第三章培養(yǎng)用液

1、 第三章第三章 培培 養(yǎng)養(yǎng) 用用 液液n 培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn) 行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶 液。液。n主要包括主要包括平衡鹽溶液平衡鹽溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)基其他培養(yǎng)用液其他培養(yǎng)用液 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第一節(jié)第一節(jié) 水和平衡鹽溶液水和平衡鹽溶液 細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。其他的雜質(zhì)。 需要用需要用新鮮新鮮( (一周內(nèi)）一周內(nèi)）的的三蒸水三蒸水或或純化水純化水 純化水的純化水的貯存貯存對保持水的質(zhì)量有很大影響：對保持水的質(zhì)量

2、有很大影響：需用需用玻璃容器玻璃容器；周圍環(huán)境和空氣能使水污染，；周圍環(huán)境和空氣能使水污染，或改變其或改變其pHpH，所以要，所以要盡量減少啟開的次數(shù)盡量減少啟開的次數(shù), ,避免避免和外界多接觸和外界多接觸, ,存放時(shí)間不宜太長存放時(shí)間不宜太長, , 最好現(xiàn)制現(xiàn)最好現(xiàn)制現(xiàn)用。用。一、細(xì)胞培養(yǎng)對水的要求一、細(xì)胞培養(yǎng)對水的要求n2 2、平衡鹽溶液、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS） 注意：注意： 配制平衡鹽溶液也應(yīng)當(dāng)用純化水。如果配方配制平衡鹽溶液也應(yīng)當(dāng)用純化水。如果配方中含有中含有Ca2+、Mg 2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。 滅菌方法：滅菌

3、方法： 過濾除菌或高溫高壓滅菌。過濾除菌或高溫高壓滅菌。 n幾種常用的平衡鹽溶液：幾種常用的平衡鹽溶液： PBS、Hanks、D-Hanks（都有相應(yīng)配方（都有相應(yīng)配方, ,主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成）主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成） nD-Hanks與與Hanks的一個(gè)主要區(qū)別在于前者不的一個(gè)主要區(qū)別在于前者不含有含有Ca2+、Mg2+ n因此因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。常用于配制胰酶溶液。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 一、成分成分1.1.氨基酸：氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨

4、酸和纈氨酸苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸（均為型）。（均為型）。 2.2.碳水化合物：碳水化合物：葡萄糖葡萄糖3.3.維生素：維生素：葉酸、煙酰胺、吡哆醛、核黃素、硫胺素等。葉酸、煙酰胺、吡哆醛、核黃素、硫胺素等。 4.4.無機(jī)離子與微量元素：無機(jī)離子與微量元素： 鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素以及鐵、鋅、硒、鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素以及鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等微量元素。銅、錳、鉬、釩等微量元素。 n3 3、無血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基 不需要添加血清就可維持細(xì)胞在體外較長時(shí)不需要添加血清就可維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。二、

5、培養(yǎng)基的分類：二、培養(yǎng)基的分類：三、如何選擇培養(yǎng)基？三、如何選擇培養(yǎng)基？n(1)(1)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這 種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。 n(2)(2)本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基 n(3)(3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng) 基基 n(4)(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀 態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判 斷，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基斷，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基 四、培養(yǎng)基的

6、配制：四、培養(yǎng)基的配制： （1 1）認(rèn)真閱讀說明書。）認(rèn)真閱讀說明書。 （2 2）配制時(shí)要保證充分溶解，）配制時(shí)要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨、谷氨 酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才 能添加。能添加。（3 3）配制所用的水應(yīng)為純化水（三蒸水），離）配制所用的水應(yīng)為純化水（三蒸水），離 子濃度很低，水電阻達(dá)子濃度很低，水電阻達(dá)3030萬萬以上。以上。（4 4）所用器皿應(yīng)十分潔凈。）所用器皿應(yīng)十分潔凈。（5 5）配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于）配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于 44。DMEM培養(yǎng)液的配制（舉例）培養(yǎng)液的配制（舉例）n900 mL

7、900 mL 純化水于純化水于1000 mL1000 mL燒杯中，將燒杯中，將DMEMDMEM粉粉1 1包倒入其中，盛粉袋用包倒入其中，盛粉袋用50 mL50 mL純化水分次沖洗，純化水分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。n用用5 51010的的NaHCONaHCO3 3調(diào)調(diào)pHpH至至7.27.2n加青、鏈霉素至終濃度加青、鏈霉素至終濃度100u/mL 100u/mL 和和100ug/mL100ug/mLn用容量瓶定容到用容量瓶定容到1000 mL1000 mL n用用0.22um0.22um的濾膜過濾除菌。的濾膜過濾除菌。n分裝（分裝（200

8、mL200 mL左右）后左右）后44冰箱保存。冰箱保存。 五、血清：五、血清：n細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活, ,基礎(chǔ)培基礎(chǔ)培養(yǎng)基中常常要添加血清，添加血清后的培養(yǎng)養(yǎng)基中常常要添加血清，添加血清后的培養(yǎng)基被稱為基被稱為“完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基”。n血清終濃度多為血清終濃度多為5 5 20%20%。最常用的是。最常用的是10%10%。 n廣泛應(yīng)用的血清種類有廣泛應(yīng)用的血清種類有馬血清與牛血清馬血清與牛血清，后后者又分為者又分為胎牛血清、新生牛血清與小牛血清。胎牛血清、新生牛血清與小牛血清。n胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生牛血清胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生牛

9、血清取自出生取自出生2424小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生自出生10103030天的小牛。天的小牛。 1 1、血清的主要作用、血清的主要作用(1)(1)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)提供基本營養(yǎng)物質(zhì) (2)(2)提供貼壁和擴(kuò)展因子提供貼壁和擴(kuò)展因子 (3)(3)提供激素及各種生長因子提供激素及各種生長因子 (4)(4)提供結(jié)合蛋白提供結(jié)合蛋白 (5)(5)對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用 2 2、細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)、細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)(1)(1)有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài) (2)(2)血清中含有

10、一些物質(zhì)對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性作用血清中含有一些物質(zhì)對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性作用 (3)(3)每批血清之間都有差別每批血清之間都有差別, ,其成分不能保持一致。其成分不能保持一致。(4)(4)取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng) 的細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響的細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響(5)(5)直接影響某些實(shí)驗(yàn)，如生長因子的檢測直接影響某些實(shí)驗(yàn)，如生長因子的檢測n3、血清質(zhì)量的判斷：、血清質(zhì)量的判斷： 對于使用者來說，血清質(zhì)量首先從外觀入手。好的血清應(yīng)該對于使用者來說，血清質(zhì)量首先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少量沉淀，比較是透明清亮，土黃色或棕黃色，無

11、沉淀或極少量沉淀，比較粘稠。粘稠。n4 4、血清的使用與儲存、血清的使用與儲存 (2)(2)使用前的處理：血清在使用前通常在使用前的處理：血清在使用前通常在5656加熱加熱3030分鐘，這一過程稱為分鐘，這一過程稱為滅活滅活。 n大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如裝為小包裝，如10ml10ml、20ml20ml、50ml50ml，儲存于，儲存于 -20-20，使用前融化。，使用前融化。n融化后的血清在融化后的血清在44不宜長時(shí)間存放，不宜長時(shí)間存放，勿超過勿超過一個(gè)月，一個(gè)月，應(yīng)盡快使用。應(yīng)盡快使用。 （4）血清中的沉淀物）血清中的沉

12、淀物n絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。可用離心量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用分鐘去除，也可不用處理處理n顯微鏡下顯微鏡下“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象觀察象“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長，但如果懷情況下，此小黑點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清

13、質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清的血清舉例清亮清亮小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)六、其他培養(yǎng)用液六、其他培養(yǎng)用液 n、消化液、消化液取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁的細(xì)胞從瓶壁上消化下來，懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁的細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有：常用的消化液有： （1 1）胰蛋白酶）胰蛋白酶(trypsin(trypsin) )溶液：溶液： 濃度一般為濃度一般為0.10.10.250.25 配制時(shí)要用配制時(shí)要用不含不含Ca2+、Mg

14、2+及血清及血清的平衡鹽溶液的平衡鹽溶液 （2 2）EDTA溶液溶液： 使用濃度為使用濃度為0.02%0.02%；對于一些貼壁特別牢的細(xì)胞，對于一些貼壁特別牢的細(xì)胞，可可與胰酶的混合使用與胰酶的混合使用 （3 3）膠原酶）膠原酶( (collagenase) )溶液：溶液： 使用濃度為使用濃度為0.10.10.3mg0.3mgL L或或2020萬萬U UL L， 作用的最佳作用的最佳pHpH為為6.56.5。 膠原酶不受膠原酶不受CaCa2+2+、MgMg2+2+及血清的抑制，配制及血清的抑制，配制時(shí)可用時(shí)可用PBS。 膠原酶作用溫和，不易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。在膠原酶作用溫和，不易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

15、在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用。上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用。 缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴 、谷氨酰胺補(bǔ)充液、谷氨酰胺補(bǔ)充液合成培養(yǎng)基中必需成分，但容易降解，所以合成培養(yǎng)基中必需成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L0.002mol/L。一般配。一般配制為制為100100倍濃縮液，配制時(shí)應(yīng)加溫至倍濃縮液，配制時(shí)應(yīng)加溫至3030，完全，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于-20-20。3 3、pHpH調(diào)整液調(diào)整液 常用的有常用的有 HEPES液液 NaHCO3 n一種弱酸，中文名

16、字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，對細(xì)胞無毒性，是一種氫離子緩沖劑，是一種氫離子緩沖劑，能較長能較長時(shí)間控制恒定的時(shí)間控制恒定的 pH 范圍。范圍。n使用終濃度為使用終濃度為 10-50mmol/L 10-50mmol/L n主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動。在開放式迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO5%CO2 2的環(huán)境，的環(huán)境，COCO2 2氣體迅速逸出，氣體迅速逸出，pHpH迅速升高，若迅速升高，若加了加了HEPESHEPES，此時(shí)可以維持，此時(shí)可以維持pH7.0pH7.0左右。一般左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPESHEPES使用時(shí)可向使用時(shí)可向100ml100ml培養(yǎng)液中加入培養(yǎng)液中加入2ml 2ml 濃縮液，終濃度為濃縮液，終濃度為20mmol/L20mmol/L 、抗生素液、抗生素液n青、鏈霉素的配制及使用濃度青、鏈霉素的配制及使用濃度n青霉素青霉素8080萬萬U U加加HanksHanks液至液至80 mL80 mL，濃度，濃度1 1萬萬u/ u/ mL