細(xì)胞工程知識點(diǎn)及重點(diǎn)難點(diǎn)總結(jié)(共18頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第一章 緒論1、細(xì)胞工程的概念，廣義的細(xì)胞工程，狹義的細(xì)胞工程，n 細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，通過類似于工程學(xué)的步驟，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。 n 廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。2、細(xì)胞工程的研究內(nèi)容（研究生物類型，實(shí)驗(yàn)操作對象）n 根據(jù)研究生物類型不同，細(xì)胞工程可分為動物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程、微生物細(xì)胞工程。n 動物細(xì)胞工程包括：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)）；細(xì)胞融合

2、技術(shù)；胚胎工程技術(shù) （核移植、胚胎分割等）；克隆技術(shù)（單細(xì)胞系克隆、器官克隆、個體克隆）。n 植物細(xì)胞工程包括：植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù)；亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。3、細(xì)胞工程的重要應(yīng)用（植物、動物）n 植物細(xì)胞工程的應(yīng)用：脫毒和快速繁殖細(xì)胞工程育種：利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良 突變體利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，克服其雜交不親和性利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性倍性育種離體種質(zhì)保存細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)n 動物細(xì)胞工程的應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品（單克隆抗體）新品種培育試管動物與嬰兒組織工程珍稀動物資源的保存與保護(hù)第二章 細(xì)胞工程基礎(chǔ)1、細(xì)胞分化：個

3、體細(xì)胞發(fā)育過程中， 后代細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生差異的過程。2、發(fā)育潛能：指細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱。 3、細(xì)胞全能性：指細(xì)胞具有發(fā)育成完整個體的潛能。 4、細(xì)胞多能性：指隨著胚胎發(fā)育，有的體細(xì)胞失去全能性，具有分化出多種組織的潛能。5、去分化：又稱脫分化，指某些條件下分化細(xì)胞不穩(wěn)定，又回到未分化狀態(tài)的這一過程6、愈傷組織：脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)稱為愈傷組織。愈傷組織的種類胚性愈傷組織 （Embryonenic callus）：表面光滑、組織結(jié)構(gòu)緊湊、細(xì)胞小、再生力強(qiáng)。 胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。非胚性愈傷組織：表面

4、粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞大。 第三章 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)基本操作（教材第二章）1、什么是滅菌？是么是消毒？（P18）滅菌是指殺滅或者去除物體表面和孔隙內(nèi)的所有微生物，包括抵抗力極強(qiáng)的細(xì)菌芽胞。消毒是指殺死物體上的病原微生物，但細(xì)菌芽胞和非病原微生物可能還存活。2、常用的滅菌和消毒方法有哪些？物理法（一）紫外線直接照射、表面滅菌、可消毒空氣和培養(yǎng)用具（如塑料器皿），消毒的效力和距離有密切關(guān)系，故無菌室天花板一般不宜太高。一般石菌室內(nèi)空氣、桌椅以及培養(yǎng)用具在紫外線有效消毒距離內(nèi)，照射30分鐘，可達(dá)到滅菌效果。紫外線照射使用方便、消毒效果好；缺點(diǎn)是能產(chǎn)生臭氧，污染空氣，且對未直接照射的部分無消毒效

5、果。（二）干熱消毒主要用于消毒玻璃器四周，干熱、消毒的器皿干燥，易貯存。但干熱傳導(dǎo)慢，需加溫到160，保持90120分鐘，才能殺死芽孢，達(dá)到消毒目的。消毒后不要立即打開箱門，防止冷空氣忽然進(jìn)入影響消毒效果和損壞玻璃器皿。金屬器械和橡膠制品不能用于干熱消毒等。（三）濕熱消毒即高壓蒸氣消毒，是最有效的一種方法。布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿以及某種液體都可以用這種方法。（四）濾過消毒不能高溫高壓滅菌的液體可以用此法，如動物組織的人工合成培養(yǎng)液、小牛血清、胰蛋白酶系。須選一定規(guī)格的濾器，液體濾過速度，且保證除菌效果的關(guān)鍵。一般以肉眼可見液滴滴下為 。濾過后及時分裝。（五）煮沸消毒急需要時的常規(guī)方法，

6、金屬器械、膠塞在水中煮沸2030分鐘，趁熱倒去水分即可使用。化學(xué)法（一）消毒劑滅菌來蘇爾、新潔爾滅（1%）、7075%酒精、安替福氏、貝氯酸鈣、乳酸蒸氣、環(huán)氧乙烷。（二）抗菌素滅菌：（三） 熏蒸滅菌3、什么是平衡鹽溶液（BSS）？平衡鹽溶液（Balanced Salt Solution；BSS）又稱生理鹽水或鹽溶液。具有維持滲透壓，控制酸堿度的平衡作用，同時也能供給細(xì)胞中生存所需的能量和無機(jī)鹽離子，用作沖洗組織和細(xì)胞，配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液，也可用于短暫培養(yǎng)。成分：水，無機(jī)鹽，葡萄糖組成。4、什么是生物安全實(shí)驗(yàn)室？目前，生物安全實(shí)驗(yàn)室的種類有哪些，各有什么特點(diǎn)。5、動物細(xì)胞培養(yǎng)的天然培養(yǎng)基

7、有哪些？天然培養(yǎng)基1血漿最常用的是雞血漿，它具有一定的營養(yǎng)，與少量雞胚浸出液混合后，有良好的凝固作用，利于支持細(xì)胞的生長。缺點(diǎn)易液化，一般常用作各種細(xì)胞生長的基質(zhì)。2鼠尾膠原對維持細(xì)胞生長有良好作用。由于雞血漿存在一定缺點(diǎn)，人們曾試用了很多化藥品，其中鼠尾膠原較好。它能促進(jìn)組織和細(xì)胞的附著，改善生長表面藥性。來源：燃尾鍵，豚鼠真皮，牛的真皮和牛眼的水晶體，實(shí)驗(yàn)室常用大鼠尾制膠原。3胚胎浸出液主要成分是大分子核蛋白和小分子氨基酸，有刺激細(xì)胞生長的作用。在動物、細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用最早，但由它而作了變到使用合成培養(yǎng)液，并漸漸被合成培養(yǎng)液所代替，但在研究中仍有應(yīng)用價值。常用的有雞胚和牛胚。4血清是動物用量

8、最大的天然培養(yǎng)基。血清含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括大分子的蛋白質(zhì)和核酸。動物細(xì)胞的生長和增殖需要血清。實(shí)驗(yàn)證明血清對細(xì)胞附著和保護(hù)尚有明顯作用，且能中和有毒物質(zhì)的毒性，使細(xì)胞不受傷害。血清種類很多，其中有小牛血清、胎牛血清、馬血清、人胚胎血清等，胎牛血清比較理想，但不易得到。目前各實(shí)驗(yàn)室多采用小牛血清。目前已有出售小牛商品血清。人血清一般都采用AB型血清，但價格昂貴，很少用。5血清代用品血清的來源比較困難，而且成分復(fù)雜，人們努力尋找其替代品，其中有聚乙烯、吡咯咆酮（P、V、P）、蛋白胨、水解乳蛋白等，但都不如血清，因而沒廣泛使用。第四章 植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)（教材第四、七、八章）1、離體無性繁殖(

9、propagation in vitro) ：利用離體培養(yǎng)技術(shù)，將來自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，在短期內(nèi)獲得大量遺傳形狀一致的個體的方法。也稱之為微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation）。2、繁殖系數(shù)（breeding coefficient）：也叫增殖率，指每塊外植體在一個培養(yǎng)周期內(nèi)增殖的倍數(shù).3、簡述離體無性繁殖的程序 。（1）無菌培養(yǎng)物制備，包括：外植體的選擇外植體滅菌接種培養(yǎng)等基本過程。（2）培養(yǎng)物的增殖腋芽增殖：培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖不定芽增殖：繁殖系數(shù)高，非

10、洲紫羅蘭用常規(guī)葉插法，每片葉只能產(chǎn)生幾個或十幾個芽，但在組培條件下可一次形成幾十至幾百個芽，一年可以培養(yǎng)成千上萬個小植株。遺傳穩(wěn)定性較好。但繼代次數(shù)有限。培養(yǎng)物繼代一定次數(shù)以后，不定芽形成能力即減弱，需要重新建立起始無菌培養(yǎng)物。此外，不定芽需要進(jìn)行生根培養(yǎng)才能形成真正的植株。 誘導(dǎo)不定芽一般需要同時加入外源生長素和細(xì)胞分裂素，二者的配比一般是細(xì)胞分裂素要略高于生長素，其二者的總體使用濃度應(yīng)盡可能的低，以免產(chǎn)生過多的愈傷組織。以保證繁殖品種的遺傳穩(wěn)定性。胚狀體增殖： 增長率高，雙極性免去生根環(huán)節(jié)，但胚狀體休眠的誘導(dǎo)和解除還難以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工種子)，這一途徑還沒有

11、用于快繁技術(shù)。愈傷組織增殖 ：所有的植物通過組織培養(yǎng)的方法均可以誘導(dǎo)愈傷組織，再進(jìn)一步分化即可獲得小植株。這一途徑經(jīng)歷了組織培養(yǎng)技術(shù)的所有過程(愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織增殖芽分化生根完整植株)，它屬于真正意義上的組織培養(yǎng)。一切通過其它增殖方式不能成功的植物，均可以通過此途徑獲得組培苗。其特點(diǎn)是成功率高，繁殖系數(shù)大，但遺傳穩(wěn)定性較差。對品種要求遺傳穩(wěn)定性高的作物一般不采用這一途徑快繁原球莖增殖 ：細(xì)胞或組織培養(yǎng)經(jīng)原球莖途徑分化成植株。大部分蘭花屬于這一類型，即蘭花的各個部分的離體組織都能誘導(dǎo)形成原球莖，再經(jīng)培養(yǎng)分化形成植株。原球莖是蘭花種子萌發(fā)時產(chǎn)生的呈珠粒狀、縮短的、類似嫩莖的器官。 （3）生根培

12、養(yǎng)：一種是在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。當(dāng)試管苗長到23厘米高時，將它從基部切下，轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上生根（生根培養(yǎng)基一般要求降低礦物營養(yǎng)的濃度，提高生長素的濃度，具體應(yīng)根據(jù)植物不同而定） 另一種是浸泡的方法，將切下的無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中，生長素濃度為100毫克/升左右，浸泡時間從幾小時到1天，然后取出接種于不加任何激素的MS培養(yǎng)基上或者扦插在人工基質(zhì)上，十天左右即可生根。（4）煉苗和移栽：將瓶蓋打開，打破無菌環(huán)境，濕度逐漸下降，光照逐漸加強(qiáng)，使之形成新的功能強(qiáng)的根和葉片。一般煉苗時間為23d。移栽時應(yīng)注意的問題 ：a、防止菌類滋生 ；b、保持小苗水分供給平衡（5）再生植株的鑒定4、簡

13、述當(dāng)前脫除植物病毒的方法及原理。莖尖培養(yǎng)脫毒法；熱處理脫毒法；微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法；珠心組織培養(yǎng)法；愈傷組織脫毒莖尖脫毒：依據(jù)：病毒在植物體內(nèi)分布是不均一的，越接近生長點(diǎn)約（0.1-1mm區(qū)域），病毒濃度越稀，因此有可能采用小的莖尖離體培養(yǎng)而脫除植物病毒。熱處理脫毒法：熱處理不能殺死病毒。只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，而失去浸染能力。熱處理是一種物理效應(yīng)，可以加速植物細(xì)胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法：同莖尖脫毒。珠心組織培養(yǎng)法：一般認(rèn)為病毒是通過維管組織傳播的，珠心組織與維管系統(tǒng)沒有直接聯(lián)系，因此珠心組織培養(yǎng)可獲得無病毒植株。愈

14、傷組織脫毒：病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官不同組織中分布不均勻，由那些無病毒細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷組織就是獲得無病毒苗的基礎(chǔ)。5、簡述脫毒效果如何檢測A 指示植物鑒定(indicator test plants) 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專化性癥狀的寄主植物。每種病毒都有自己敏感的植物，指示植物鑒定病毒的方法：a.摩擦接種法：通過汁液傳播的病毒，b、嫁接法：通過專門的介體傳播的病毒，B 血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。C 電鏡檢查法 采用電子顯微鏡，可直接觀察樣品材料有無病毒存在，還可以進(jìn)一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結(jié)

15、構(gòu)，這些特征相當(dāng)穩(wěn)定，因此電鏡檢查法即準(zhǔn)確又有效，但需要有一定的設(shè)備和技術(shù)。D 分子檢測法 例如RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation）將待測的樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達(dá)6、脫毒苗的保存與繁殖。n 脫毒苗的離體保存與繁殖:一般是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，一般每月繼代一次，可以在培養(yǎng)基中加入生長延緩劑，如B9和矮壯劑可2-3個月繼代一次，也可放到液氮或4冰箱中保存 。 n 建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系：如果試管苗生產(chǎn)成本

16、過高或移栽困難，可將試管苗選擇種植在一定的控制區(qū)域，從繁殖技術(shù)和環(huán)境隔離上保證較高水平，使得繁殖的種苗能有效的防止病毒的再侵染。 7、什么是花藥培養(yǎng)？什么是花粉培養(yǎng)？8、花藥培養(yǎng)的基本程序是： 外植體選擇外植體(花蕾)預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)-移栽 9、花藥培養(yǎng)中如何選擇外植體？n 基因型的選擇 通過花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。同一植物的不同類型、不同品種對花藥培養(yǎng)的反應(yīng)也是不同的。因此在進(jìn)行花藥和花粉培養(yǎng)時，應(yīng)選擇那些容易培養(yǎng)成功的材料來做。 n 供試材料的生理狀態(tài) 在多年生植物中，幼年植株比老齡植株的花藥誘導(dǎo)頻率高。

17、草本植物生長健壯、且處于生殖生長高峰期的花藥誘導(dǎo)頻率高，徒長或營養(yǎng)不足的植株花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率低。 n 花粉的發(fā)育時期 ：最適期：單核花粉 雙核花粉 涉及到具體的植物，花藥培養(yǎng)的取材時期并不絕對相同，如番茄以減數(shù)分裂期的幼嫩花藥為好，而云苔屬植物的某些材料則以花粉成熟時的花藥為好。10.花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的區(qū)別？11、影響花藥培養(yǎng)的因素有哪些？基因型發(fā)育時期植株的生理狀態(tài)預(yù)處理培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件花藥的接種密度（密度效應(yīng)）培養(yǎng)的方法與方式：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（Ficoll）、雙層培養(yǎng)、分步培養(yǎng)、條件培養(yǎng)12單倍體植株的染色體加倍方法（P155）方法：用的多的為化學(xué)誘變法，常用的誘變劑有秋水仙素、富

18、民農(nóng)、對二氯苯、8-羥基喹啉等，其中加倍效果最好的為秋水仙素。秋水仙素：地中海一帶生長的一種百合科植物秋水仙，秋水仙素是由秋水仙的種子和球莖提取出來的物質(zhì)，分子式為C22H25NO8。秋水仙素的特性：能溶于水、酒精、三氯甲烷，可以阻止細(xì)胞有絲分裂時紡錘絲的形成。a小苗浸泡法：將再生小植株從試管中取出，在無菌條件下用秋水仙素直接浸泡，然后再至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。煙草：濃度0.2%0.4%，時間2448hr，加倍率35%大麥：濃度0.01%0.05%，時間15d，加倍率40%60%b生長錐處理：將適宜濃度的秋水仙素，調(diào)和在栽體羊毛脂中，然后將羊毛脂涂抹在單倍體植物的頂端分生組織和次生分生組織上，誘導(dǎo)

19、分生組織細(xì)胞染色體加倍；也可將秋水仙素配成水溶液，用蘸滿溶液的棉球置于頂芽和腋芽上誘導(dǎo)生分組織細(xì)胞染色體加倍。兩種方法均需加蓋塑料布以防止蒸發(fā)。煙草：濃度0.2%0.4%（羊毛脂），時間2448hr，加倍率25%茄子：濃度0.2%0.4%（水溶液），時間4042hr，每隔4hr滴加一滴水，加倍率為87.5%c培養(yǎng)基加倍：將單倍體植株的任何一部分做為外植體，使其在附加一定濃度的秋水仙素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成株，在植株再生過程中加倍。第五章 人工種子（教材第三章）什么是人工種子狹義的概念是指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體（包括體細(xì)胞胚和性細(xì)胞胚），包裹在含有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的物質(zhì)中，并在適宜條件下能夠發(fā)芽

20、出苗的顆粒體。 廣義 而言，人工種子是在胚狀體或一塊組織（頂芽、腋芽）、一個器官（小鱗莖等）之外加上必要的營養(yǎng)成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而無毒的材料將其包裹起來，形成的與天然種子相似的顆粒體 人工種子的結(jié)構(gòu)人工種子分類根據(jù)Redenbaugh對人工種子的分類方法，可將人工種子分為三大類： n 裸露的或休眠的繁殖體 如微鱗莖，微塊莖等。它們在不加包被的情況下也具有較高的成株率。 n 人工種皮包被的繁殖體 一些體細(xì)胞胚、原球莖等不能過度干燥，但只需要用人工種皮包被即可維持良好的發(fā)芽狀態(tài)，如胡蘿卜體細(xì)胞胚。 n 水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體 大多數(shù)體細(xì)胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在

21、半液態(tài)凝膠中，再經(jīng)人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽能力。 第六章 細(xì)胞培養(yǎng)（教材第五章）1、分離植物細(xì)胞的方法有哪些？a) 由完整的植物器官分離單細(xì)胞：葉片是分離單細(xì)胞的最好材料。有機(jī)械法和酶解法。只有薄壁組織排列松散，細(xì)胞間結(jié)觸點(diǎn)很少時用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功b) 由培養(yǎng)組織分離單細(xì)胞：誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物2、植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法有哪些？c) 細(xì)胞平板培養(yǎng)d) 看護(hù)培養(yǎng)e) 微室培養(yǎng)f) 其它單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)A飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù)B雙層濾紙植板培養(yǎng)方法3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，如何計(jì)量

22、細(xì)胞的生長量？A、細(xì)胞記數(shù)B、細(xì)胞大小的測定技術(shù)（用顯微測微計(jì)）C、細(xì)胞體積：D、細(xì)胞的干重和鮮重。E、有絲分裂指數(shù)4、一個成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的特征。 n 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在3050個細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。 n 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 n 細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般23天甚至更短時間便可增加一倍。 5、影響懸浮細(xì)胞生長的因素。 n 起始愈傷組織的質(zhì)量：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒

23、狀，疏松易碎。 n 接種細(xì)胞密度：接種初期的細(xì)胞密度過低往往使延遲期加長，懸浮細(xì)胞的起始密度一般在0.52.5105個細(xì)胞/毫升，低于這一密度則會使細(xì)胞生長延遲。 n 培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期 6懸浮培養(yǎng)細(xì)胞同步化方法。n 物理方法1）分選法通過細(xì)胞體積大小分級，直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。2）冷處理法。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度n 化學(xué)方法1）饑餓法懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，若斷絕供應(yīng)一種細(xì)胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓之后，當(dāng)在培養(yǎng)基中重新加入這種限制因子時，靜止細(xì)胞就會同步進(jìn)入分裂

24、。2）抑制劑法通過一些DNA 合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞停留在DNA 合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期的細(xì)胞。常用的抑制劑有5-氟脫氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羥基尿等。3）有絲分裂阻抑用秋水仙素處理指數(shù)生長的懸浮培養(yǎng)物，濃度一般控制在0.2%，處理時間以4-6小時為宜7、懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長規(guī)律細(xì)胞生長各個時期的特點(diǎn)：滯后期（延遲期）:細(xì)胞很少分裂，其長短與接種量， 大小和繼代時原種細(xì)胞所處的生長期有關(guān)對數(shù)生長期:細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長速率保持不變直線生長期:細(xì)胞生長和發(fā)育最明顯的時期緩慢期:生長逐漸緩慢,培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少靜止期:生

25、長幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。8、植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)n 細(xì)胞系的建立和選擇 懸浮細(xì)胞系 單細(xì)胞養(yǎng)與篩選 種細(xì)胞增殖n 優(yōu)良細(xì)胞系的增殖培養(yǎng) 所選擇的優(yōu)良細(xì)胞系，進(jìn)行大規(guī)模繁殖，得到足夠的細(xì)胞是建立細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的中間環(huán)節(jié)。 n 大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立 一步法逐級放大：對于細(xì)胞生長與目的產(chǎn)物合成同步的類型，一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。 兩步法：用于目的產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長發(fā)育到一定時期進(jìn)行，細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，再將其轉(zhuǎn)入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 如果采用固相培養(yǎng)方式生產(chǎn)次生產(chǎn)

26、物，一般均需采用兩步法建立體系。 9、在植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)中如何提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量？（P102）答：明確植物細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成的關(guān)系 選擇適宜的起始材料選擇合適的培養(yǎng)基成分加入次生代謝產(chǎn)物合成的前體物質(zhì)激發(fā)子的應(yīng)用培養(yǎng)技術(shù)的選擇：固定化培養(yǎng)是植物細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)較為理想的系統(tǒng)第七章 細(xì)胞融合（教材第六、十三章）1、細(xì)胞融合又稱體細(xì)胞雜交, 是指將不同來源的原生質(zhì)體相融合并使之分化再生,形成新物種或新品種的技術(shù)。 2、誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法 有三大類：生物法（病毒法）仙臺病毒、新城雞瘟病毒、流感病毒及皰疹病毒。 原理：病毒或其組分在細(xì)胞間起粘連作用使細(xì)胞聚集成團(tuán)，致使不同細(xì)胞的膜蛋白及膜脂質(zhì)

27、分子重新排布而結(jié)合成一個整體，從而完成細(xì)胞融合過程?；瘜W(xué)法n PEG誘導(dǎo)融合法：這種方法是一項(xiàng)培養(yǎng)大批體細(xì)胞雜種植株的卓有成效的技術(shù)，也是應(yīng)用最早的化學(xué)融合方法。PEG具有強(qiáng)烈吸水性及凝集和沉淀蛋白質(zhì)作用，對植物及微生物原生質(zhì)體和動物細(xì)胞的融合均有促進(jìn)作用。當(dāng)不同種屬的細(xì)胞混合液中存在PEG時，即產(chǎn)生細(xì)胞凝集作用，在稀釋和除去PEG過程中即產(chǎn)生融合現(xiàn)象。n 高Ca2+和高pH值誘導(dǎo)n 高鈣、高pH值及PEG結(jié)合誘導(dǎo)法n 離子誘導(dǎo)融合法n 瓊脂糖融合法物理法n 電融合誘導(dǎo)法：交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠；施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳

28、物質(zhì)的交流。n 磁-電融合法n 超聲-電融合法n 電-機(jī)械融合法3、體細(xì)胞雜種的篩選方法遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞利用生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞第八章 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（教材第十二、十四克隆技術(shù)、十五章干細(xì)胞） 1、相關(guān)概念原代培養(yǎng)：亦稱初代培養(yǎng)，指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過程。原代

29、細(xì)胞：指實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右，稱為原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)：亦稱繼代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱繼代培養(yǎng)。 細(xì)胞系：指由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無限次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群組織工程：是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將人體某部分組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖、擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而達(dá)到器官修復(fù)的或再造的治療目的的一種技術(shù)干細(xì)胞：是一類具有自我復(fù)制和分化潛能的細(xì)胞。即是一群尚未完全分化的細(xì)胞，同時具有分裂增殖成與本身完全相同的細(xì)胞，或分化成為多種特定功能的體細(xì)胞兩種特性。克?。罕疽馐侵高z傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體?，F(xiàn)指

30、一種實(shí)現(xiàn)無性繁殖方式產(chǎn)生克隆群體的操作過程或手段。 2、動物細(xì)胞之間主要連接形式 1）緊密連接 2）間隙連接 3）橋粒連接 4）隔壁連接 5）中間連接3、在體外按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同，主要可分為以下幾類： 1）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞 2）上皮型細(xì)胞 3）游走型細(xì)胞 4）多行型細(xì)胞4、動物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法 1）懸滴培養(yǎng)法 2）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 3） 灌注小室培養(yǎng)法 4）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 5）培養(yǎng)板培養(yǎng)法5、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 1）懸浮培養(yǎng)技術(shù) 2）微載體培養(yǎng)技術(shù) 3）多孔載體培養(yǎng) 4）微囊化培養(yǎng)技術(shù) 5）中空纖維法 6、簡述組織工程的三要素。細(xì)胞、支架、信號A、細(xì)胞必須能不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，且必須能被調(diào)

31、控分化成特定的組織細(xì)胞。干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞；組織來源細(xì)胞：自體或異體。B、組織生長支架需求：（1）、生物親和性（2）、生物可降解性（3）、三維內(nèi)部連通孔隙（4）、具備支架強(qiáng)度。常用的有蛋白質(zhì)支架、多糖支架、磷酸鈣基生物材料、硫酸鈣基生物材料。C、生長因子表皮生長因子：是對上皮細(xì)胞增殖有很 強(qiáng)促進(jìn)作用的53個氨基酸殘基的多肽。神經(jīng)生長因子：為神經(jīng)細(xì)胞特異性分泌的營養(yǎng)蛋白。肝細(xì)胞生長因子：為728個氨基酸殘基單鏈組成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白：能誘導(dǎo)或刺激新骨的生成。7、組織工程的技術(shù)路線。（1）體外得到工程化組織、移植目前主要的方式（2）細(xì)胞與支架前體混合注射體內(nèi)，原位形成凝膠支架，提供新組織

32、形成的空間8動物器官培養(yǎng)的特征 。（1）被培養(yǎng)的器官在體外存活較長時間，并保存相對正常的功能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常的代謝甚至增殖。而器官保存無細(xì)胞增殖 （2）被培養(yǎng)物為一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分，如肝 （3）器官培養(yǎng)不能從一個變成多個，而細(xì)胞培養(yǎng)過程中有細(xì)胞量的增加 9.干細(xì)胞的特征。 n 形態(tài)和生化特征 形態(tài)：圓形或橢圓形 、體積小 、核質(zhì)比例大 生化特征：具有較高的端粒酶活性 n 增殖 （1）緩慢性 干細(xì)胞的增殖速度一般比較慢。一旦機(jī)體需要，干細(xì)胞就可以進(jìn)入分化過程。此時，其增殖速度開始逐漸加快。 （2）自穩(wěn)性 指干細(xì)胞會自我更新維持自身數(shù)目的恒定。10干細(xì)胞的種類 （1）分

33、化潛能：不同的干細(xì)胞具有不同的分化潛能。 單能干細(xì)胞 多能干細(xì)胞 全能干細(xì)胞（2）干細(xì)胞種類：從來源講，干細(xì)胞包括： 成體干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）11.如何獲得胚胎干細(xì)胞？ 來源：早期胚胎內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞（桑椹胚） （1）從早期胚胎的獲得 （2）從原始生殖細(xì)胞中獲得 （3）體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細(xì)胞 （4）體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移12.如何正確認(rèn)識動物體細(xì)胞克隆技術(shù)？陳麗靜： 一、名詞解釋1、細(xì)胞工程（cell engineering）：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，通過類似于工程學(xué)的步驟，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細(xì)胞產(chǎn)品的一

34、門綜合性科學(xué)技術(shù)。2、細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）：是指生物細(xì)胞和組織在離體條件下的生長和增殖。3、細(xì)胞融合（cell fusion）: 又稱體細(xì)胞雜交（cell hybridization）, 是指將不同來源的原生質(zhì)體相融合并使之分化再生,形成新物種或新品種的技術(shù)。4、細(xì)胞核移植(nuclear transplantation)：利用顯微操作技術(shù)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離，然后再將不同來源的核與質(zhì)重組，形成雜種細(xì)胞。5、染色體工程(chromosome engineering )：把單個的染色體或染色體組轉(zhuǎn)入或移出受體細(xì)胞，從而形成新的染色體組合和遺傳構(gòu)成。6、胚胎工程(embryonic

35、 engineering)：以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對象進(jìn)行的操作，主要包括體外受精、胚胎切割、胚胎移植等。7、干細(xì)胞（stem cell）：動物體內(nèi)具有分化潛能，并能自我更新的細(xì)胞，分為胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞。8、植物細(xì)胞工程：以植物組織細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質(zhì)的過程。9、脫分化：離體培養(yǎng)條件下，一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過程。10、再分化：脫分化后的分生細(xì)胞（愈傷組織）在特定的條件（離體培養(yǎng)）下，重新恢復(fù)細(xì)胞

36、分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進(jìn)一步發(fā)育成完整生物體。11、細(xì)胞全能性：一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力。12、外植體：植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。13、愈傷組織：脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。14、細(xì)胞分化：是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。15、離體無性繁殖(propagation in vitro) ：利用離體培養(yǎng)技術(shù)，將來自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，在短期內(nèi)獲得大量遺傳

37、形狀一致的個體的方法。16、單株無性系或單芽無性系：離體無性繁殖得到的植株群體來自一個單株或單芽，他們的遺傳組成相同，稱為單株無性系或單芽無性系 17、植物脫毒（virus elimination）：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，脫除植物細(xì)胞中浸染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。18、體細(xì)胞胚或胚狀體：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞）。19、初代培養(yǎng)：直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物20、繼代培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上,使愈傷組織分化出叢生芽、不定芽繼續(xù)增殖、胚狀體發(fā)育成完整植株21、指示植物： 22、花

38、藥培養(yǎng)(anther culture):把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上,使其發(fā)育和分化成為植株的過程.23、花粉培養(yǎng)(pollen culture):也叫小孢子培養(yǎng)(microspore culture),是從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離的狀態(tài),通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程.24、胚胎培養(yǎng)：使胚或具胚器官在離體無菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。25、胚培養(yǎng)：在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法27、污染：在組培過程中培養(yǎng)瓶內(nèi)滋生菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā)育，從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。28、褐變：接種后，其表面開始變褐，有時甚至?xí)拐麄€培養(yǎng)基變成褐色的現(xiàn)象。29、玻璃化：培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀現(xiàn)象。30、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture)：將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。31、細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時通過細(xì)胞周期的某一特定時期。32、細(xì)胞平板培養(yǎng)：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，接種在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，33、看護(hù)培養(yǎng)：用一塊愈傷組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法34、微室培養(yǎng)：人工制造一個小室，將單