放線菌新種分類鑒定PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1放線菌新種分類鑒定放線菌新種分類鑒定2011/12/2821、實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?本實驗通過對分離得到的放線菌新種從形態(tài)學(xué)本實驗通過對分離得到的放線菌新種從形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征、和分子遺傳分類學(xué)方面進(jìn)行、生理生化反應(yīng)特征、和分子遺傳分類學(xué)方面進(jìn)行鑒定，證明其是以前從未發(fā)現(xiàn)的新種。鑒定，證明其是以前從未發(fā)現(xiàn)的新種。第1頁/共34頁2011/12/2832、實驗方法實驗方法2.1 分離方法分離方法2.3 鑒定方法鑒定方法2.2 16SrRNA基因序列測定基因序列測定第2頁/共34頁2011/12/2842.1 分離方法分離方法近年來出現(xiàn)了胞外多糖膠與動孢溶液相結(jié)合的分離方法、再水化近年來

2、出現(xiàn)了胞外多糖膠與動孢溶液相結(jié)合的分離方法、再水化-離心離心 法、極高頻輻射法、噬菌體定向分離法和蔗糖梯度離心法等用法、極高頻輻射法、噬菌體定向分離法和蔗糖梯度離心法等用于稀有放線菌選擇性分離的方法。于稀有放線菌選擇性分離的方法。第3頁/共34頁2011/12/2852.2 16SrRNA基因序列測定基因序列測定放線菌基因組的提取放線菌基因組的提取16SrRNA16SrRNA基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增膠回收膠回收連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化測序研究測序研究第4頁/共34頁2011/12/286A電鏡觀察電鏡觀察B培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征C生理生化特征生理生化特征2.3.1 表觀特征表觀特征第5頁/共34頁2011/12/2

3、87A. 電鏡電鏡取菌體后取菌體后,3%戊二醛固定磷酸緩沖液漂洗。戊二醛固定磷酸緩沖液漂洗。酒精梯度脫水，在酒精梯度脫水，在30%、50、70、80%、100依次脫依次脫水，其中水，其中100酒精酒精2次，每次次，每次10min。 乙酸異戊脂置換，乙酸異戊脂置換，50%一次，一次，100%兩次。兩次。Eiko公司公司XD-1型二氧化碳臨界點干燥器干燥，型二氧化碳臨界點干燥器干燥，Eiko公司公司IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜。型離子鍍金儀噴金鍍膜。 JEOL公司公司JSM-840掃描電鏡觀察。掃描電鏡觀察。第6頁/共34頁2011/12/288B. 培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征參照國際鏈霉菌規(guī)劃中有關(guān)放線菌

4、的培養(yǎng)特征描述參照國際鏈霉菌規(guī)劃中有關(guān)放線菌的培養(yǎng)特征描述所采用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)特征測定。所采用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)特征測定。所用培養(yǎng)基有所用培養(yǎng)基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏瓊脂、察氏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營養(yǎng)瓊脂，平板接種，平板接種，28培養(yǎng)培養(yǎng)7，14，21，28d后分別觀察并記錄基內(nèi)菌絲、氣生菌絲后分別觀察并記錄基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的生長情況及可溶性色素。的生長情況及可溶性色素。第7頁/共34頁2011/12/289C. 生理生化實驗生理生化實驗生理生化特性的測定主要包括生理生化特性的測定主要包括:pH、鹽濃度和溫度耐受性，、鹽濃度和溫度

5、耐受性，明膠液化，淀粉水解，脲酶明膠液化，淀粉水解，脲酶的產(chǎn)生，牛奶胨化和凝固，硝酸鹽還原，的產(chǎn)生，牛奶胨化和凝固，硝酸鹽還原，H2S的產(chǎn)生，的產(chǎn)生，黑色素的產(chǎn)生，唯一碳、氮源利用等試驗。黑色素的產(chǎn)生，唯一碳、氮源利用等試驗。第8頁/共34頁2011/12/2810a. pH、鹽濃度和溫度耐受性、鹽濃度和溫度耐受性upH耐受實驗?zāi)褪軐嶒炘诟呤弦惶柵囵B(yǎng)基中分別加入在高氏一號培養(yǎng)基中分別加入pH緩沖液，空白培養(yǎng)基作陰性對照，緩沖液，空白培養(yǎng)基作陰性對照，28培養(yǎng)，每周觀察一次，四周結(jié)束，重復(fù)培養(yǎng)，每周觀察一次，四周結(jié)束，重復(fù)2次。次。u溫度耐受實驗溫度耐受實驗將菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上，分別在將

6、菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上，分別在4、10 、16 、20 、28、37、45培養(yǎng)，每周觀察一次，四周結(jié)束，重復(fù)培養(yǎng)，每周觀察一次，四周結(jié)束，重復(fù)2次。次。u鹽耐受實驗鹽耐受實驗高氏一號培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的高氏一號培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)28培養(yǎng)，每周觀察一次，四周結(jié)束，重復(fù)培養(yǎng)，每周觀察一次，四周結(jié)束，重復(fù)2次。次。第9頁/共34頁2011/12/2811b. 明膠液化明膠液化 取明膠培養(yǎng)基試管作穿刺接種，另有兩支不接種作空白取明膠培養(yǎng)基試管作穿刺接種，另有兩支不接種作空白對照。于對照。于28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)培養(yǎng)2

7、、7、10、14和和30天的試管，放入天的試管，放入4C冰箱或置冰箱或置于冷水中于冷水中30min，然后進(jìn)行觀察。，然后進(jìn)行觀察。 如明膠凝塊部分或全部變?yōu)榭闪魍ǖ娜缑髂z凝塊部分或全部變?yōu)榭闪魍ǖ囊后w液體，則明膠水解，則明膠水解陽性陽性。 如明膠凝塊呈如明膠凝塊呈固體固體，則明膠水解，則明膠水解陰性陰性。 若菌體未生長，可能是不能在明膠培養(yǎng)基上生長。若菌體未生長，可能是不能在明膠培養(yǎng)基上生長。第10頁/共34頁2011/12/2812c. 淀粉水解淀粉水解將菌株點種在淀粉瓊脂平板上，待菌落生長良好時將菌株點種在淀粉瓊脂平板上，待菌落生長良好時，在菌落周圍滴加碘液檢測淀粉水解酶活性的強(qiáng)弱。，在菌

8、落周圍滴加碘液檢測淀粉水解酶活性的強(qiáng)弱。滴加碘液后培養(yǎng)皿背景呈藍(lán)黑色滴加碘液后培養(yǎng)皿背景呈藍(lán)黑色,菌落四周若不變色菌落四周若不變色，或移開菌落后滴加新碘液，菌落下得培養(yǎng)基仍，或移開菌落后滴加新碘液，菌落下得培養(yǎng)基仍不變不變色色，表示淀粉水解，表示淀粉水解陰性陰性；若變成；若變成透明無色透明無色則為則為陽性陽性，說明產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉。說明產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉。第11頁/共34頁2011/12/2813d. 脲酶的產(chǎn)生脲酶的產(chǎn)生e. 牛奶凝固與胨化牛奶凝固與胨化將待測菌種接種在脫脂牛奶管中，觀察牛奶凝固與胨化現(xiàn)象。將待測菌種接種在脫脂牛奶管中，觀察牛奶凝固與胨化現(xiàn)象。若牛奶有凝塊則為凝固，繼續(xù)培養(yǎng)

9、，凝固后有液體出現(xiàn)，進(jìn)一步水解若牛奶有凝塊則為凝固，繼續(xù)培養(yǎng)，凝固后有液體出現(xiàn)，進(jìn)一步水解成液體，則為胨化，一般先凝固后胨化。成液體，則為胨化，一般先凝固后胨化。有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存為堿性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為。為。挑取挑取1824h待試菌培養(yǎng)物大量穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，待試菌培養(yǎng)物大量穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部

10、，培養(yǎng)培養(yǎng)14d觀察結(jié)果，如為陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)一下，作最終判定，變?yōu)橛^察結(jié)果，如為陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)一下，作最終判定，變?yōu)榉鄯奂t色為陽性紅色為陽性。第12頁/共34頁2011/12/2814將待測菌種接在硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置室溫下培養(yǎng)，將待測菌種接在硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置室溫下培養(yǎng)，1、3、5d取樣測定。每株菌作復(fù)本，另兩管作對照。取樣測定。每株菌作復(fù)本，另兩管作對照。培養(yǎng)液中加入格里氏試劑培養(yǎng)液中加入格里氏試劑A、B液各一滴，如呈現(xiàn)液各一滴，如呈現(xiàn)粉紅色粉紅色、玫瑰紅色、玫瑰紅色，表明硝酸鹽還原，表明硝酸鹽還原陽性陽性，如無紅色出現(xiàn)，則加，如無紅色出現(xiàn)，則加1，2滴二苯胺試劑，如呈滴二苯胺試劑，

11、如呈藍(lán)色藍(lán)色，表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在，硝酸鹽還原屬存在，硝酸鹽還原屬陰性陰性，若，若不呈藍(lán)色不呈藍(lán)色，表示硝酸鹽和亞，表示硝酸鹽和亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)，仍按硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)，仍按陽性陽性結(jié)果處理。結(jié)果處理。f. 硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗第13頁/共34頁2011/12/2815g. H2S的產(chǎn)生的產(chǎn)生某些細(xì)菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而產(chǎn)生硫化氫某些細(xì)菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而產(chǎn)生硫化氫氣體，若于培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵銨或醋酸銨，則與硫化氫作用氣體，若于培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵銨或醋酸銨，則與硫化氫作用生成生成硫化亞鐵或硫化鉛（黑色）

12、沉淀硫化亞鐵或硫化鉛（黑色）沉淀。h. 黑色素的產(chǎn)生黑色素的產(chǎn)生將供試菌株接種在酪氨酸培養(yǎng)基斜面管上，培養(yǎng)將供試菌株接種在酪氨酸培養(yǎng)基斜面管上，培養(yǎng) 7 d 和和 14 d 觀察結(jié)果，培養(yǎng)基被染成觀察結(jié)果，培養(yǎng)基被染成褐色或者黑色褐色或者黑色即說明該菌產(chǎn)生黑色素。即說明該菌產(chǎn)生黑色素。第14頁/共34頁2011/12/2816i. 碳源利用和氮源利用（本實驗利用碳源利用和氮源利用（本實驗利用BIOLOG板）板）碳源：碳源：D-葡萄糖，蔗糖，葡萄糖，蔗糖，L-樹膠醛糖，樹膠醛糖，D-果糖，果糖，D-木糖，鼠李糖，木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纖維素。甘露醇，纖維素。不

13、加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對照。不加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陰性對照。氮源氮源: KNO3，NaNO2，尿素，尿素， (NH4)2SO4，絲氨酸，煙酰胺，酪氨，絲氨酸，煙酰胺，酪氨酸，酸， DL-天冬氨酸，天冬氨酸，L-甲硫氨酸，甲硫氨酸，DL-丙氨酸，丙氨酸，L-精氨酸，精氨酸，L(+)-谷氨谷氨酸，甘氨酸，酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。苯丙氨酸，腺嘌呤。不同氮源按不同氮源按0.5%的濃度加入，培的濃度加入，培15天后，將各種氮源上的生長狀況天后，將各種氮源上的生長狀況與不加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長狀況作比較。與不加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長狀況作比較。第15頁/共34頁2011/12/281

14、7A細(xì)胞壁化學(xué)組分細(xì)胞壁化學(xué)組分B磷酸類脂測定磷酸類脂測定C甲基萘醌測定甲基萘醌測定D脂肪酸測定脂肪酸測定2.3.2 化學(xué)分類化學(xué)分類第16頁/共34頁2011/12/2818A.細(xì)胞壁化學(xué)組分細(xì)胞壁化學(xué)組分放線菌的細(xì)胞壁主要成分為肽聚糖，根據(jù)肽聚糖放線菌的細(xì)胞壁主要成分為肽聚糖，根據(jù)肽聚糖分子中肽鏈第分子中肽鏈第3位氨基酸的種類，種間肽橋和鄰近位氨基酸的種類，種間肽橋和鄰近的四肽交聯(lián)的位置來決定放線菌細(xì)胞壁型的劃分。的四肽交聯(lián)的位置來決定放線菌細(xì)胞壁型的劃分。Lechevalier等（等（1976）根據(jù)放線菌細(xì)胞壁的化學(xué)）根據(jù)放線菌細(xì)胞壁的化學(xué)組分和全細(xì)胞水解液糖型，將放線菌歸為組分和全細(xì)胞

15、水解液糖型，將放線菌歸為9個主要個主要類群和類群和4個糖型。個糖型。第17頁/共34頁2011/12/2819胞壁類型主要組成代表屬IL,L-DAP，甘氨酸，甘氨酸SterptomycesIIMeso-DAP，甘氨酸，甘氨酸MicromonosporaIIIMeso-DAPActinomaduraIVMeso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖，阿拉伯糖，半乳糖NocardiaV賴氨酸，鳥氨酸賴氨酸，鳥氨酸ActinomycesVI賴氨酸（天冬氨酸，半乳糖）賴氨酸（天冬氨酸，半乳糖）OerskoviaVIIDAB，甘氨酸，甘氨酸AgromycesVIII鳥氨酸鳥氨酸BifidobacteriumIXMe

16、so-DAP， 多種氨基酸多種氨基酸Mycoplana放線菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成（放線菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成（Lechevalier，1976）第18頁/共34頁2011/12/2820糖類型主要成分代表屬、種A阿拉伯糖，半乳糖阿拉伯糖，半乳糖NocardiaB馬杜拉糖馬杜拉糖ActinomaduraC無特征性糖無特征性糖StreptomycesD木糖，阿拉伯糖木糖，阿拉伯糖MicromonosporaE半乳糖半乳糖Kutzneria viridogriseum放線菌全細(xì)胞的主要糖類型（放線菌全細(xì)胞的主要糖類型（Lechevalier，1976）第19頁/共34頁2011/12/2821全細(xì)胞全細(xì)胞T

17、LC分分析實驗流程：析實驗流程：第20頁/共34頁2011/12/2822磷酸類脂位于放線菌細(xì)胞膜上，屬于極性脂。不同屬菌的磷酸類脂磷酸類脂位于放線菌細(xì)胞膜上，屬于極性脂。不同屬菌的磷酸類脂組份是不同的，它是鑒別屬的重要特征之一，是化學(xué)分類項目中不可組份是不同的，它是鑒別屬的重要特征之一，是化學(xué)分類項目中不可缺少的分類指征。磷酸類脂的種類繁多，但用于分類的指征并不多。缺少的分類指征。磷酸類脂的種類繁多，但用于分類的指征并不多。用于分類指征的磷酸類脂只有五種：用于分類指征的磷酸類脂只有五種：磷脂酰乙醇胺（磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）磷脂酰甲基乙醇胺（磷

18、脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）磷脂酰膽堿（磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline, PC）磷脂酰甘油（磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG）含葡萄糖胺的未知結(jié)構(gòu)磷酸類脂（含葡萄糖胺的未知結(jié)構(gòu)磷酸類脂（phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu）B. 磷酸類脂測定磷酸類脂測定第21頁/共34頁2011/12/2823稱取稱取1g濕菌體于帶螺口的濕菌體于帶螺口的40 ml離心管中。離心管中。加入加入15ml甲醇。甲

19、醇。100水浴水浴10 min，自然冷卻。，自然冷卻。 加入加入10 ml氯仿和氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力搖勻用力搖勻10 min，靜止可看到分層。，靜止可看到分層。 8000 rpm，離心，離心10 min。到入分液漏斗靜止分層，取下層。到入分液漏斗靜止分層，取下層。30-40旋轉(zhuǎn)蒸干。旋轉(zhuǎn)蒸干。分兩次各加入分兩次各加入200l氯仿氯仿/甲醇（甲醇（2:1）沖洗器壁。）沖洗器壁。 液體移入液體移入EP管（約管（約100-200l）,8000 rpm，離心，離心10 min，去沉淀。，去沉淀。4保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?細(xì)胞磷脂的提取細(xì)胞磷脂的提取第22頁/共34頁2011/12/2

20、824實驗流程：實驗流程：第23頁/共34頁2011/12/2825C. 甲基萘醌測定甲基萘醌測定大多數(shù)細(xì)菌含有甲基萘醌或泛醌，或兩者均有。包大多數(shù)細(xì)菌含有甲基萘醌或泛醌，或兩者均有。包括放線菌在內(nèi)的革蘭氏陽性細(xì)菌只含甲基萘醌。括放線菌在內(nèi)的革蘭氏陽性細(xì)菌只含甲基萘醌。放線菌及有冠軍的甲基萘醌異戊烯側(cè)鏈長度和氫飽放線菌及有冠軍的甲基萘醌異戊烯側(cè)鏈長度和氫飽和度變化相當(dāng)大，多為部分飽和，含有和度變化相當(dāng)大，多為部分飽和，含有7-12個異戊烯個異戊烯單位。單位。放線菌目中不同菌屬的甲基萘醌類型如下表所示。放線菌目中不同菌屬的甲基萘醌類型如下表所示。第24頁/共34頁2011/12/2826放線菌目

21、中甲基萘醌類型放線菌目中甲基萘醌類型類型類型萘醌種類萘醌種類Eubacteria（異戊烯單位無氫化）（異戊烯單位無氫化）IaMK-7Bmk-9Mycobacterium（主要是（主要是8或或9個異戊烯個異戊烯單位上被單位上被2或或4個氫化）個氫化）IIaMK-8(H2)bMK-8(H4)cMK-9(H2)dMK-9(H4)Saccharomonospora（4氫化的多烯萘醌）氫化的多烯萘醌）IIIaMK-8(H4), MK-9(H4)bMK-9(H4),MK-10(H4)Streptomyces（具有同一鏈長，但氫（具有同一鏈長，但氫飽和度不同的萘醌）飽和度不同的萘醌）IVaMK-9(H2),

22、 MK-9(H4),MK-9(H6)bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8)cMK-10(H4),MK-9(H6)第25頁/共34頁2011/12/2827菌體的收集制備菌體的收集制備待測菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收集菌體，用蒸餾待測菌株用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收集菌體，用蒸餾水洗滌兩次，菌體于水洗滌兩次，菌體于-80冷凍冷凍3d，冷凍干燥機(jī)抽干菌，冷凍干燥機(jī)抽干菌體，凍干菌體體，凍干菌體4干燥器保存?zhèn)溆?。干燥器保存?zhèn)溆?。醌的提取及純化醌的提取及純化?6頁/共34頁2011/12/2828D. 脂肪酸測定脂肪酸測定放線菌細(xì)胞中脂肪酸的鏈長、雙鍵位置和數(shù)量及取代基團(tuán)具放線菌細(xì)胞中

23、脂肪酸的鏈長、雙鍵位置和數(shù)量及取代基團(tuán)具有分類學(xué)意義，是一項重要的分類特征。有分類學(xué)意義，是一項重要的分類特征。脂肪酸組份一般較為復(fù)雜，分別歸屬脂肪酸組份一般較為復(fù)雜，分別歸屬3種類型：種類型： 直鏈飽和與不飽和、分枝和復(fù)雜形式的脂肪酸。直鏈飽和與不飽和、分枝和復(fù)雜形式的脂肪酸。脂肪酸分析應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)化的條件下進(jìn)行，因為不同組分的相對脂肪酸分析應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)化的條件下進(jìn)行，因為不同組分的相對含量因菌齡和培養(yǎng)條件的不同而異。含量因菌齡和培養(yǎng)條件的不同而異。脂肪酸定性分析結(jié)果限于屬和屬以上的分類；脂肪酸定量分脂肪酸定性分析結(jié)果限于屬和屬以上的分類；脂肪酸定量分析可為種和亞種分類提供有用的基本資料。析可為種和

24、亞種分類提供有用的基本資料。第27頁/共34頁2011/12/2829 基因型分類基因型分類AG+C%含量分析含量分析BDNA-DNA分子雜交分子雜交C16srRNA基因序列分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建基因序列分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建第28頁/共34頁2011/12/2830A. G+C%含量分析含量分析DNA 堿基組成比例（堿基組成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之）是十分典型的基因指征之一，一般認(rèn)為一，一般認(rèn)為 G+C mol%在種內(nèi)相差不會超過在種內(nèi)相差不會超過 3%，在屬內(nèi)不，在屬內(nèi)不會超過會超過 10%。大量分析結(jié)果表明：放線菌屬于高大量分析結(jié)果表明：放線菌屬于高 GC 含量的微生物，并

25、且含量的微生物，并且 G+C%變化范圍小，最多不會超過變化范圍小，最多不會超過 30%。由于。由于 G+C%在不同物在不同物種中均是比較恒定的，因此可作為諸多分類指征中不可或缺的種中均是比較恒定的，因此可作為諸多分類指征中不可或缺的一個，常常作為屬的分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一。一個，常常作為屬的分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一。第29頁/共34頁2011/12/2831HPLC實驗：實驗：實驗條件：實驗條件：1.0ml/min 37C柱子：柱子：C18反相柱反相柱溶劑：溶劑：12%甲醇甲醇 20mM磷酸三乙胺（）磷酸三乙胺（） 20mM磷酸三乙胺（）配制：磷酸三乙胺（）配制：三乙胺（三乙胺（99%）用水稀釋，用）用水稀

26、釋，用85%磷酸調(diào)磷酸調(diào)pH至，即磷酸三乙胺至，即磷酸三乙胺磷酸三乙胺（）與磷酸三乙胺（）與750ml glass-distilled water混合，再加入混合，再加入120mlHPLC-grade甲醇，再加入水至總體積為甲醇，再加入水至總體積為1L。不用柱子時，流速減至不用柱子時，流速減至當(dāng)儀器超過當(dāng)儀器超過3天不使用時，柱子先用水清洗，再用天不使用時，柱子先用水清洗，再用70%甲醇清洗。甲醇清洗。第30頁/共34頁2011/12/2832B. DNA-DNA分子雜交分子雜交DNA-DNA分子雜交可以在基因組水平上研究微生物間的分子雜交可以在基因組水平上研究微生物間的區(qū)別與聯(lián)系，用于種水平的分類學(xué)研究和新種的確立。區(qū)別與聯(lián)系，用于種水平的分類學(xué)研究和新種的確立。1987 年，國際