微生物的生長及其調(diào)控

1、第六章 微生物的生長及其調(diào)控一、目的要求要求學(xué)生掌握微生物生長的研究方法，了解調(diào)控微生物生長繁殖的因素。二、教學(xué)內(nèi)容1微生物純培養(yǎng)的生長2測定微生物生長的方法3微生物的生長規(guī)律4影響微生物生長的因素三、重點內(nèi)容微生物的生長測定與微生物生長的規(guī)律四、教學(xué)方法采用多媒體教學(xué)微生物在適宜的條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)并按照自己的代謝方式進行代謝活動，如同化作用大于異化作用，則細(xì)胞質(zhì)的量不斷增加，體積得以加大，于是表現(xiàn)為生長。所謂生長就是指生物個體由小到大的增長，即表現(xiàn)為細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加；繁殖是指生物個體數(shù)目的增加。但是在單細(xì)胞微生物中，生長繁殖的速度很快，而且兩者始終交替進行，個體生長與繁

2、殖的界限難以劃清，因此實際上常以群體生長作為衡量微生物生長的指標(biāo)。群體生長的實質(zhì)是包含著個體細(xì)胞生長與繁殖交替進行的過程。第一節(jié) 微生物生長的測定微生物生物情況可以通過測定單位時間里微生物數(shù)量或生物量的變化來評價。通過微生物生長的測定可以客觀地評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響，或評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制（或殺死）作用的效果，或客觀反應(yīng)微生物的生長規(guī)律。因此微生物生長的測量在理論上和實踐上有著重要的意義。微生物生長的測量有計數(shù)、重量和生理指標(biāo)等方法。1計數(shù)法此法通常用來測定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。計數(shù)法又分為直接計數(shù)法和間接計數(shù)兩類。 （1）直接計數(shù)

3、 這類方法是利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點不能區(qū)分死菌與活菌。計數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個特定的面積1mm2和高o.1mm的計數(shù)室，在1mm2的面積里又被刻劃成25個(或16個)中格，每個中格進一步劃分成16個(或25個)小格，但計數(shù)室都是由400個小格組成。將稀釋的樣品滴在計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計算4-5個中格的細(xì)菌數(shù)，并求出每個小格所含細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)×400× l0 000×稀釋倍數(shù) (2)間接計數(shù)法 此法又稱活菌計數(shù)法，其

4、原理是每個活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.2ml放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至45左右的培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入適宜溫度的培養(yǎng)箱或溫室培養(yǎng)，長出菌落后，計數(shù)，按下面公式計算出原菌液的含菌數(shù)： 每毫升原菌液活菌數(shù)同一稀釋度三個以上重復(fù)平皿 菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5 此法還可以將稀釋的菌液取0.2m1加到已制備好的平板上，然后用無菌涂棒將菌液涂布整個平板表面，放入適宜溫度下培養(yǎng)，計算菌落數(shù)，再按上公式計算出每毫升原菌液的所含活菌總數(shù)。 此法可因操作不熟練造成污染

5、，或因培養(yǎng)基溫度過高損傷細(xì)胞等原因造成結(jié)果不穩(wěn)定。盡管如此，由于該方法能測出樣品中微量的菌數(shù)，仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的一種測定細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細(xì)菌、酵母、芽抱與抱子等的數(shù)量均可用此法測定。但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍(lán)細(xì)菌等的營養(yǎng)體等。 除上述兩種常用的計數(shù)方法外，還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)；比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌的懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度

6、成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(OD)表示菌量。實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。微生物計數(shù)法，發(fā)展迅速，現(xiàn)有多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法。 2重量法 此法的原理是根據(jù)每個細(xì)胞有一定的重量而設(shè)計的。它可以用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。不論是細(xì)菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內(nèi)，于105烘干

7、至恒重，取出放入干燥器內(nèi)冷卻，再稱量，求出微生物干重。 如果要測定固體培養(yǎng)基上生長的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至50，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用50的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。 除了干重、濕重反映細(xì)胞物質(zhì)重量外，還可以通過測定細(xì)胞中蛋白質(zhì)或DNA的含量反映細(xì)胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要成分，含量也比較穩(wěn)定，其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細(xì)胞，洗滌后，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16，細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量占細(xì)菌固形物的50一80，一般以65為代表，有些細(xì)菌則只占13一14，這種變化是由菌齡和培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的。因此總含氮量與蛋白

8、質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計算： 蛋白質(zhì)總量含氮量×6.25 核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì)，每個細(xì)菌的DNA含量相當(dāng)恒定，平均為8.4×10-5ng。因此從一定體積的細(xì)菌懸液中所含的細(xì)菌中提取DNA，求得DNA含量，再計算出這一定體積的細(xì)菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。 3生理指標(biāo)法 對于一些非溶液的樣品，要測定微生物數(shù)量除了用活菌計數(shù)法外，還可以用生理指標(biāo)測定法進行測定。生理指標(biāo)包括微生物的呼吸強度、耗氧量、酶活性、生物熱等。這是根據(jù)微生物在生長過程中伴隨出現(xiàn)的這些指標(biāo)，樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設(shè)備來測定

9、相應(yīng)的指標(biāo)。這類測定方法主要用于科學(xué)研究，分析微生物生理活性等。第三節(jié) 微生物的生長規(guī)律一、同步培養(yǎng)微生物個體生長是微生物群體生長的基礎(chǔ)。但群體中每個個體可能分別是處于個體生長的不同階段，因而它們的生長、生理與代謝活性等特性不一致，出現(xiàn)生長與分裂不同步的現(xiàn)象。同步培養(yǎng)(synchronous culture)是一種培養(yǎng)方法，它能使群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時進行生長或分裂的群體細(xì)胞。以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式稱為同步生長。通過同步培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞被稱為同步細(xì)胞或同步培養(yǎng)物。同步培養(yǎng)物常被用來研究在單個細(xì)胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業(yè)發(fā)酵的種

10、子，它是一種理想的材料。用一般培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞通常是不完全同步的細(xì)胞，就是同步培養(yǎng)方法獲得的同步細(xì)胞經(jīng)幾次傳代之后，也會出現(xiàn)不同步的現(xiàn)象。如何使不同步轉(zhuǎn)變?yōu)橥?，以及如何使用同步?xì)胞能較長時間地保持同步，這是同步培養(yǎng)中要研究的課題。同步培養(yǎng)方法很多，可歸納為機械法與環(huán)境條件控制兩類。1機械方法這是一類根據(jù)微生物細(xì)胞在不同生長階段的細(xì)胞體積與質(zhì)量或根據(jù)它們同某種材料結(jié)合能力不同的原理設(shè)計出來的方法。其中常用的有：(1)離心方法將不同步的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮在不被這種細(xì)菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通過密度梯度離心將不同細(xì)胞分布成不同的細(xì)胞帶，每一細(xì)胞帶的細(xì)胞大致是處于同一生長期的細(xì)胞，分別將它

11、們?nèi)〕鲞M行培養(yǎng)，就可以獲得同步細(xì)胞。(2)過濾分離法將不同步的細(xì)胞培養(yǎng)物通過孔徑大小不同微孔濾器，從而將大小不同的細(xì)胞分開，分別將濾液中的細(xì)胞取出進行培養(yǎng)，獲得同步細(xì)胞。(3)硝酸纖維素濾膜法根據(jù)細(xì)菌能緊緊結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上的特點，將細(xì)菌懸液通過墊有硝酸纖維素濾膜的過濾器，然后將濾膜顛倒過來，再將培養(yǎng)基流過濾器，以洗去末結(jié)合的細(xì)菌，然后將濾器放入適宜條件下培養(yǎng)一段時間，其后仍將培養(yǎng)基流過濾器，這時新分裂產(chǎn)生的細(xì)菌被洗下，分部收集并通過培養(yǎng)獲得同步細(xì)胞。2環(huán)境條件控制技術(shù)這類技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌生長與分裂對環(huán)境因子要求不同的原理設(shè)計的一類獲得同步細(xì)胞的方法。(1)溫度最適生長溫度有利于細(xì)菌生長與分

12、裂，不適宜溫度如低溫不利于細(xì)菌生長與分裂。通過適宜與不適宜溫度的交替處理之后，通過培養(yǎng)可獲得同步細(xì)胞。(2)培養(yǎng)基成分控制培養(yǎng)基中的碳、氮源或生長因子不足，可導(dǎo)致細(xì)菌緩慢生長直至生長停止。因此將不同步的細(xì)菌在營養(yǎng)不足的條件下培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基里培養(yǎng)，能獲得同步細(xì)胞。另外也可以將不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)接到含有一定濃度的，能抑制蛋白質(zhì)等生物大分子合成的化學(xué)物質(zhì)如抗生素等的培養(yǎng)基里，培養(yǎng)一段時間后，再轉(zhuǎn)接到完全培養(yǎng)基里培養(yǎng)也能獲得同步細(xì)胞。(3)其他對于光合細(xì)菌可以將不同步的細(xì)菌經(jīng)光照培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)到黑暗中培養(yǎng)，這樣通過光照和黑暗交替培養(yǎng)的方式可獲得同步細(xì)胞；對于不同步的芽孢桿菌培養(yǎng)至絕大

13、部分芽孢形成，然后經(jīng)加熱處理，殺死營養(yǎng)細(xì)胞，最后轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基里，經(jīng)培養(yǎng)可獲得同步細(xì)胞。環(huán)境條件控制獲得同步細(xì)胞的機理不完全了解。這種處理可能是導(dǎo)致胞內(nèi)某些物質(zhì)合成，它合成和積累可導(dǎo)致細(xì)胞分裂，從而獲得同步細(xì)胞。二、細(xì)菌群體生長規(guī)律細(xì)菌接種到均勻的液體培養(yǎng)基后，當(dāng)細(xì)菌以二分裂法繁殖，分裂后的子細(xì)胞都具有生活能力。在不補充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個培養(yǎng)液體積不變條件下，以時間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時間時細(xì)菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細(xì)菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線，這種曲線稱為生長曲線稱為生長曲線(growth curve)。一條典型的生長曲線至少可以分為遲緩期、對數(shù)

14、期、穩(wěn)定期和衰亡期等四個生長時期。1遲緩期(1ag phase) 又稱延滯期、適應(yīng)期。細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基而處于一個新的生長環(huán)境，因此在一段時間里并不馬上分裂，細(xì)菌的數(shù)量維持恒定，或增加很少。此時胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量有所增加，相對地此時的細(xì)胞體最大，說明細(xì)菌并不是處于完全靜止的狀態(tài)。產(chǎn)生遲緩期的原因，認(rèn)為是微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏足夠的能量和必需的生長因子，“種子”老化(即處于非對數(shù)生長期)或未充分活化，接種時造成的損傷等。在工業(yè)發(fā)酵和科研中遲緩期會增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響，但是遲緩期無疑也是必需的，因為細(xì)胞分裂之前，細(xì)胞各成分的復(fù)制與裝配等也需要時間，因此應(yīng)該采取一定

15、的措施：通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為“種子”； 盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；適當(dāng)擴大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良的影響。2對數(shù)生長期(log phase)又稱指數(shù)生長期(exponential Phase)。細(xì)菌經(jīng)過遲緩期進入對數(shù)生長期，并以最大的速率生長和分裂，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量呈對數(shù)增加，而且細(xì)菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，此時期內(nèi)的細(xì)菌生長是平衡生長。對數(shù)生長期細(xì)菌的代謝活性、酶活性高而穩(wěn)定，大小比較一致，生活力強，因而它廣泛地在生產(chǎn)上用作“種子”和在科研上作為理想的實驗材料。3穩(wěn)定生長期(stationary phase)由于營養(yǎng)

16、物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于細(xì)菌生長，導(dǎo)致生長速率降低直至零(即細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)量)，結(jié)束對數(shù)生長期，進入穩(wěn)定生長期。穩(wěn)定生長期的話細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。如果及時采取措施，補充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對好氧菌進行通氣、攪拌或振蕩等可以延長穩(wěn)定生長期，獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。4衰亡期(decline或death Phase)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌死亡速率逐步增加和活細(xì)菌逐步減少，標(biāo)志進入衰亡期。該時期細(xì)菌代謝活性降低，細(xì)菌衰老并出現(xiàn)自溶。該時期死亡的細(xì)菌以對數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會使細(xì)

17、菌死亡的速率降低。此外，不同的微生物，甚至同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要經(jīng)過一定的適應(yīng)期后才能獲得利用能力(例如乳糖或NO3-等)。前者通常稱為速效碳源(或氮源)，后者稱為遲效碳源(或氮源)。當(dāng)培養(yǎng)基中同時含有這兩類碳源(或氮源)時，微生物在生長過程中會產(chǎn)生二次生長現(xiàn)象。三、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(continous culture of microorganisms)是在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。根據(jù)生長曲線，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累是導(dǎo)致微生物生長停

18、止的主要原因。因此在微生物培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。 在連續(xù)培養(yǎng)里，培養(yǎng)容器中細(xì)菌的數(shù)量一方面以比生長速率的數(shù)量增加，同時又在以稀釋率的數(shù)量減少。連續(xù)培養(yǎng)有兩種類型，恒化器連續(xù)培養(yǎng)和恒濁器連續(xù)培養(yǎng)。前者是在整個培養(yǎng)過程中通過控制培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度基本恒定的方式，保持細(xì)菌的比生長速率恒定，使生長“不斷”進行。培養(yǎng)基中的某種營養(yǎng)物質(zhì)通常是作為細(xì)菌比生長速率的控制因子，這類因子一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，生長因子等物質(zhì)。恒化器連續(xù)培養(yǎng)通常用于微生物學(xué)的研究，篩選不同的變種。后者主要是通過連續(xù)培養(yǎng)

19、裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細(xì)菌生長連續(xù)進行的一種培養(yǎng)方式。菌液濃度大小通過光電系統(tǒng)調(diào)節(jié)稀釋率來維持菌數(shù)恒定，此種培養(yǎng)方式一般用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)，從而獲得更好的經(jīng)濟效益。恒濁器連續(xù)培養(yǎng)與恒化器連續(xù)培養(yǎng)的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度無限制生長因子不恒定最高速率大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速有限制生長因子恒定低于最高速率不同生長速率的菌體實驗室為主連續(xù)培養(yǎng)如用于生產(chǎn)實踐上，就稱為連續(xù)發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點：高效，它簡化了裝料，滅菌、生產(chǎn)時間和提高了設(shè)備的利用率；自控，便于

20、利用各種儀表進行自動控制；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；節(jié)約了大量動力、人力等資源。連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)發(fā)酵也有其缺點。最主要的是菌種易于退化。其次易遭雜菌污染。此外營養(yǎng)的利用率一般亦低于單批培養(yǎng)。在生產(chǎn)實踐上，連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)已廣泛用于酵母菌體的生產(chǎn)，乙醇、乳酸和丙酮-丁醇等發(fā)酵。以及用假絲酵母進行石油脫蠟或是污水處理中。第四節(jié) 環(huán)境對微生物生長的影響生長是微生物同環(huán)境相互作用的結(jié)果。在液體培養(yǎng)中生長曲線是在正常培養(yǎng)條件下，反映微生物接種后的培養(yǎng)過程中菌數(shù)變化同培養(yǎng)時間之間的關(guān)系。微生物在培養(yǎng)過程中，環(huán)境的變化會對微生物生長產(chǎn)生很大的影響。一、環(huán)境對微生物生長的影響影響微生物生長的主要因素有營養(yǎng)物質(zhì)、水的活性、溫度

21、、pH和氧等。1.營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致微生物生長所需要的能量、碳、氮源、元機鹽等成分不足，此時機體一方面降低或停止細(xì)胞物質(zhì)合成，避免能量的消耗，或者通過誘導(dǎo)合成特定的運輸系統(tǒng)，充分吸收環(huán)境中微量的營養(yǎng)物質(zhì)以維持機體的生存；另一方面機體對胞內(nèi)某些非必要成分或失效的成分進行降解以重新利用，這些非必需成分是指胞內(nèi)貯存的物質(zhì)、無意義的蛋白質(zhì)與酶、mRNA等。例如在氮、碳源缺乏時，機體內(nèi)蛋白質(zhì)降解速率比正常條件下的細(xì)胞增加了7倍，同時減少tRNA合成和降低DNA復(fù)制的速率，導(dǎo)致生長停止。2水的活性水是機體中的重要組成成分，它是一種起著溶劑和運輸介質(zhì)作用的物質(zhì)，參與機體內(nèi)水解、縮合、氧化與還原等反應(yīng)在

22、內(nèi)的整個化學(xué)反應(yīng)，并在維持蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的穩(wěn)定的天然狀態(tài)上起著重要作用。微生物在生長過程中，對培養(yǎng)基的aw有一定的要求，每種微生物生長都有最適的aw，高于或低于所要求的aw值，都會通過影響培養(yǎng)基的滲透壓力變化而影響微生物的生長速率。微生物不同，生長所需要的最適配w值也不同。3溫度根據(jù)微生物生長的最適溫度不同，可以將微生物分為嗜冷、兼性嗜冷、嗜溫、嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型。它們都有各自的最低、最適和最高生長溫度范圍。 微生物類型 生長溫度 最低 最適 最高 嗜冷微生物 0以下 15 20 兼性嗜冷微生物 0 20-30 3； 嗜溫微生物 1520 20-45 45以上 嗜熱微生物 45

23、55-65 80 超嗜熱或嗜高溫微生物 65 80-90 100以上表中列出不同微生物生長溫度的一些典型例子。溫度的變化都會對每種類型微生物的代謝過程產(chǎn)生影響，通過改變它們的生長速率。以適應(yīng)溫度的變化而生存。微生物生長溫度最低最適最高嗜冷芽孢菌-1023-2428-30大腸桿菌103745熱葉菌90106113溫度對微生物生長的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性，微生物生長過程中所發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)絕大多數(shù)是在特定酶催化下完成的，每種酶都有最適的酶促反應(yīng)溫度，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞物質(zhì)合成；影響細(xì)胞質(zhì)膜的流動性，溫度高流動性大，有利于物質(zhì)的運輸，溫度低流動性降低，不利于物質(zhì)運輸，因此

24、溫度變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌；影響物質(zhì)的溶解度，物質(zhì)只有溶于水才能被機體吸收或分泌，除氣體物質(zhì)以外，溫度上升物質(zhì)的溶解度增加，溫度降低物質(zhì)的溶解度降低，最終影響微生物的生長。4pH微生物生長過程中機體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長速率最大，因此微生物生長也有一個最適生長的pH范圍。此外微生物生長還有一個最低與最高的pH范圍，低于或高出這個范圍，微生物的生長就被抑制，微生物不同生長的最適、最低與最高的pH范圍也不同。微生物最低PH最適PH最高PH細(xì)菌3-58-10酵母菌2-37-8霉菌1-37-

25、8 pH通過影響細(xì)胞質(zhì)膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長速率。質(zhì)子是一種唯一不帶電子的陽離子，它在溶液里能迅速地與水結(jié)合成水合氫離子(H3O+等)。在偏堿性條件下，OH-占優(yōu)勢，水合氫離子和OH-對營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和離解狀態(tài)，細(xì)胞表面電荷平衡和細(xì)胞的膠體性質(zhì)等方面均會產(chǎn)生重大影響；在酸性條件下H+可以與營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，并能從可交換的結(jié)合物或細(xì)胞表面置換出某些陽離子，從而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；同時由于PH值較低，CO2溶解度降低，某些金屬離子如Mn2+、Ca2+、Mo2+等溶解度增加，導(dǎo)致它們在溶液中的濃度增加，從而對機體產(chǎn)生不利的作用。5氧根

26、據(jù)氧與微生物生長的關(guān)系可將微生物分為好氧、微好氧、耐氧型、兼性厭氧和專性厭氧五種類型，它們在液體培養(yǎng)基試管中的生長特征見圖。因此，在培養(yǎng)不同類型的微生物時，一定要采取相應(yīng)的措施保證不同類型的微生物能正常生長。例如培養(yǎng)好氧微生物可以通過振蕩或通氣等方式使之有充足的氧氣供它們生長；培養(yǎng)專性厭氧微生物則要排除環(huán)境中的氧，同時通過在培養(yǎng)基中添加還原劑的方式降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢；培養(yǎng)兼性厭氧或氧的耐氧型微生物，可以用深層靜止培養(yǎng)的方式等。微生物與氧的關(guān)系微生物類型最適生長的O2體積分?jǐn)?shù)好氧微好氧氧的忍耐型兼性厭氧專性厭氧等于或大于202一lO2以下有氧或無氧不需要氧、有氧時死亡氧對于好氧微生物生長雖

27、然可以通過好氧呼吸產(chǎn)生更多的能量，滿足機體的生長需要，但另一方面，氧對一切生物都會使其產(chǎn)生有毒害作用的代謝產(chǎn)物，如超氧基化合物與H2O2，這兩種代謝產(chǎn)物互相作用還會產(chǎn)生毒性很強的自由基OH.。自由基是一種強氧化劑，它與生物大分子互相作用，可導(dǎo)致產(chǎn)生生物分子自由基，從而對機體產(chǎn)生損傷或突變作用，直至死亡。氧之所以對專性厭氧微生物以外的其他四種類型微生物不產(chǎn)生致死作用，是因為它們具有超氧物歧化酶，可催化起氧化基化合物分解，最終分解成水。第五節(jié) 微生物生長繁殖的控制在適宜條件下，對數(shù)生長期的微生物能以最大的比生長速率進行生長繁殖，產(chǎn)生大量的新個體，例如每個E.coli細(xì)胞的重量雖然大約只有10-12

28、g，但是，如果一個E.coli在肉湯培養(yǎng)基和在適宜條件下，培養(yǎng)48h產(chǎn)生的新個體的總重量可超過地球重量的4000倍！實際上生長是微生物與環(huán)境相互作用的結(jié)果。在自然界電離輻射、太陽、溫度、濕度、營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累等環(huán)境影響下，E.coli不可能以最大比生長速率無限制地生長下去，再加上E.coli 噬菌體作用，一些E.coli也會被裂解而死亡，使細(xì)菌數(shù)量不會無限增加。另一方面微生物中有不少是動物、植物和人類的病原菌，也必須對這類病原菌進行控制。因此，如何控制微生物的生長速率或消滅不需要的微生物，在實際應(yīng)用中具有重要的意義?；靖拍睿阂种?inhibition)：抑制是在亞致死劑量因子作用下

29、導(dǎo)致微生物生長停止，但在移去這種因子后生長仍可以恢復(fù)的生物學(xué)現(xiàn)象。死亡(death)：死亡是在致死劑量因子或在亞致死劑量因子長時間作用下，導(dǎo)致微生物生長能力不可逆喪失，即使這種因子移去后生長仍不能恢復(fù)的生物學(xué)現(xiàn)象。防腐(antisepsis)：防腐是在某些化學(xué)物質(zhì)或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施，它能防止食物腐敗或防止其他物質(zhì)霉變。例如日常生活中以干燥、低溫、鹽腌或糖漬等防腐方法是保藏食品(物)的主要方式。具有防腐作用的化學(xué)物質(zhì)稱為防腐別。消毒(disinfection)：消毒是利用某種方法殺死或滅活物質(zhì)或物體中所有病原微生物的一種措施，它可以起到1肋止感染或傳播的作用：具有

30、消毒作用的化學(xué)物質(zhì)稱為消毒劑(disinfectant)，一般消毒劑在常用濃度下只能殺死微生物的營養(yǎng)體，對芽孢則無殺滅作用。滅菌(sterilization)：滅菌是指利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內(nèi)的所有微生物的一種措施。滅菌后的物體不再有可存活的微生物。化療(chemotherapy)：化療是指利用具有選擇毒性的化學(xué)物質(zhì)如磺胺、抗生素等對生物體內(nèi)部被微生物感染的組織成病受細(xì)胞進行治療，以殺死組織內(nèi)的病原微生物或病變細(xì)胞，但對機體本身無毒害作用的治療措施。理化因子對微生物生長是起抑菌作用還是殺菌作用并不是很嚴(yán)格分開的。因為理化因子的強度或濃度不同作用效果也不同，例如有些化學(xué)物質(zhì)低濃度有抑菌

31、作用，高濃度則起殺菌作用，就是同一濃度作用時間長短不同，效果也不一樣；不同微生物對理化因子作用的敏感性不同，就是同一種微生物，所處的生長時期不同，對理化因子作用的敏感性也不同。一、控制微生物的物理因素控制微生物的物理因素主要有溫度，輻射作用、過濾、滲透壓、干燥和超聲波等，它們對微生物生長能起抑制作用或殺滅作用。1高溫滅菌當(dāng)溫度超過微生物生長的最高溫度或低于生長的最低溫度都會對微生物產(chǎn)生殺滅作用或抑制作用。高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌的溫度越高，微生物死亡越快。通常情況下溫度為121.3。衡量滅菌效果的指標(biāo)之一是十倍致死時間 (decimal reduction time，D)，即在一定的溫度條件

32、下，微生物數(shù)量十倍減少所需要的時間。溫度愈高，十倍致死時間愈短。另外D值大小還隨微生物的種類、生長時期、檢測培養(yǎng)基的性質(zhì)等因素有關(guān)。測量某種微生物在某個溫度下的十倍致死時間是一個很復(fù)雜的過程，因為這種方法要測定活菌的數(shù)量。另一種比較容易測定的指標(biāo)是熱致死時間(thennaldeathtime)，即在一定溫度下殺死所有某一濃度微生物所需要的時間。這樣只要在一定溫度下將待測樣品加熱處理不同時間后，分別與培養(yǎng)基混勻，然后培養(yǎng)，當(dāng)所有細(xì)菌被殺死時，被培養(yǎng)的樣品中沒有細(xì)菌生長。待測樣品中的微生物數(shù)量大(即濃度高)，殺死所有微生物所需的時間比殺死微生物濃度低的樣品所需的時間長。因此當(dāng)微生物的濃度一致時，可

33、以通過比較熱致死時間長短來衡量不同微生物的熱敏感性。干熱滅菌法對于一些玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品還可以用干熱滅菌法進行滅菌，但干熱滅菌所需時間比濕熱滅菌溫度高和時間長。例如171需要1h，160需2h，121需16h等。煮沸消毒 即將待消毒物品如注射器、金屬用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更長時間，以殺死細(xì)菌或其他微生物的營養(yǎng)體和少部分的芽孢或孢子。如果在水中適當(dāng)加1碳酸鈉或2一5的石炭酸則殺菌效果更好。間隙滅菌法對于某些培養(yǎng)基，由于高壓蒸汽滅菌會破壞某些營養(yǎng)成分，可用間隙滅菌法滅菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反復(fù)滅菌幾次，例如第一次蒸煮后殺死微生物營養(yǎng)體，冷卻，培養(yǎng)過夜，孢子萌發(fā)，又第二次

34、蒸煮，殺死營養(yǎng)體。這樣反復(fù)23次就可以完全殺死營養(yǎng)體和芽孢，也可保持某些營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞。巴氏消毒法高壓蒸汽滅菌適用于耐熱材料的滅菌（如培養(yǎng)基、溶液等。）對于牛奶及其熱敏感物質(zhì)不適宜，因為高熱破壞了食品的營養(yǎng)與風(fēng)味。現(xiàn)在，牛奶或其他液態(tài)食品一般都采用超高溫滅菌，即135150，滅菌26s，既可達殺菌和保質(zhì)，縮短了時間，又提高了經(jīng)濟效益。2輻射作用 輻射滅菌(radiation Sterilization)是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效力法。用于滅菌的電磁波有微波、紫外線(UV)、X射線和y射線等，它們都能通過特定的方式控制微生物生長或殺死它們。例如微波可以通過熱產(chǎn)

35、生殺死微生物的作用；紫外線(UV)使DNA分子中相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體，抑制DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等功能，殺死微生物；X射線和y射線能使其他物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基(OH·、H·)再作用于生物分子，或者直接作用于少物分子，打斷氫鍵、使雙鍵氧化、破壞環(huán)狀結(jié)構(gòu)或使某些分子聚合等方式，破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，以抑制或殺死微生物。3過濾作用高壓蒸汽滅菌可以除去液體培養(yǎng)基中的微生物，但對于空氣和不耐熱的液體培養(yǎng)基的滅菌是不適宜的，為此設(shè)計了一種過濾除菌的方法。過濾除菌有三種類型。一種最早使用的是在一個容器的兩層濾板中間填充棉花、玻璃纖維或石棉，滅菌后空氣通過它就可以達到除菌的目的。為了縮

36、小這種濾器的體積，后來改進為在兩層濾板之間放入多層濾紙，滅菌后使用也可以達到除菌的作用，這種除菌方式主要用于發(fā)酵工業(yè)。第二種是膜濾器，它是由醋酸纖維素或硝酸纖維素制成的比較堅韌的具有微孔(0.220.45um)的膜，滅菌后使用，液體培養(yǎng)基通過它就可將細(xì)菌除去、由于這種濾器處理量比較少，主要用于科研。第三種是核孔濾器，它是由用核輻射處理的很薄的聚碳酸膠片(厚10um)再經(jīng)化學(xué)蝕刻而制成。輻射使膠片局部破壞，化學(xué)蝕刻使被破壞的部位成孔，而孔的大小則由蝕刻溶液的強度和蝕刻的時間來控制。溶液通過這種濾器就可以將微生物除去，這種濾器也全要用于科學(xué)研究。4高滲作用細(xì)胞質(zhì)膜是一種半透膜、它將細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)與

37、環(huán)境中的溶液(培養(yǎng)基等)分開，如果溶液中水的濃度高于細(xì)胞原生質(zhì)中水的濃度，那么水就會從溶液中通過細(xì)胞質(zhì)膜進入原生質(zhì)，使原生質(zhì)和溶液中水的濃度達到平衡，這種現(xiàn)象為滲透作用，即水或其他溶劑經(jīng)過半透性膜而進行擴散的現(xiàn)象稱為滲透；在滲透時溶劑通過半透膜時受到的阻力稱為滲透壓。滲透壓的大小與溶液濃度成正比。如純水的aw值為1，溶液中的溶質(zhì)趨向于降低aw值，即溶液中含的溶質(zhì)愈多，溶液中的aw值愈低，而溶液的滲透壓愈高。細(xì)菌接種到培養(yǎng)基里以后，細(xì)胞通過滲透作用使細(xì)胞質(zhì)與培養(yǎng)基的滲透壓力達到平衡。如果培養(yǎng)基的滲透壓力高(即aw值低)，原生質(zhì)中的水向培養(yǎng)基擴散，這樣會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離使生長受到抑制。因此提高

38、環(huán)境的滲透壓即降低aw值，就可以達到控制微生物生長的目的。例如用鹽(濃度通常為10一15)腌制的魚、肉、食品就是通過加鹽使新鮮魚肉脫水，降低它們的水活性，使微生物不能在它們上面生長；新鮮水果通過加糖(濃度一般為50一70)制成果脯、蜜餞也是降低水果的aw值，抑制微生物生長與繁殖，起到防止腐敗變質(zhì)的效果。5干燥水是微生物細(xì)胞的重要成分，占生活細(xì)胞的90以上，它參與細(xì)胞內(nèi)的各種生理活動，因此說沒有水就沒有生命。降低物質(zhì)的含水量直至干燥，就可以抑制微生物生長，防止食品、衣物等物質(zhì)的腐敗與霉變。因此干燥是保存各種物質(zhì)的重要手段之一。6超聲波超聲波處理微生物懸液可達到消滅它們的目的。超聲波處理微生物懸液

39、時由于超聲波探頭的高頻率振動，引起探頭周圍水溶液的高頻率振動，當(dāng)探頭和水溶液兩者的高頻率振動不同步時能在溶液內(nèi)產(chǎn)生空當(dāng)即空穴，空穴內(nèi)處于真空狀態(tài)，只要懸液中的細(xì)菌接近或進入空穴區(qū)，由于細(xì)胞內(nèi)外壓力差，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，達到滅菌的目的，超聲波的這種作用稱為空穴作用；另一方面，由于超聲波振動，機械能轉(zhuǎn)變成熱能，導(dǎo)致溶液溫度升高，使細(xì)胞產(chǎn)生熱變性以抑制或殺死微生物。目前超聲波處理技術(shù)廣泛用于實驗室研究中的破細(xì)胞和滅菌。二、控制微生物的化學(xué)物質(zhì)1抗微生物劑抗微生物劑(antimicrobial agcnt)是一類能夠殺死微生物或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)，這類物質(zhì)可以是人工合成的，也可以是生物合成的天然產(chǎn)物

40、。根據(jù)它們抗微生物的特性可分為：抑菌劑，它們能抑制微生物生長，但不能殺死它們，作用機理是這類物質(zhì)結(jié)合到核糖體上抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致生長停止，由于它們同核糖體結(jié)合不緊，它們在濃度降低時又會游離出來，核糖體合成蛋白質(zhì)的能力恢復(fù)，使生長恢復(fù)；殺菌劑，它們能殺死細(xì)胞但不能使細(xì)胞裂解，由于它們是緊緊地結(jié)合到細(xì)胞的作用靶上，即使在濃度降低時也不能游離出來，因此生長不能恢復(fù)；溶菌劑，它們能通過誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的方式殺死細(xì)胞，將這類物質(zhì)加到生長的細(xì)胞懸液里以后會導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量成細(xì)胞懸液的混濁度降低，能抑制細(xì)胞壁合成或損傷細(xì)胞質(zhì)膜的抗生素就屬于溶菌劑?？刮⑸飫┯址Q殺菌劑，通常又將它們分為消毒劑和防腐劑，前者通常用來

41、殺死非生物材料上的微生物，后者具有殺死微失物或抑制微生物生長的能力，但對于動物或人體的組織無毒害作用。殺菌劑廣泛用于熱敏感的其他物質(zhì)或用具，如溫度計、帶有透鏡的儀路設(shè)備、聚乙烯管或?qū)Ч艿鹊臏缇?；在食品、發(fā)酵工業(yè)，自來水廠等部門常用殺菌劑殺死墻壁、樓板與儀器設(shè)備等表面和自來水中的微生物；對于空氣中的微生物則用甲醛、石炭酸(酚)、高錳酸鉀等化學(xué)試劑進行薰、蒸、噴霧等方式殺死它們。表中列出了與健康有關(guān)的一些常用的消毒劑與防腐劑及其作用的機理。常用的防腐劑和消毒劑 抗微生物劑作用范圍作用機理防腐劑：有機汞0.1%1硝酸銀碘液70%乙醇肥皂、洗液、除臭劑3過氧化氫溶液消毒劑：HgCl2CuSO4碘液氯氣乙烯氧化物、甲醛劑臭氧