蛋白質(zhì)分離技術(shù)(全).

1、第十第十第十第十第十第十節(jié)節(jié)節(jié)節(jié)節(jié)節(jié)一、一、 引言引言二、二、 蛋白質(zhì)（酶）分蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理離純化的前處理三、蛋白質(zhì)（酶）分離三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化與純化四、層析技術(shù)四、層析技術(shù)五、電泳技術(shù)五、電泳技術(shù)六、離心技術(shù)六、離心技術(shù)一、一、一、一、一、一、 引言引言引言引言引言引言 蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔負著生物催化、物質(zhì)功能的執(zhí)行者，擔負著生物催化、物質(zhì)運輸、運動、防御、調(diào)控及記憶、識別運輸、運動、防御、調(diào)控及記憶、識別等多種生理功能。等多種生理功能。

2、（一）分離純化的意義（一）分離純化的意義（一）分離純化的意義（一）分離純化的意義（一）分離純化的意義（一）分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。質(zhì)有重大意義。工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。麥芽糖、糊精以及糖漿等。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿

3、病。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。基因工程的需要基因工程的需要（二）分離純化的要求（二）分離純化的要求（二）分離純化的要求（二）分離純化的要求（二）分離純化的要求（二）分離純化的要求1 1、純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如作、純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如作為研究一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系為研究一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應用的酶和蛋白質(zhì)劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即可，不要求均一

4、。制劑，達到一定純度即可，不要求均一。2 2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性?；钚浴? 3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。（三）分離純化的一般程序（三）分離純化的一般程序（三）分離純化的一般程序（三）分離純化的一般程序（三）分離純化的一般程序（三）分離純化的一般程序 生物大分子的分離純化一般可分為生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段：以下幾個階段： 材料的選擇和預處理材料的選擇和預處

5、理 破碎細胞及提?。ㄓ袝r還需要進破碎細胞及提?。ㄓ袝r還需要進行細胞器的分離）行細胞器的分離） 分離純化：包括粗分級分離和細分離純化：包括粗分級分離和細分級分離分級分離 其中前兩個階段為生物大分子分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。純化的前處理。選擇材料選擇材料破碎細胞破碎細胞提取提取分離純化分離純化分析及鑒定分析及鑒定二、二、二、二、二、二、 蛋白質(zhì)（酶）蛋白質(zhì)（酶）蛋白質(zhì)（酶）蛋白質(zhì)（酶）蛋白質(zhì)（酶）蛋白質(zhì)（酶） 分離純化的前處理分離純化的前處理分離純化的前處理分離純化的前處理分離純化的前處理分離純化的前處理（一）材料的選擇與預處理（一）材料的選擇與預處理 選擇材料主要根據(jù)實驗目

6、的而定。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含選擇材料主要根據(jù)實驗目的而定。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無需考慮上述問題，物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的即可。只要能達到實驗目的即可。 實驗材料選定后，常常需要進行預處理，如動物材料需要實驗材料選定后，常常需要進行預處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需除去一些與實驗無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡要除殼；微生物需要將菌

7、體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進行實驗可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進行實驗或加工，應冷凍保存?；蚣庸ぃ瑧鋬霰４?。（二）細胞的破碎（二）細胞的破碎（二）細胞的破碎（二）細胞的破碎（二）細胞的破碎（二）細胞的破碎 分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆絹淼奶烊粻顟B(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。但若材料是體液（如血）或生法將組織和細

8、胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的破物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的破碎。碎。 組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。 1. 機械法：機械法： 1) 研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。中，加入少量石英砂研磨或勻漿。 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通?？上扔眉矣檬称?/p>

9、加工機將組織打碎，方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C將組織打碎，然后再用然后再用10000r/min20000r/min的內(nèi)刀式組的內(nèi)刀式組織搗碎機織搗碎機(即高速分散器即高速分散器)將組織的細胞打碎。將組織的細胞打碎。2.物理法：物理法： 1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至反復凍融法：將待破碎的細胞冷至15到到20，然后，然后放于室溫放于室溫(或或40)迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。 2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和超聲波處理

10、法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎?？淄蝗会尫胖脸?，細胞將徹底破碎。 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在法。在90左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷

11、卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。3. 化學與生物化學方法：化學與生物化學方法： 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏睾瓦m當?shù)臏囟认?，細胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯度下，細胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，稀鹽溶液中，由于

12、存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于酶和酯酶等，于37，pH8，處理處理15分鐘，可以專一性地將分鐘，可以專一性地將細胞壁分解。細胞壁分解。 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。膜溶解，從而使細胞破裂

13、，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。（三）細胞器的分離（三）細胞器的分離（三）細胞器的分離（三）細胞器的分離（三）細胞器的分離（三）細胞器的分離 細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細胞細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細胞還有葉綠體。還有葉綠體。 如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的干擾或污染，還需防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質(zhì)。先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質(zhì)。 細胞器的分離一般采用差速離心

14、法，即將破碎后的細胞在細胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細胞在適當?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸適當?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。分步離心后，即可獲得所需組分。（四）提取（四）提?。ㄋ模┨崛。ㄋ模┨崛。ㄋ模┨崛。ㄋ模┨崛?組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細胞內(nèi)組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即將

15、其置于一定條件含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。物的分解破壞，這就是提取。1. 1. 1. 影響提取的因素影響提取的因素影響提取的因素影響提取的因素影響提取的因素影響提取的因素 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大小；目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??； 由固相擴散到液相的難易；由固相擴散到液相的難易； 溶劑的溶劑的pHpH值和提取時間等。值和提取時間等。通常：通常： 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于

16、非極性溶劑；極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大；溫度升高，溶解度加大； 遠離等電點的遠離等電點的pHpH值，溶解度增加。值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持提取時所選擇的條件應有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。其生物活性。2. 2. 2. 水溶液提取水溶液提取水溶液提取水溶液提取水溶液提取水溶液提取蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。用水溶液提取生物大分子應注蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。用水溶液提取生物大分子應注

17、意的幾個主要影響因素是：意的幾個主要影響因素是： 1) 鹽濃度（即離子強度）：鹽濃度（即離子強度）：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶

18、質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性?？梢栽黾尤芤旱臉O性。 2) pH值：值：蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有值有關(guān)。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在關(guān)。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的范圍內(nèi)，提取溶劑

19、的pH應在蛋白質(zhì)和酶應在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。 3) 溫度：溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時一般在白質(zhì)和酶，提取時一般在05的低溫操作。的低溫操作。 4) 防止蛋白酶的降解作用：防止蛋白酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶的酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降解作用。降解作用。 5) 攪拌與氧化：攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的

20、溶解，攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。因為一般蛋白質(zhì)都含有相當物質(zhì)的變性失活。因為一般蛋白質(zhì)都含有相當數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的接觸過多都會使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基

21、乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。少量巰基乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。3. 3. 3. 有機溶劑提取有機溶劑提取有機溶劑提取有機溶劑提取有機溶劑提取有機溶劑提取 一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。用不同比例的有機溶劑提取。 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。和親脂性

22、。 有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐模⒂孟〉挠袡C溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。 例如，胰島素例如，胰島素。 4. 4. 4. 膜蛋白的提取膜蛋白的提取膜蛋白的提取膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細胞膜膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細胞膜非常重要的生物學功能。非常重要的生物學功能。 根據(jù)膜蛋白分離的難

23、易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。兩大類型：外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。(1) 外周膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表外周膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。(2) 內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(deterg

24、ent)使膜溶解后才可分離出來。使膜溶解后才可分離出來。 膜蛋白膜蛋白 即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基本方法就是用基本方法就是用不同的離心速度不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用等，最后用去污劑去污劑把蛋白從膜中釋放出來。把蛋白從膜中釋放出來。 膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當?shù)脑鋈苣さ鞍追蛛x純化的重要步驟是選擇適當?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，用表面活性劑，一般常用的有膽酸鹽，Triton-100，Tween-80, SDS等表面活性劑。等表面活性劑。 分離膜蛋白的方法（原則性）分離膜蛋白的方法（原則性）分離膜蛋白的方法（原則性

25、） 1） 先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、先分離膜，然后提?。蝗邕x用冷熱交替法、反復凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶反復凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃度離法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。心得到含有膜蛋白的粗組分。 2 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來。中溶解下來。三、分離與純化三、分離與純化三、分離與純化三、分離與純化三、分離與純化三、分離與純化 從細胞中提取得到的生物大分子往

26、往是不純從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步分離純化，凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。步進行。 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。解度，電荷等建立起來的。常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)溶解度溶解度鹽析、等電點沉淀、鹽析、

27、等電點沉淀、有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀分子大小分子大小透析、超過濾透析、超過濾密度梯度離心、凝密度梯度離心、凝膠過濾膠過濾帶電特性帶電特性電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析吸附特性吸附特性吸附層析吸附層析對配體分子對配體分子的親和性的親和性依據(jù)性質(zhì)依據(jù)性質(zhì)方方 法法用于粗分用于粗分用于細分用于細分親和層析、金屬親和層析、金屬螯合層析螯合層析分配層析分配層析（一）粗分級分離（一）粗分級分離（一）粗分級分離（一）粗分級分離（一）粗分級分離（一）粗分級分離 主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜沉淀等方法，使目的蛋白與其它較

28、大量的雜蛋白分開。蛋白分開。 優(yōu)點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，優(yōu)點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)。又能濃縮蛋白質(zhì)。 缺點：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。缺點：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。1. 1. 1. 1. 1. 1. 鹽析（鹽析（鹽析（鹽析（鹽析（鹽析（中性鹽沉淀中性鹽沉淀中性鹽沉淀中性鹽沉淀中性鹽沉淀中性鹽沉淀） 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為程稱為“鹽析鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。 鹽析法應用最廣的還

29、是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八鹽析法應用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是：十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是： 成本低，不需要特別昂貴的設備。成本低，不需要特別昂貴的設備。 操作簡單、安全。操作簡單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。 鹽析的基本原理鹽析的基本原理鹽析的基本原理鹽析的基本原理鹽析的基本原理鹽析的基本原理 蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素：水蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。化膜和電荷。 中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。 加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水加入

30、大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，化膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子即聚集而形成沉破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子即聚集而形成沉淀。淀。溶解度溶解度鹽濃度鹽濃度Salting-outSalting-inSalting-inSalting-in脫水脫水脫水脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質(zhì)帶負電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）陰離子陰離子陽離子陽離子堿堿酸酸酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀蛋白質(zhì)聚集沉淀蛋白質(zhì)聚集沉淀蛋白質(zhì)聚集沉淀蛋白質(zhì)聚集沉淀蛋白質(zhì)聚集沉淀堿堿水化膜水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）水化膜水化膜 中性鹽的選擇

31、中性鹽的選擇中性鹽的選擇中性鹽的選擇中性鹽的選擇中性鹽的選擇 常用的中性鹽中最重要的是常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點：為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點： 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（鹽析操作也要求在低溫下（04）進行。）進行。由下表可以看到，由下表可以看到， 硫銨在硫銨在0時的溶解度，時的溶解度，遠遠高于其它鹽類：

32、遠遠高于其它鹽類：幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100/100/100毫升水）毫升水）毫升水）毫升水）毫升水）毫升水） 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫銨在硫銨在0時的溶解度，遠遠高于其它鹽類時的溶解度，遠遠高于其它鹽類 2) 分離效果好：分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨有的提取液加入適量

33、硫酸銨鹽析，一步就可以除去鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度的雜蛋白，純度提高了四倍。提高了四倍。 3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。作用。有的酶或蛋白質(zhì)用有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度濃度的的(NH4)2SO4保存可達數(shù)年之久。保存可達數(shù)年之久。 4) 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。價格便宜，廢液不污染環(huán)境。（3 3 3 3 3 3）分段鹽析）分段鹽析）分段鹽析）分段鹽析）分段鹽析）分段鹽析 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽類、數(shù)目以

34、及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液中析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。的鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出飽和度：在給定條件下以可能達到的最大濃度的百飽和度：在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽濃度。分數(shù)表示的鹽濃度。（4 4 4）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍

35、低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.53.0，相當于，相當于25 mg/mL30mg/mL。2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。質(zhì)的等電點附近。3) 溫度的影響：對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強溫度的影響：對于蛋白質(zhì)、酶和多肽

36、等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。一般情或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力喪失。下操作，以避免活力喪失。 2. 2. 2.有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法基本原理基本原理 有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)有機溶劑

37、對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： 降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。的相互作用力，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時，從蛋由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時，從蛋白質(zhì)分子周圍的水

38、化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。因而發(fā)生沉淀作用。（2 2 2）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點 分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。淀。 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生

39、化制備中有廣泛的應用。有廣泛的應用。 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。起變性失活，操作需在低溫下進行。（3 3 3）有機溶劑的選擇和濃度的計算）有機溶劑的選擇和濃度的計算）有機溶劑的選擇和濃度的計算）有機溶劑的選擇和濃度的計算）有機溶劑的選擇和濃度的計算）有機溶劑的選擇和濃度的計算 用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。和丙酮。 為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶為了獲得沉淀而不著重

40、于進行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。（4 4 4）有機溶劑沉淀的影響因素）有機溶劑沉淀的影響因素）有機溶劑沉淀的影響因素）有機溶劑沉淀的影響因素）有機溶劑沉淀的影響因素）有機溶劑沉淀的影響因素 1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應，因此必須預且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應，因此必須

41、預冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。 一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有大的有機溶劑進行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大。大。 通常使用通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。的蛋白質(zhì)初濃度為宜。 3)

42、pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常值范圍內(nèi)，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。力。 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過通常鹽濃度以不超過5為宜，使用乙醇的量也以為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的倍體積為宜，少量的不超過原蛋白質(zhì)水溶液的倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是

43、在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉淀，減少其中下一步的分離，則應盡可能抽干沉淀，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。3. 3. 3.等電點沉淀法等電點沉淀法等電點沉淀法等電點沉淀法等電點沉淀法等電點沉淀法 利用具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達到電中性利用具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)

44、分離的方法。時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進行初步的沉淀分離。利用此法進行初步的沉淀分離。 由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴び捎谠S多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完的蛋白質(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，此全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。配合使用

45、，以提高沉淀能力和分離效果。pH和離子強度對和離子強度對-乳球蛋白溶解度的影響乳球蛋白溶解度的影響4. 4. 4. 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。性沉淀而得到分離提純。 熱變性熱變性 利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉

46、淀而保留目的物在溶液中。的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。 表面活性劑和有機溶劑變性表面活性劑和有機溶劑變性 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉淀。使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進行。通常在冰浴或冷室中進行。 選擇性酸堿變性選擇性酸堿變性 利用對利用對pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。5. 5. 5. 有機聚合物沉淀法有機聚合物沉淀法有機聚合物沉淀法有機聚合物沉淀法有機聚合物沉淀法有機聚合物沉淀法 有

47、機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應用最多的是用于核酸和酶的純化。其中應用最多的是 “聚乙二醇聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量

48、為分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的的 PEG。 本方法的優(yōu)點是：本方法的優(yōu)點是： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生即可以沉淀相當多的生物大分子。物大分子。 沉淀后有機聚合物容易去除。沉淀后有機聚合物容易去除。6. 6. 6. 透析透析透析透析透析透析 自自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術(shù)之一。在生室最簡便最常用的分離純

49、化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。要用到透析的技術(shù)。 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。 保留在透析袋內(nèi)未保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液透析出的樣品溶液稱為稱為“保留液保留液”，袋（膜）外的溶液袋（膜）外的溶液稱為稱為“滲出液滲出液”或或“透析液透析液”。截留。截留分子量分子量MwCO通常通常為為1萬左右。萬左右。 用用1 BaCl2檢查檢查(NH4)2SO4，用用1 AgNO3 檢查檢查NaCl、KCl

50、等。等。7. 7. 7. 超濾超濾超濾超濾超濾超濾 超過濾即超濾，自超過濾即超濾，自20年代問世后，直至年代問世后，直至60年代以年代以來發(fā)展迅速，很快由實驗室規(guī)模的分離手段發(fā)展來發(fā)展迅速，很快由實驗室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。 超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術(shù)，廣泛用超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。 超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的

51、壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。加壓的蛋加壓的蛋白質(zhì)溶液白質(zhì)溶液濃縮的蛋濃縮的蛋白質(zhì)溶液白質(zhì)溶液含小分子含小分子的溶液的溶液 超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。微孔過濾、超濾和反滲透三種。 微孔過濾所用的操作壓通常小于微孔過濾所用的操作壓通常小于4104Pa，膜膜的平均孔徑為的平均孔徑為5

52、00埃埃14微米（微米（1微米微米104埃），埃），用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。 超濾所用操作壓為超濾所用操作壓為4104Pa7105Pa，膜的平膜的平均孔徑為均孔徑為10100埃埃，用于分離大分子溶質(zhì)。，用于分離大分子溶質(zhì)。 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35105Pa140105Pa，膜的平均孔徑最小，一膜的平均孔徑最小，一般為般為10埃埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。鹽，制高純水等。（二）精分級分離（二）精分級分離（二）精分級分離（二）精分級分離（二

53、）精分級分離（二）精分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的率的柱層析及電泳柱層析及電泳方法。方法。 常用的柱層析方法有常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析析、疏水吸附層析、親和層析和和金屬螯合層析金屬螯合層析等。等。 常用的電泳方法有常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳聚焦電泳等。等。 另外，另外，結(jié)晶結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的

54、結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。第十第十第十第十第十第十節(jié)節(jié)節(jié)節(jié)節(jié)節(jié)一、一、 引言引言二、二、 蛋白質(zhì)（酶）分蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理離純化的前處理三、蛋白質(zhì)（酶）分離三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化與純化四、層析技術(shù)四、層析技術(shù)五、電泳技術(shù)五、電泳技術(shù)六、離心技術(shù)六、離心技術(shù)四、層析技術(shù)四、層析技術(shù)四、層析技術(shù)四、層析技術(shù)四、層析技術(shù)四、層析技術(shù) 層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是19061906年俄國植物學家年俄國植物學家Michael Michael TswettTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的

55、色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法色譜法”（Chromatography) Chromatography) 。 后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。 19441944年出現(xiàn)紙層析。年出現(xiàn)紙層析。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。（一）層析的分類（一）層析的分類（一）層析的分類（一）層析的分

56、類（一）層析的分類（一）層析的分類按層析的分離機理分類按層析的分離機理分類排阻層析排阻層析(exclusion chromatography)離子交換層析離子交換層析(ion exchange chromatography)吸附層析吸附層析( (absorption chromatography)absorption chromatography)分配層析分配層析( (partition chromatography)partition chromatography)親和層析親和層析(affinity chromatography)金屬螯合層析金屬螯合層析(metal chelating ch

57、romatography)疏水層析疏水層析(hydrophobic chromatography)反向?qū)游龇聪驅(qū)游?reverse phase chromatography)聚焦層析聚焦層析(focusing chromatography)灌注層析灌注層析(perfusion chromatography)（二）排阻層析（二）排阻層析（二）排阻層析（二）排阻層析（二）排阻層析（二）排阻層析 （凝膠層析）（凝膠層析）（凝膠層析）（凝膠層析）（凝膠層析）（凝膠層析）凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異進行層凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異進行層析分離的方法，均稱之為排阻層析。析分離的方法，均稱

58、之為排阻層析。用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學、分子生物學和生物制藥目前已成為生物化學、分子生物學和生物制藥的研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。的研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。 1 1 1、凝膠層析的特點及應用、凝膠層析的特點及應用、凝膠層析的特點及應用、凝膠層析的特點及應用、凝膠層析的特點及應用、凝膠層析的特點及應用 特點：設備簡單、操作方便、樣品回收特點：設備簡單、操

59、作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、特別是不改變樣率高、實驗重復性好、特別是不改變樣品生物學活性等優(yōu)點。品生物學活性等優(yōu)點。 用途：蛋白質(zhì)用途：蛋白質(zhì)(包括酶包括酶)、核酸、多糖等生、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應用于蛋白物分子的分離純化，同時還應用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。2 2 2、凝膠層析的原理、凝膠層析的原理、凝膠層析的原理、凝膠層析的原理、凝膠層析的原理、凝膠層析的原理凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很

60、多孔穴。概念（概念（排阻層析，分子篩層析）：當生物大分子通過裝有凝排阻層析，分子篩層析）：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術(shù)。技術(shù)。原理：原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)孔小的分子能不同程度的