微生物酶資源的開發(fā)和利用（上）-

1、合肥學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版Journal of Hefei University(Natural Sciences微生物酶資源的開發(fā)和利用(上潘仁瑞1,2,吳克1,蔡敬民1(1.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系,合肥2300222;2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,合肥230026摘要:概括介紹了微生物酶資源的開發(fā)和應(yīng)用進展,內(nèi)容包括世界和我國工業(yè)酶制劑生產(chǎn)概況,開發(fā)酶制劑新品種的重要性和有利條件,快速開發(fā)具有應(yīng)用價值新酶的途徑,微生物酶的應(yīng)用方式和應(yīng)用領(lǐng)域以及130余種微生物來源的酶在實際中的應(yīng)用簡況。關(guān)鍵詞:微生物;酶工程;工業(yè)酶制劑;定向進化中圖分類號:Q814.9文獻標識碼:A文章編號:1673

2、-162X(200501-0007-05近年來,酶工程的研究開發(fā)和推廣利用已成為生物技術(shù)中的重要領(lǐng)域。作為生物技術(shù)的一個重要組成部分,它可以廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護、化學(xué)分析、新能源開發(fā)以及生命科學(xué)理論研究等許多方面。隨著酶工程研究的快速進展,與之相對應(yīng)的酶工程產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也非常迅速,是本世紀最具有發(fā)展前途的產(chǎn)業(yè)之一。酶工程是研究酶的基礎(chǔ)理論、生產(chǎn)和應(yīng)用的一門學(xué)科,它是按人為預(yù)先設(shè)計的方案進行酶的鑒定、分離純化,研究其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、酶源生物的誘變育種、酶分子修飾和酶基因改性、酶基因的克隆和表達以及酶的大量生產(chǎn)和應(yīng)用的系統(tǒng)工程。其發(fā)展必將促進生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,從而對人類社會的經(jīng)濟

3、生活產(chǎn)生重大影響。自然界中,酶的來源廣泛,它可以來自動物、植物和微生物。迄今已發(fā)現(xiàn)的酶有5000余種,其中已經(jīng)利用的有150種左右,工業(yè)化生產(chǎn)的酶約60余種,僅占已知酶的1.2%,而大規(guī)模生產(chǎn)的只有20多種,主要是利用微生物通過發(fā)酵法生產(chǎn)的。這是由于微生物不受季節(jié)、氣候和地域的限制。微生物繁育速度快、品種繁多、易培養(yǎng)、產(chǎn)量高,并且一般由動植物生產(chǎn)的酶大部分可以由微生物制備,或?qū)又参锏拿富蚩寺『?在微生物細胞中表達,故可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量酶制劑。所以微生物是生產(chǎn)酶的重要來源,對微生物酶資源的開發(fā)和應(yīng)用也就越來越顯得重要。1世界工業(yè)酶制劑生產(chǎn)概況酶從生物材料中被分離出來,并作成一種制劑,最早

4、的報道是1833年法國化學(xué)家A.Payen和Per oz 在麥芽抽提物的酒精沉淀內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種對熱不穩(wěn)定的物質(zhì),它具有從不溶性的淀粉顆粒內(nèi)分離出可溶性的糊精和糖的能力,命名為diastase(具有分離之意,麥芽淀粉酶、淀粉酶制劑,可以認為這是制備酶制劑的萌芽。事實上他們還首創(chuàng)了“酶”的詞尾2ase,一直被沿用至今。1874年,丹麥出現(xiàn)凝乳酶的廣告,它是從小牛第4胃的胃液和粘膜制備的,應(yīng)用于制造干酪,這是酶制劑商品化的開始。1894年,日本高峰讓吉博士以麩皮培養(yǎng)米曲霉,用水提取后,也用酒精沉淀獲得淀粉酶,應(yīng)用于棉布退漿和作消化劑,以后在美國開設(shè)Takam ine制藥廠生產(chǎn)高峰(他卡淀粉酶,真正實現(xiàn)了

5、微生物酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。此后的發(fā)展比較緩慢,直到1939年才改為使用枯草芽孢桿菌的2淀粉酶。20世紀四五十年代隨著抗生素深層發(fā)酵和菌種選育技術(shù)的進步,帶動了微生物酶制劑工業(yè)的發(fā)展。1941年丹麥成立了以微生物酶制劑的主要產(chǎn)品的Novo2nordisk(諾沃諾德公司;到八九十年代,國際上知名的酶制劑企業(yè)有70余家。由于世界市場經(jīng)濟的發(fā)展,經(jīng)過激烈的兼并和改組,迄今在世界酶制劑市場中,丹麥的Nov ozy mes公司(90年代中期由諾沃諾收稿日期:2005-02-25基金項目:安徽省自然科學(xué)基金(03043104、01043102、050450304,安徽省科技廳優(yōu)秀青年科技基金(0404305

6、1,安徽省教育廳自然科學(xué)基金(2005KJ192項目資助。作者簡介:潘仁瑞(1933-,男,江蘇常州人,教授,研究方向:微生物工程、蛋白質(zhì)工程;吳克(1964-,男,安徽合肥人,教授,研究方向:環(huán)境工程、酶工程;蔡敬民(19632,安徽合肥人,教授,合肥學(xué)院副院長,研究方向:生物工程、環(huán)境工程及酶學(xué)。8合肥學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版第15卷德公司改組而成獨占世界市場的40%,先后推出500多種酶制劑產(chǎn)品,銷售遍及130多個國家和地區(qū);美國Genencor國際公司則占20%,從而使該兩大公司具有了強大的競爭力。企業(yè)的兼并同時促進了人才的流動,技術(shù)的重組和優(yōu)化,大大縮短新產(chǎn)品的開發(fā)周期,擴大了酶的數(shù)量及

7、應(yīng)用領(lǐng)域。微生物酶制劑的世界市場規(guī)模在1978年還不足2億美元,到1990年增至5億美元。1993年以來世界工業(yè)用酶制劑的銷售和1997年以來酶制劑在各種應(yīng)用行業(yè)所占的份額概況分別見表1和表2。表11993-2002年世界工業(yè)用微生物酶制劑銷售概況由上述可得,1990年銷售額是1978年的2.5倍,而2002年銷售額是1990年的5.14倍;表明1990年以來由于酶制劑的廣泛使用,使相關(guān)企業(yè)在降低生產(chǎn)成本,改善產(chǎn)品品質(zhì),減少環(huán)境污染等方面獲得了顯著的效益;又由于微生物產(chǎn)物篩選、發(fā)酵和育種技術(shù)的改進,特別是遺傳工程用于菌種改良,新酶品種不斷出現(xiàn),應(yīng)用領(lǐng)域繼續(xù)擴大,使酶的產(chǎn)量迅速增長。再從表2可見

8、,在1997-2002的6年間,酶制劑銷售市場在各行業(yè)中的分配,食品和飼料業(yè)占總額的份額高達45.0%47.0%。洗滌和清洗劑占31.8%33.0%,紡織、制革和毛皮占10.0%11.0%,造紙和紙漿占6.5%7.5%;化學(xué)工業(yè)占3.7%4.0%。年平均增長率為12.2%,其中造紙和紙漿用酶增長最高,達16.2%。與1985年食品工業(yè)占酶制劑市場62%、洗滌用酶占33%、紡織制革占5%相比,洗滌用酶所份額基本保持不變,紡織、制革成倍增長,造紙業(yè)增長更快,而食品用酶所份額則相對下降。預(yù)計2008年世界酶制劑市場規(guī)模將達30億美元。2我國工業(yè)酶制劑生產(chǎn)概況1965年在輕工業(yè)部的主持下成立了無錫酶制

9、劑廠,這是我國首家采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)酶制劑的專業(yè)廠。為了促進微生物工業(yè)與酶制劑工業(yè)的發(fā)展,1970年在中國科學(xué)院和原國家科委主持下,舉辦了全國微生物展覽會,同時召開全國酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用座談會,輕工業(yè)部又于1976年成立了行業(yè)協(xié)會。至此,全國已開設(shè)酶制劑廠近20家。隨著改革開放,國外酶制劑產(chǎn)品進入國內(nèi)市場,接著外資和國外先進技術(shù)也被引進。1994年丹麥諾維信(Novozy mes公司的前身諾沃諾德公司董事會通過了在中國實施戰(zhàn)略投資計劃,迄今已累計投資1.8億美元,是外商在中國生物技術(shù)領(lǐng)域中最大的一筆投資,在北京成立子公司總部和研發(fā)中心,在天津、沈陽和蘇州建立生產(chǎn)基地,其公司產(chǎn)品占中國工業(yè)酶制劑

10、市場的份額高達50%。另一個國際酶制劑工業(yè)巨頭美國Genecor公司則和我國最大的酶制劑企業(yè)無錫酶制劑廠實行強強聯(lián)合,組建了杰能科(中國生物工程公司,其產(chǎn)品占中國酶制劑市場約20%的份額。外資進入國內(nèi)市場,帶來了先進的生產(chǎn)技術(shù)和經(jīng)營管理模式,促進功能酶制劑工業(yè)的發(fā)展,當時全國具有一定規(guī)模的酶制劑廠約有50家,其中有20多家的產(chǎn)品占國內(nèi)行業(yè)的80%以上,酶制劑品種增加到20余種。1970年我國生產(chǎn)工業(yè)酶制劑僅2kt,到1985年增至21kt,15年間產(chǎn)量增加了近10倍;至1995年,與1970年相比,增加了97倍;至2000年,30年間約增加了160倍。1991-2001年我國酶制劑工業(yè)生產(chǎn)概況

11、見表3。表319912001年我國工業(yè)酶制劑的產(chǎn)量及品種結(jié)構(gòu)淀粉加工用酶/%8687868280818380-其他/%1413141820191720-從表3可見,雖然我國酶制劑產(chǎn)量逐年增加,但酶的品種結(jié)構(gòu)極不合理;1993年以前淀粉加工用酶占總產(chǎn)量的85%以上,1994年以來,由于新產(chǎn)品的增加,上述比例稍有下降,但仍維持在80%左右。國內(nèi)的酶制劑企業(yè)還面臨外資企業(yè)的激烈競爭,目前市場銷售額外資和合資企業(yè)約占70%,而非外資企業(yè)僅占30%的份額;同時還存在著規(guī)模小,菌種選育和發(fā)酵水平偏低,生產(chǎn)成本較高,新產(chǎn)品、新技術(shù)和新應(yīng)用領(lǐng)域的研究開發(fā)滯后等問題。近年來,由于受全球市場經(jīng)濟一體化的影響,我國

12、的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)也在調(diào)整,企業(yè)也在向規(guī)模化、集約化、效益化發(fā)展;在工業(yè)酶制劑產(chǎn)量增長的同時,企業(yè)數(shù)減少,品牌集中度提高。目前全國酶制劑生產(chǎn)企業(yè)約30余家,其中年產(chǎn)萬噸以上的企業(yè)達10家,酶制劑的出口量也在逐年增加。企業(yè)平均規(guī)模增大,加大了技術(shù)投入,進行設(shè)備改造,引進技術(shù)和管理人才,生產(chǎn)的穩(wěn)定使生產(chǎn)成本進一步下降,增加了企業(yè)的風(fēng)險抵抗和對市場的承受能力,這是中國酶制劑行業(yè)走向真正發(fā)展的重要標志。3開發(fā)酶制劑新品種的重要性和有利條件目前作為生物技術(shù)的重要組成部分的酶工程已在國民社會經(jīng)濟中發(fā)揮了巨大作用,酶制劑工業(yè)得到了迅速發(fā)展。酶的特性表現(xiàn)在于常溫常壓下、簡單的設(shè)備中即可發(fā)生催化反應(yīng),其本身為蛋白質(zhì),無

13、毒性,易調(diào)控,作用底物專一,比一般化學(xué)催化劑的效率高,對于在構(gòu)型不同的物質(zhì)分子可以起轉(zhuǎn)化或拆分作用,使其廣泛地應(yīng)用在食品、釀造、紡織、制革、造紙、醫(yī)學(xué)、畜牧、日化和環(huán)境保護等諸多行業(yè)中。縱覽當今世界的酶制劑工業(yè)研究和發(fā)展動向,主要表現(xiàn)在國外酶制劑公司的兼并重組,酶制劑工業(yè)的發(fā)展具有壟斷化趨勢,加以大量資源投入,大力開發(fā)、研制新酶種和新用途,并應(yīng)用高新技術(shù)生產(chǎn)酶制劑,酶的品種多樣化等特點。而我國的酶制劑行業(yè)與發(fā)達國家相比,與大企業(yè)相比,還存在著很大差距,在技術(shù)方面表現(xiàn)為:酶的品種少,菌種選育和發(fā)酵水平低以及新技術(shù)、新產(chǎn)品、新應(yīng)用領(lǐng)域研究開發(fā)滯后等。為使我國酶制劑工業(yè)得以健康持續(xù)快速的發(fā)展,盡快適

14、應(yīng)國民經(jīng)濟發(fā)展的需要,必須加大科技和生產(chǎn)投入,積極推廣新技術(shù)、新工藝,提高酶的質(zhì)量,擴大酶的品種范圍,加大微生物酶新的菌種開發(fā),以期調(diào)整產(chǎn)品結(jié)構(gòu),參與國際競爭。在這一系列的行動中開發(fā)新的微生物酶的品種尤為重要,它對酶產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)調(diào)整起到了很大作用。同時新的酶品種開發(fā)和應(yīng)用,大多屬于自我創(chuàng)新,擁有自主知識產(chǎn)權(quán),有利于推動我國酶制劑行業(yè)的高速發(fā)展。我國具有新的微生物酶品種開發(fā)得天獨厚的有利條件。我國微生物資源豐富,從陸生、海洋到極端環(huán)境中都可以獲得大量產(chǎn)酶微生物菌種,從而發(fā)現(xiàn)、研制和開發(fā)新酶種;此外我國還擁有歷史悠久的固態(tài)發(fā)酵技術(shù),這為酶的生產(chǎn)打下了良好基礎(chǔ);并且,我國還擁有大批的生命科學(xué)工作者,通

15、過他們的努力,再加上新科學(xué)、新技術(shù)的推廣應(yīng)用,如基因工程、蛋白質(zhì)工程和定向進化(directed evoluti on 技術(shù)以及其他各種高新技術(shù)等在新酶種開發(fā)中應(yīng)用。自然界中蘊藏著巨大的微生物資源,這些資源被認為是待開發(fā)的優(yōu)勢資源。據(jù)測算1g 土壤中含有約1億個微生物,1mL 海水中也約有10萬個真菌、100萬個細菌。因此對這兩大類資源寶庫的開發(fā)具有重要意義。我們可以從土壤、腐木篩選相應(yīng)的產(chǎn)酶微生物,從污水中篩選各種能夠產(chǎn)生分解糖類、脂類、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素、環(huán)烴、芳香物質(zhì)、有機磷農(nóng)藥、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物。在極端環(huán)9第1期潘仁瑞,等:微生物酶資源的開發(fā)和利用(上01合肥

16、學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版第15卷境條件下,可篩選嗜熱微生物、嗜堿微生物、嗜鹽微生物、嗜酸微生物、耐高壓微生物等,并開發(fā)極端微生物酶品種。此外,還應(yīng)加大海洋微生物分離鑒定工作,建立微生物培養(yǎng)體系和相關(guān)酶活力測定手段和方法,探索新的酶種。4快速開發(fā)具有應(yīng)用價值新酶的途徑微生物在自然界數(shù)十億年的進化過程中,各類微生物都形成了一套適合自身在不同環(huán)境條件下進行新陳代謝的酶系。當人們將這些生物催化劑應(yīng)用于工業(yè)過程中進行催化反應(yīng)時,由于酶是由蛋白質(zhì)構(gòu)成,常常遇到酶的穩(wěn)定性下降,不能適應(yīng)極端的工藝條件,以及產(chǎn)物的抑制作用等問題。為了尋找具有新的功能和特性的酶,傳統(tǒng)的方法是從自然界分離新的菌種,通過篩選獲得新酶,再

17、通過人工突變,篩選適合工藝條件的酶系,然后進行工業(yè)生產(chǎn)。但這一過程費時較長,經(jīng)常要花費數(shù)年時間的努力。另一條途徑是改造現(xiàn)有的酶,在20世紀60年代,主要采用對酶分子進行修飾或固定化處理;70年代開始采用基因工程的方法,來提高酶的產(chǎn)量。80年代又出現(xiàn)以計算機三維結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測和基因定點突變?yōu)榛A(chǔ)的蛋白質(zhì)工程,通過改變酶基因DNA的某些核苷酸序列,從而改變酶蛋白的某些特性,例如提高熱穩(wěn)定性、pH適應(yīng)性、抗氧化等特性。但這一技術(shù)的應(yīng)用必須了解酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)和三維空間結(jié)構(gòu),搞清楚結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,所以其應(yīng)用面有一定的局限性;而在我國目前的技術(shù)條件下,也要經(jīng)過數(shù)年的努力才能達到這一要求。微生物的蛋白

18、質(zhì)基因在自然進化的過程發(fā)生突變的幾率較小,自然選擇使進化方向有利于生物適應(yīng)生活環(huán)境的方向發(fā)展;人工選擇則可使進化朝適合人類需求的方向發(fā)展。人們設(shè)想是否可以在實驗室模仿自然進化的過程,在短時間內(nèi)完成漫長的自然進化過程。關(guān)于蛋白質(zhì)和酶分子體外分子進化(in vitr o molecular evoluti on的研究,歸納起來有兩種設(shè)計理念:一種是理性的設(shè)計(rati onal design在已經(jīng)獲得蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)信息的情況下,按照計算機模擬試驗的預(yù)測,然后進行定點突變以改造蛋白質(zhì)的性狀,即上面提到的蛋白質(zhì)工程;另一種是非理性的設(shè)計,由于對于大多數(shù)蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)了解甚少,則可以根據(jù)人為設(shè)定的

19、目標,對特定蛋白質(zhì)的性質(zhì),通過DNA分子隨機突變、隨機重組和定向篩選,使之適合人類的需要,可以在較短時間內(nèi)完成漫長的自然進化過程,這一技術(shù)被稱之為定向進化。美國Affy max研究院的Ste mmer在1994年首先報道了一種簡單、快速而有效的體外定向進化技術(shù),稱之為DNA隨機拼接(DNA shuffling,可以對單一基因、家族基因、質(zhì)粒、代謝途徑、部分甚至整個基因組進行改造?，F(xiàn)將其操作流程和基本原理簡介如下:(1在獲得目的基因的DNA片段后,在Dnase I的作用下隨機消化,隨機片段的大小,視整個目的DNA的長度而定,通常是50100bp。(2進行無引物的PCR/重組裝PCR(rease

20、mbly PCR:由于沒有額外添加引物,在變性、退火過程中,在DNA聚合酶的作用下,根據(jù)不嚴格的序列同源性,小片斷間會進行隨機的群體性配對(pool w ise。由于配對的不精確性,就會引入突變和重組,其突變形式多樣,包括點突變、缺失、插入、顛倒、整合等類型。經(jīng)過多輪循環(huán),不斷延伸,并重新組裝成完整長度的核酸序列,這一過程稱之為再組裝PCR。(3引物PCR、基因表達和篩選:添加引物進行常規(guī)PCR,以擴增無引物PCR中產(chǎn)生的重組裝產(chǎn)物,然后將其插入合適的表達載體,轉(zhuǎn)化宿主進行表達,通過選擇壓力的設(shè)置、模型的建立進行定向選擇或篩選。篩選方法可以采用常規(guī)的瓊脂平皿,根據(jù)目的不同選擇特定的底物,有的可

21、再加顏色指示劑,根據(jù)菌落周圍透明圈或顏色圈來選擇陽性突變體,淘汰陰性和中性的突變體,但此法不能精確定量。也可采用高通量篩選(H igh thr oughput screening,此法是以96-微孔板或384-微孔板作為實驗工具,酶作用的底物和生成的產(chǎn)物不必分離,以自動化系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程,以靈敏快速的檢測儀器采集數(shù)據(jù),例如熒光檢測系統(tǒng),用計算機處理數(shù)據(jù)。使檢測過程標準化、定量化,大大加快篩選速度。利用此篩選程序能鑒定出酶對底物的特異性、熱穩(wěn)定性、對映體選擇性及其他特定的性狀。所獲得的陽性突變體,可以作為下一輪篩選的目的基因。用于定向進化的方法還有:通過易錯PCR(err or p r one

22、PCR或致突變菌株(mutalt or strain產(chǎn)生隨機突變、化學(xué)誘變劑介導(dǎo)的隨機突變、限制性酶切再連接介導(dǎo)的基因重組(Recombining the genes by re2stricti on and religati on、隨機引導(dǎo)重組(Rando m p ri m ing recombinati on和交錯延伸技術(shù)(Staggered extensi on p r ocess等。利用定向進化的方法改造工業(yè)用酶已取得初步成效:Ste mmer(1994使-內(nèi)酰胺酶對新底物cef o2 taxi m e的活性提高了32000倍,酶分子中有6個氨基酸發(fā)生突變。Zhang等(1997改造-

23、半乳糖苷酶,其底物特異性提高了1000倍,酶活性提高66倍,有6個氨基酸發(fā)生突變。Zhao等(1998在保持酶活力不變的條件將枯草桿菌蛋白酶E的作用溫度提高了17,Matsu mura等(1999提高了-葡萄糖苷酸酶對戊二醛和甲醛的抗性,酶分子有6個氨基酸發(fā)生突變。以上是單基因酶定向改造的幾個實例,對于家族基因酶的應(yīng)用也有報道。Giver等(1998使對-硝基苯酯酶的活力提高了56倍,熱穩(wěn)定性的T m值提高14。Ku ma maru等(1998報道能提高聯(lián)苯雙加氧酶對環(huán)境污染物聚氯化聯(lián)苯降解的底物專一性和活性。Kikuchi等(1999使兒茶酚雙加氧酶的熱穩(wěn)定性提高了1326倍。利用DNA隨機拼接技術(shù),通過多種突變,可以有效協(xié)調(diào)一個代謝途徑中不同基因間的相互作用,使總的代謝效果迅速進化。例如,Cra men等(1997報導(dǎo)應(yīng)用于砷酸鹽的解毒途徑,使對砷酸鹽的抗性提高40倍,這是用其他策略難以做到的。5微生物酶的應(yīng)用方式酶的應(yīng)用方式可以是直接使用某一種酶催化某一化學(xué)過程