成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離_鑒定和生物學(xué)特性

1、中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù) 第 12 卷 第 43 期 20081021 出版 Vol.12 No.43 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research October 21, 2008 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)特性 杜振宗1，任 華2，張超紀(jì)2，宋劍非1，鄭 民1，李 牧1 Isolation, identification and biological characteristics of adult bone marrow mesenchymal stem cells Du Zhen-

2、zong1, Ren Hua2, Zhang Chao-ji2, Song Jian-fei1, Zheng Min1, Li Mu1 Abstract BACKGROUND: With the capacity of self-renewal and multi-directional differentiation to various cell lineages and proliferation, bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs are few. In vitro purification and amplification are

3、very important. OBJECTIVE: To establish the method of in vitro harvesting, culturing and purifying BMSCs, and to investigate proliferation and growth of BMSCs. DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was performed from May 2006 to December 2007 at the Laboratory of Department of Cardio

4、thoracic Surgery of Peking Union Hospital and Central Laboratory of Affiliated Hospital of Guilin Medical College. MATERIALS: Bone marrow blood was collected from adult ribs bone marrow. METHODS: Adult bone marrow blood was collected. Adult human mononuclear cells were harvested using Ficoll lymphoc

5、yte separating medium at a density of 1.077. BMSCs were collected by the adherence method. Second and third passages of BMSCs were frozen at -80 , and resuscitated 24 hours later to observe number of living cells. These cells were amplified at a density of 2×103/cm2, and kept the density from 2

6、×103/cm2 to 8×103/cm2. MAIN OUTCOME MEASURES: Phase-contrast inverted microscope and inverted microscope were used to observe morphological changes. Cell antigen expression was examined by flow cytometry. Cell growth curves of primary and passage culture was drawn by using cell counting. R

7、ESULTS: Cells became to adhere after 3-4 hours of primary culture. Twenty-four hours later, number of adhered cells significantly increased. Three days later, adhered cells were single or several cell clones, distributed disorderly and showing spindle-shape. Seven to nine days later, colonies rapidl

8、y increased and cell confluence was presented. Cell number increased about 10 folds. Ten to twelve days later, cell number increased about 20 folds. Cells spread to the bottom and arranged in order, showing whirlpool-shape. Cells in center of the whirlpool showed multiple layers. BMSCs were positive

9、ly expressed KDR, CD105, but absence of CD34, CD45, CD11a, CD14, HLADR. Growth curve of primary passage of BMSCs showed that growth latency at 2-6 days, increased logarithmic phase at 8-10 days, platform phase at 12-14 days, passage culture of latency at 24-48 hours, increased logarithmic phase at 4

10、-6 days. Cell proliferation and growth gradually became slow, and cell entered the platform phase at 8-9 days after incubation. CONCLUSION: Using density gradient centrifugation and adherence method, BMSCs have great proliferation ability, positively express KDR, CD105, but absence of CD34, CD45, CD

11、11a, CD14, HLA-DR. Du ZZ, Ren H, Zhang CJ, Song JF, Zheng M, Li M.Isolation, identification and biological characteristics of adult bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(43:8495-8499 1 Department of Cardiothoracic Surgery, Affiliated Hospital

12、of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Cardiothoracic Surgery, Peking Union Hospital, China Union Medical University, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China Du Zhen-zong, Doctor, Associate professor, Associate chief physi

13、cian, Department of Cardiothoracic Surgery, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China duzhenzong Received: 2008-04-24 Accepted: 2008-07-24 摘要 背景：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制的能力、多向分化和增殖的潛能，但骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量極少，因此體外純 化和擴(kuò)增極其重要。 目的：擬建立體外分離培養(yǎng)、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，觀察其增殖及生

14、長(zhǎng)特性。 設(shè)計(jì)、時(shí)間及地點(diǎn)：?jiǎn)我粯颖居^察實(shí)驗(yàn)，于 2006-05/2007-12 在北京協(xié)和醫(yī)院胸心外科實(shí)驗(yàn)室和桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí) 驗(yàn)室完成。 材料：骨髓血來(lái)源于成人肋骨骨髓。 方法：收集成人骨髓血，采用密度為 1.077 的 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液提取成體人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易 于貼壁的特性除去未貼壁細(xì)胞獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。取第 23 代細(xì)胞在-80 條件下凍存，24 h 后復(fù)蘇，觀察活細(xì)胞數(shù)， 按 2×103/cm2 種植擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)保持細(xì)胞密度為 2×103/cm28×103/cm2。 主要觀察指標(biāo)：倒置顯微鏡和相差倒置顯微鏡

15、觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞抗原表達(dá)，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法繪制 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 結(jié)果：原代培養(yǎng)接種三四小時(shí)后細(xì)胞開(kāi)始貼壁,24 h 后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多, 3 d 后貼壁細(xì)胞為單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞克隆，散在 分布，大部分細(xì)胞呈紡錘形。79 d 后集落迅速增多細(xì)胞融合,細(xì)胞數(shù)量約增加了 10 倍；1012 d，細(xì)胞數(shù)量增加了約 20 倍， 鋪滿(mǎn)了全層， 細(xì)胞排列也有一定的方向性， 呈旋渦樣生長(zhǎng)， 旋渦中心細(xì)胞呈多層分布。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá) KDR、 CD105， 不表達(dá) CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR 等。原代細(xì)胞培養(yǎng)曲線(xiàn)顯示，第 26 天為生長(zhǎng)潛伏期

16、，第 810 天進(jìn)入對(duì)數(shù) 增長(zhǎng)期，第 1214 天進(jìn)入個(gè)平臺(tái)期；傳代培養(yǎng)的潛伏期為 2448 h，對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期為 46 d，細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)逐漸緩慢，接 種后 8 到 9 天進(jìn)入平臺(tái)期。 結(jié)論： 利用密度梯度離心和貼壁的方法獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有大量增殖的能力， 表達(dá) CD105、 KDR， 不表達(dá) HLA-DR、 CD34、CD45、CD11a、CD14。 關(guān)鍵詞：骨髓；間充質(zhì)干細(xì)胞；原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)；生長(zhǎng)曲線(xiàn) 杜振宗，任華，張超紀(jì)，宋劍非，鄭民，李牧.成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)特性J.中國(guó)組織工程研究與臨 床康復(fù)，2008，12(43:8495-8499 1 桂林醫(yī)學(xué)院附

17、屬 醫(yī)院胸心外科， 廣 西 壯 族 自治 區(qū) 桂 林 市 541001 ； 2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué) 院， 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科 大學(xué)， 北京協(xié)和醫(yī) 院胸心外科， 北京 市 100730 杜 振 宗 ， 男 ， 1972 年生，河南 省 鄧 州 市人 ， 漢 族，2006 年中國(guó) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院畢業(yè)， 博士，副教授，副 主任醫(yī)師， 主要從 事 干 細(xì) 胞和 組 織 工 程 在 胸心 外 科 的應(yīng)用研究。 duzhenzong 中圖分類(lèi)號(hào):R0394.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1673-8225 (200843-08495-05 收稿日期：2008-04-24 修回日期：2008-07-24 (54200804

18、230028 / GWQ ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 8495 杜振宗，等. 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)特性 >> 本 文 導(dǎo) 讀 < < 課 題 背 景 ：課題組 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞多向分化和增殖 潛能進(jìn)行了較系統(tǒng) 的研究。本文所建立 的有效分離、鑒定骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 方法，為后續(xù)研究其 誘導(dǎo)分化功能、構(gòu)建 出組織工程化血管 奠定基礎(chǔ)。 作 者 介 紹 ： 文章第二作者任華教授為醫(yī)學(xué)博士，先后 主持完成了衛(wèi)生部科研基金“激光心肌打孔治療冠心病 的實(shí)驗(yàn)研究” ，CBM 科研基金“犬單側(cè)肺移植模型

19、的建 立及改進(jìn)”“十五”攻關(guān)課題“肺動(dòng)脈血栓栓塞規(guī)范化診 ， 斷和治療”外科部分，北京協(xié)和醫(yī)院重點(diǎn)科研基金“葉輪 式左心輔助裝置治療心衰的實(shí)驗(yàn)研究” ，首都發(fā)展基金“骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療冠心病的實(shí)驗(yàn)研究” 北京協(xié)和醫(yī) ， 院重點(diǎn)科研基金“骨髓干細(xì)胞的定向分化研究” ，北京協(xié)和 醫(yī)院科研基金“骨髓干細(xì)胞移植治療心梗后室壁運(yùn)動(dòng)障礙 的研究” ，北京協(xié)和醫(yī)院科研基金“小口徑組織工程血管的 構(gòu)建” 主要負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制和技術(shù)指導(dǎo)。 。 偏 倚 或 不 足 ：目前尚未 發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特 異性標(biāo)志物， 實(shí)驗(yàn)僅是對(duì)細(xì)胞 的形態(tài)特點(diǎn)和部分表型進(jìn)行 研究， 對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 的鑒定并不全面。

20、培養(yǎng)該細(xì) 胞一般是采用含有胎牛血清 的培養(yǎng)基， 本文應(yīng)用的異體或 異種血清是不安全的， 因?yàn)榭?能含有對(duì)細(xì)胞不利的因素。 度和結(jié)構(gòu)功能無(wú)明顯差異。 0 引言 間充質(zhì)干細(xì)胞具有造血支持、免疫調(diào)節(jié)、多向分化 等潛能，易于轉(zhuǎn)染和表達(dá)外源基因，是細(xì)胞治療和基因 治療理想的載體和靶細(xì)胞1-2。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分化 為造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，還可以分化為造血以外的 細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的細(xì)胞，如骨細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì) 胞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，這種跨系統(tǒng)，甚至跨胚層的分化特 性稱(chēng)為“可塑性” 3-8 實(shí)驗(yàn)利用密度梯度離心和貼壁的方法，將間充質(zhì)干 細(xì)胞自骨髓血中分離

21、出來(lái)，并加以純化、鑒定，進(jìn)一步 在體外的培養(yǎng)條件下觀察其增殖及生長(zhǎng)的特性。 1 材料和方法 設(shè)計(jì)：?jiǎn)我粯颖居^察。 時(shí)間及地點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)于2006-05/2007-12在北京協(xié)和醫(yī) 院胸心外科實(shí)驗(yàn)室和桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 完成。 材料：骨髓血來(lái)源于成人肋骨骨髓，標(biāo)本為胸心外 科手術(shù)中切除、廢棄的肋骨，排除血液系統(tǒng)疾病、骨轉(zhuǎn) 移性腫瘤,在手術(shù)切除后2 h內(nèi)提取單個(gè)核細(xì)胞。術(shù)前告 知患者并簽署知情同意書(shū)，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 試劑、儀器及設(shè)備 DMEM- LG 培養(yǎng)基 雙抗（青霉素 20 000 U/mL、 鏈霉素 20 000 ng/mL） 胰蛋白酶消化液、細(xì)胞培養(yǎng) 專(zhuān)用凍存液 胎牛血清(

22、fetal bovine serum /FBS HyClone, 美國(guó) 鼠抗人單克隆抗體 CD105-FITC、Santa cruz, 美國(guó) HLA-DR-PE、CD34-PE、 CD45-PE、CD11a-FITC、 CD14-FITC、KDR Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液 CO2 培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡 相差倒置顯微鏡 普通光學(xué)顯微鏡、 低溫超速離心機(jī) 免疫熒光顯微鏡 掃描電鏡(JSM6000F、 透射電鏡（JEM1010） Nikon,80I，日本 日本電子株式會(huì)社 Uppsala ,瑞典 Nikon,日本 Nikon,TE2000，日本 Heraeus,biofuge stratos,德國(guó)

23、 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心 來(lái)源 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心 。 種子細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)傳代是組織工程的基本要 素， 細(xì)胞主要來(lái)源于自體、 同種異體及異種組織細(xì)胞等， 而自體組織細(xì)胞為首選。組織工程需要高濃度的種子細(xì) 胞接種， 間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度增殖、 自我更新的能力， 而且來(lái)源廣泛 9-11 ，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制的 能力，并且可以經(jīng)過(guò)不可逆的終末分化過(guò)程產(chǎn)生子代細(xì) 胞，因其具有來(lái)源充足、取材方便、創(chuàng)傷小、無(wú)排斥反 應(yīng)、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，成為組織工程較為理想的種子 細(xì)胞來(lái)源 10 。本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)可獲得(12×10 個(gè)細(xì)胞, 5 傳

24、至第5代可獲得約4×108個(gè)細(xì)胞；擴(kuò)增10代,細(xì)胞數(shù)約 8×1010,基本滿(mǎn)足組織工程的需要。 骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量極少，因此體外純化和 擴(kuò)增極其重要。2001年Reyes等12報(bào)道了提取純化擴(kuò)增 成體人骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，利用免疫磁珠方法 去除CD45+ GlyA+細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在纖維粘連蛋白預(yù)凝 的培養(yǎng)皿內(nèi)，發(fā)現(xiàn)2.5×1055×106骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以 貼壁形成細(xì)胞集落， 細(xì)胞倍增時(shí)間是4872 h， 細(xì)胞在體 外可以增殖60個(gè)倍增以上。2002年Lodie等13比較密度 梯度離心貼壁免疫磁珠陰性選擇CD45 GlyA 或 陽(yáng)性選擇CD1

25、05 ， 觀察不同提取方法結(jié)合不同的培養(yǎng)體 系對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞純度及干細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的影響，結(jié)果 提示盡管提取方法和培養(yǎng)體系不同，間充質(zhì)干細(xì)胞的純 8496 + P.O. Box 1200, Shenyang 110004 kf23385083 杜振宗，等. 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)特性 實(shí)驗(yàn)方法： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離： 無(wú)菌條件下， 用含肝素 0.01%PBS 剛接種的單個(gè)核細(xì)胞懸液中細(xì) 單個(gè)核細(xì)胞以105/cm2接種于培養(yǎng)基中， 胞呈圓形,大小不一,不能辨認(rèn)細(xì)胞核。 原代培養(yǎng)接種三四小時(shí)后細(xì)胞開(kāi)始貼壁。 24 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多,第2天幾乎所有的細(xì)胞都沉淀到瓶底， 部分

26、已變成橢圓形。 3 d后貼壁細(xì)胞為單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞克隆，散在分布，大部分細(xì)胞呈紡錘 形，少數(shù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)空泡，可見(jiàn)少數(shù)圓形貼壁細(xì)胞，少部分呈多角 形，見(jiàn)圖1。 50 mL 稀釋?zhuān)浞只靹颍D(zhuǎn)入離心管，1 500 r/min、20 離 心 20 min ， 棄 上 清 及 脂 肪 層 ； 沉 淀 用 無(wú) 血 清 DMEM-LG 充分混勻，取 20 mL 骨髓稀釋液輕輕疊加 到 20 mL Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（密度為 1.077× 103 g/L）上，2 000 r/min、20 離心 30 min；收集單 個(gè)核細(xì)胞層，用無(wú)血清 DMEM-LG 洗滌 2 次，分別離 心 1 50

27、0 r/min，10 min，收集單個(gè)核細(xì)胞。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定：收集到的單 個(gè)核細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)液，按 105/cm2 種于 25 cm2 培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37 ，體積分?jǐn)?shù)為 0.05 的 CO2，飽和濕度 的 CO2 孵箱培養(yǎng)；3 d 后半量更換培養(yǎng)液，2 3 d 換液 1 次，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底后用胰蛋白酶消化液消化，14 比例傳代、擴(kuò)增。收集第 23 代（P2P3）細(xì)胞-80 凍存, 24 h 后復(fù)蘇， 觀察活細(xì)胞數(shù)， 2×103/cm2 種植 按 擴(kuò)增， 擴(kuò)增時(shí)保持細(xì)胞密度為 2×103/cm28×103/cm2。 鑒定：取凍存前后部分細(xì)胞行流式

28、細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞抗 原表達(dá) （CD34、 CD45、 CD11a， CD14、 KDR、 CD105、 HLADR） 。 繪制原代和傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)：將培養(yǎng)分離的 79 d后： 集落迅速增多細(xì)胞融合,細(xì)胞數(shù)量約增加了10倍。 1012 d： 細(xì)胞數(shù)量增加了約20倍， 鋪滿(mǎn)了全層， 細(xì)胞排列也有一定的方向性， 呈旋渦樣生長(zhǎng)，旋渦中心細(xì)胞呈多層分布，細(xì)胞界限不清，細(xì)胞形 態(tài)主要呈多角形。 ： P3后（約第21天后） 細(xì)胞由梭形變?yōu)槠教?、寬大，分裂相減少，胞質(zhì)疏松，可見(jiàn)空泡， 細(xì)胞增殖緩慢，見(jiàn)圖2。 圖1 Figure 1 Primary culture of human bone marrow

29、 mesenchymal stem cells at 3 days (Phase-contrast inverted microscope, ×100 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)第 3 天(相差倒置顯微鏡， ×100 有核骨髓細(xì)胞按照每孔 3×10 細(xì)胞的密度接種于 6 孔 培養(yǎng)板內(nèi)，37 、體積分?jǐn)?shù)為 0.05 的 CO2 條件下培 養(yǎng)，于接種的第 3 天進(jìn)行第 1 次換液，僅更換一半， 以后隔日全部換液。每天抽取 3 個(gè)培養(yǎng)孔用胰酶將貼 壁細(xì)胞消化分離，計(jì)算其均值，直至貼壁細(xì)胞鋪滿(mǎn)整 個(gè)培養(yǎng)孔的底部，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析，作為原 代細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析；將

30、隨機(jī)抽取作為原代培 養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析的 P1 代細(xì)胞分為 2 組，一組連 同其余樣本的第 1 代一并留做后續(xù)實(shí)驗(yàn)用，另一組則 轉(zhuǎn)入 6 孔板中作為傳代培養(yǎng)的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析。每天 抽取 3 個(gè)培養(yǎng)孔用胰酶將貼壁細(xì)胞消化分離，計(jì)算其 均值，直至貼壁細(xì)胞鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)孔的底部，進(jìn)行細(xì) 胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析，作為傳代細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)分 析。 主要觀察指標(biāo)：倒置顯微鏡和相差倒置顯微鏡進(jìn) 行細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察， 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞抗原表達(dá)， 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法繪制原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生 長(zhǎng)曲線(xiàn)。 設(shè)計(jì)、 實(shí)施、 評(píng)估者： 實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)由第一作者完成， 實(shí)施由第一至六作者完成，評(píng)估由第二作者完成，均接 受過(guò)專(zhuān)

31、業(yè)培訓(xùn)。 2 結(jié)果 4 Figure 2 圖2 The third passage culture of human bone marrow mesenchymal stem cells (Phase-contrast inverted microscope, ×100 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng) P3(相差倒置顯微鏡，× 100 細(xì)胞培養(yǎng)至 P10（約 50 d） ，部分細(xì)胞由梭形變?yōu)?圓形，并可見(jiàn)到有折光的細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生。 2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)曲線(xiàn)分析 接種 后的第 26 天為生長(zhǎng)潛伏期，此期主要為細(xì)胞的貼壁 生長(zhǎng)階段， 培養(yǎng)細(xì)胞的增殖不甚活躍， 78 天開(kāi)

32、始， 第 倒置顯微鏡下可以觀察到貼壁細(xì)胞已形成大小不一的 8497 2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)觀察 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 杜振宗，等. 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)特性 多個(gè)細(xì)胞克隆， 細(xì)胞增殖開(kāi)始變的活躍； 810 天這 第 些細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大，許多細(xì)胞克隆彼此融合、相 連， 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示此階段細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)級(jí)遞增， 此期為原代培養(yǎng)的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；第 1214 天，細(xì)胞克 隆彼此相連并鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)孔的底面，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn) 顯示細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。 2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)曲線(xiàn)分析 于P10后 開(kāi)始出現(xiàn)

33、衰老的現(xiàn)象，多于接種后89 d即可鋪滿(mǎn)整個(gè)培 養(yǎng)孔的孔底。選擇P0、P5、P10 3代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn) 行觀察比較，發(fā)現(xiàn)具有以下特征：傳代培養(yǎng)的潛伏期為 2448 h，傳代培養(yǎng)的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期為46 d，接種后89 d， 細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)逐漸緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期，見(jiàn)圖3。 P0 150 Cells number(1 000 100 P5 P10 不表達(dá)HLA-DR,CD34、CD45、CD11a、CD14；凍 存后細(xì)胞CD105細(xì)胞表達(dá)數(shù)升高達(dá)95%以上，見(jiàn)圖6，其 余細(xì)胞表型無(wú)改變。 After cryopreservation 95% Figure 6 Phenotype of bone ma

34、rrow mesenchymal stem cells (CD105,after cryopreservation 圖 6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型(CD105,凍存后 3 討論 實(shí)驗(yàn)基于Reyes和Lodie 等的方法并進(jìn)行改進(jìn)， 用密 50 0 1 2 3 4 5 t/d 6 7 8 9 10 度為1.077的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液提取成體人骨髓單個(gè) 核細(xì)胞，根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于貼壁的特性除去未 貼壁細(xì)胞， 在含培養(yǎng)基中低密度種植培養(yǎng)擴(kuò)增， 取第23 代細(xì)胞在-80 條件下凍存，24 h后復(fù)蘇，復(fù)蘇成活率 80%85%，少量圓形貼壁細(xì)胞及空泡細(xì)胞消失，細(xì)胞形 態(tài)較為單一呈紡錘型，之后

35、細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變可繼續(xù)培養(yǎng) 六七代。本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)可獲得約（12）×105個(gè)細(xì)胞, 傳至第5代可獲得約4×108個(gè)細(xì)胞；擴(kuò)增10代,細(xì)胞數(shù)約 8×1010,基本滿(mǎn)足組織工程的需要。 Young等14認(rèn)為應(yīng)用 凍存方法處理細(xì)胞可以去除98的成纖維細(xì)胞和已分 化細(xì)胞，有助于純化干細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Young等14 Before Cryopreservation 85% Figure 3 Growth curves of human bone marrow mesenchymal stem cells at P0, P5, P10 passage culture 圖 3

36、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的 P0、P5、P10 生長(zhǎng)曲線(xiàn) 2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的的表面抗原鑒定 本實(shí)驗(yàn)分析了 5 個(gè)標(biāo)本， 流式細(xì)胞儀及結(jié)果顯示： 凍存前細(xì)胞免疫表型分 析結(jié)果，細(xì)胞高表達(dá) CD105, 表達(dá)率 85%左右，見(jiàn)圖 4。 結(jié)果相一致。當(dāng)然，分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方 法很多，Nadri等 15 的研究證實(shí)，用免疫磁珠法篩選 CD34(+細(xì)胞，再行貼壁法培養(yǎng)，也可分離、純化骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)該細(xì)胞一般是采用含有胎牛血清的 培養(yǎng)基，但異體或異種血清是不安全的，因?yàn)榭赡芎?對(duì)細(xì)胞不利的因素，故有研究采用自體血清為培養(yǎng)基， 證實(shí)可安全、有效地培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞16。 雖然目前

37、尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志 物，Pittenger等17認(rèn)為CD29、CD44、CD105、CD166、 SH2、SH3為間充質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)凍存 后進(jìn)行擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀研究細(xì)胞表 面抗原表達(dá)發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞抗 原，如造血前提細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34,白血胞標(biāo)志抗原 CD45,淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a，單核巨噬細(xì)胞表面抗 原CD14， 同時(shí)不表達(dá)分化抗原HLA-DR,而CD105由凍存 Figure 4 圖4 Phenotype of bone marrow mesenchymal stem cells (CD105, before cry

38、opreservation 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型(CD105,凍存前 弱表達(dá)KDR，見(jiàn)圖5。 Figure 5 Phenotype of bone marrow mesenchymal stem cells (KDR 圖 5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型(KDR 前表達(dá)85%左右升高到凍存后95%以上。以上結(jié)果顯示 利用該實(shí)驗(yàn)方法，梯度離心、細(xì)胞貼壁和細(xì)胞凍存的方 法提取擴(kuò)增細(xì)胞，可以獲得足夠量的未分化的較為單一 8498 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 kf23385083 杜振宗，等. 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定和生物學(xué)特性 6 Bedada FB, Gun

39、ther S, Kubin T, et al. Differentiation versus plasticity: fixing the fate of undetermined adult stem cells. Cell Cycle 2006;5(3:223-226 Keilhoff G, Goihl A, Langnase K, et al. Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-like myelinating cells. Eur J Cell Biol 2006;85(1:11-24 De

40、rfoul A, Perkins GL, Hall DJ, et al. Glucocorticoids promote chondrogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells by enhancing expression of cartilage extracellular matrix genes. Stem Cells 2006;24:1487-1495 Summer R, Fitzsimmons K, Dwyer D, et al. Isolation of an adult mouse lung mese

41、nchymal progenitor cell population. Am J Respir Cell Mol Biol 2007;37(2:152-159 Mageed AS, Pietryga DW, DeHeer DH, et al. Isolation of large numbers of mesenchymal stem cells from the washings of bone marrow collection bags: characterization of fresh mesenchymal stem cells. Transplantation 2007;83(8

42、:1019-1026 Peng HH, Wang TH, Chao AS, et al. Isolation and differentiation of human mesenchymal stem cells obtained from second trimester amniotic fluid; experiments at Chang Gung Memorial Hospital. Chang Gung Med 2007;30(5:402-407 Reyes M, Lund T, Lenvik T, et al. Purification and ex vivo expansion

43、 of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 2001； 98(9:2615-2625 Lodie TA, Blickarz CE, Devarakonda TJ, et al. Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow-derived stem cells reveals a lack of distinction. Tissue Eng 2002;8(5:739-751 Young HE, S

44、teele TA, Bray RA, et al. Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec 2001;264(1:51-62 Nadri S, Soleimani M. Isolation murine mesenchymal stem cells by positive selectio

45、n. In Vitro Cell Dev Biol Anim JT- In vitro cellular & developmental biology. Animal 2007;43(8-9:276-282 Lange C, Cakiroglu F, Spiess AN, et al. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Phy

46、siol 2007;213(1:18-26 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284(5411:143-147 Stenderup K, Justesen J, Clausen C, et al. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal

47、 cells. Bone 2003;33(6:919-926 Fehrer C, Lepperdinger G. Mesenchymal stem cell aging. Exp Gerontol 2005;40(12:926-930 Meirelles Lda S, Nardi NB. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol 2003;123(4:702-711 Tokalov SV, Gruener S, Sch