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)。2 .病毒感染2.1 培養(yǎng)14-18小時(shí)，觀察細(xì)胞完全貼壁后，消化其中 3個(gè)孔，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)， 取平均值。2.2 每個(gè)細(xì)胞感染5PFU BioTTT001根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀 釋病毒，每孔加2ml含病毒的無血清DMEMo2.3 細(xì)胞培養(yǎng)箱放置2小時(shí)，吸走含病毒培養(yǎng)基，2mlPBS/FL輕輕晃動(dòng)清洗一次。2.4 每個(gè)孔加入2ml 10%FBS-DMEMW養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3 .樣品收集及凍融3.1 分別于感染后24h、48h、72h及96h時(shí)，收集每孔的培養(yǎng)基，使用 200ul吸 頭（折彎）刮取貼壁細(xì)胞，與同孔的培養(yǎng)基收集于同一凍存管中；每個(gè)時(shí)間 點(diǎn)收集三個(gè)復(fù)孔。3.2 樣品保存于超低溫冰箱中。3.3 從超低溫冰箱中取出樣品，放置于 37度水浴鍋中進(jìn)行解凍。3.4 樣品完全解凍后，迅速將其放置于液氮中3-5分鐘進(jìn)行速溶，再37度水浴至 完全溶解。3.5