色譜分析(上海交通大學(xué)課件)【PPT】課件

1、色譜分析色譜分析 教師：柴曉蘭教師：柴曉蘭2009.9.2720082008年畢業(yè)于上海交通大學(xué)（博士年畢業(yè)于上海交通大學(xué)（博士）重現(xiàn)1903年年俄羅斯植物學(xué)家俄羅斯植物學(xué)家Tsweet茨維特茨維特植物提取液植物提取液CaCO3玻璃柱玻璃柱石油醚淋洗石油醚淋洗色譜色：顏色譜：圖譜1906年茨維特論文發(fā)表創(chuàng)建19031903液相 石油醚固相 CaCO3流動(dòng)相石油醚固定相 CaCO3兩相本本質(zhì)：質(zhì)：混混合合物物分分離離遷移固定液載氣12.1 色譜法分類填充柱色譜毛細(xì)管色譜分配色譜離子色譜排阻色譜等氣相色譜液相色譜氣體液體超臨界流動(dòng)相分離效率高分離效率高檢測(cè)靈敏度高檢測(cè)靈敏度高多組分、復(fù)雜樣品的測(cè)定

2、多組分、復(fù)雜樣品的測(cè)定應(yīng)用范圍廣：生命應(yīng)用范圍廣：生命/ /藥物食品藥物食品/ /環(huán)境環(huán)境載氣系統(tǒng)載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱色譜柱檢測(cè)器檢測(cè)器氣相色譜分析流程示意圖1 載氣鋼瓶； 2 減壓閥；3 干燥管； 4 針形閥；5 流量計(jì)； 6 壓力表；7 進(jìn)樣器； 9 色譜室； 10 檢測(cè)器； 11 記錄儀控制面板 Combi Pal 三合一裝置頂空加熱裝置利用被測(cè)樣品（氣利用被測(cè)樣品（氣- -液和氣液和氣- -固）加熱平衡后，取其固）加熱平衡后，取其揮發(fā)氣體部分進(jìn)入氣相色譜儀分析。揮發(fā)氣體部分進(jìn)入氣相色譜儀分析。填充柱毛細(xì)管柱(開管柱)內(nèi)徑粗 3-5mm柱長(zhǎng) 1-3m/常用不銹鋼內(nèi)徑細(xì) 0.2-

3、0.5mm柱長(zhǎng) 20-100m/常用石英過去時(shí)現(xiàn)在時(shí)目前GC的主流主要為開管柱 open tubular column管內(nèi)壁涂漬固定液，無載體空心管主要特點(diǎn)分離能力強(qiáng)分析時(shí)間快柱容量小適用更復(fù)雜對(duì)象高載氣流速進(jìn)樣量小/分流分流比常20:1原因：柱容量小原因：柱容量小毛細(xì)管柱進(jìn)樣量必須極?。ㄒ话阋簶?0-210-3微升，氣樣約1微升）何時(shí)不用分流？熱導(dǎo)檢測(cè)器氫火焰離子檢測(cè)器電子捕獲檢測(cè)器火焰光度檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器TCD thermal conductivity detectorFPD flame photometric detectorFID hydrogen flame ionization d

4、etectorMSD mass spectrum detectorECD electron capture detector熱敏電阻熱敏電阻不同氣體的熱擴(kuò)散作用改變電阻不同氣體的熱擴(kuò)散作用改變電阻“萬能萬能”檢測(cè)器，但是靈敏度低檢測(cè)器，但是靈敏度低 常用于填充柱和濃度較大時(shí)常用于填充柱和濃度較大時(shí)熱敏電阻絲R參熱敏電阻絲R測(cè)載氣+組份參比池測(cè)量池純載氣構(gòu)造（1）含碳物質(zhì)氫火焰中離子化）含碳物質(zhì)氫火焰中離子化（2）外電場(chǎng)作用形成電流）外電場(chǎng)作用形成電流, 與與待測(cè)物質(zhì)量正比待測(cè)物質(zhì)量正比（1）檢測(cè)含碳有機(jī)化合物更通用）檢測(cè)含碳有機(jī)化合物更通用 確定每個(gè)色譜峰代表何種物質(zhì)確定每個(gè)色譜峰代表何種物質(zhì)

5、利用氣相色譜的檢測(cè)信號(hào)峰高或峰面積，進(jìn)行定量和半定量分析利用氣相色譜的檢測(cè)信號(hào)峰高或峰面積，進(jìn)行定量和半定量分析純標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照純標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照文獻(xiàn)值對(duì)照文獻(xiàn)值對(duì)照儀器聯(lián)用定性儀器聯(lián)用定性保留值標(biāo)樣加入雙柱定性相對(duì)保留值保留指數(shù)GC-MSGC-NIR身高法找人！流行中！色譜自身定性保留值定量校正因子絕對(duì)校正因子相對(duì)校正因子原因原因: :不同檢測(cè)器對(duì)不同組分的靈敏度不同iiimfAsiifff測(cè)量f 常用標(biāo)準(zhǔn)物:苯(TCD), 正庚烷（FID)自身測(cè)得,受條件影響相對(duì)某種標(biāo)準(zhǔn)物/便于比較iiiAfm 121%100100()iiinjijimfAimmmfA 特點(diǎn)及要求： 簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確 進(jìn)樣量/操作條件對(duì)

6、結(jié)果影響不大(同時(shí)) 試樣中所有組分必須全出峰內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：試樣中無試樣中無與被測(cè)組分性質(zhì)相似與被測(cè)組分性質(zhì)相似不與待測(cè)組分反應(yīng)不與待測(cè)組分反應(yīng)峰鄰近又較好分離峰鄰近又較好分離目的目的: :為為消除消除進(jìn)樣量、操作進(jìn)樣量、操作條件條件對(duì)色譜定量的對(duì)色譜定量的影響影響方法方法: :定量定量地將地將內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)物質(zhì)加入試樣加入試樣中并混勻中并混勻常用定量方法方法: 已知濃度標(biāo)準(zhǔn)系列作工作曲線要求:進(jìn)樣量和分離操作條件必須相同 y = 0.3617x + 0.0034R2 = 0.99940.00.20.40.60.800.511.52常用定量方法熱導(dǎo)檢測(cè)器氫火焰離子

7、檢測(cè)器電子捕獲檢測(cè)器火焰光度檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器TCD thermal conductivity detectorFPD flame photometric detectorFID hydrogen flame ionization detectorMSD mass spectrum detectorECD electron capture detector商品名: HP-INNOWax30m0.25mm0.25um聚乙二醇: 極性強(qiáng)商品名: HP-130m0.25mm0.25um二甲基聚硅氧烷: 弱極性乙苯/對(duì)/間/鄰二甲苯分成4峰乙苯/對(duì)間/鄰二甲苯只有3峰固定液極性 由圖可見存在最佳流速（u

8、opt）。實(shí)際流速通常稍大于最佳流速，以縮短分析時(shí)間。CBuCuBuHuCuBAHopt20dd低于固定液使用溫度低于固定液使用溫度低于組分沸點(diǎn)低于組分沸點(diǎn)能低則低！能低則低！問什么要采用分流技術(shù)？問什么要采用分流技術(shù)？確定待測(cè)樣是否符合GC要求沸點(diǎn)低，沸點(diǎn)低，350350o oC,C,易揮易揮發(fā)，熱穩(wěn)定發(fā)，熱穩(wěn)定濃度盡可能低：小于10ppm待測(cè)樣不能含有水份(特殊柱：水樣)溶劑沸點(diǎn)盡可能低，盡量不選用丙酮柱溫要低于固定液使用溫度樣品必須經(jīng)過0.45m或0.22m的濾膜過濾測(cè)定對(duì)象拓展檢測(cè)器不同項(xiàng)目項(xiàng)目LCHPLC色譜柱柱長(zhǎng)色譜柱柱長(zhǎng)/cm10-20010-25色譜柱柱內(nèi)徑色譜柱柱內(nèi)徑/mm1

9、0-503-5固定相粒度：粒徑固定相粒度：粒徑/m75-6005-50色譜柱入口壓力色譜柱入口壓力/Mpa0.001-0.12-20色譜柱柱效色譜柱柱效/(理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)/m)2-502105-5104進(jìn)樣量進(jìn)樣量/g1-1010-6-10-2分析時(shí)間分析時(shí)間/h1-200.05-1.01 1、農(nóng)藥殘留量分析、農(nóng)藥殘留量分析 ：含氯農(nóng)藥：含氯農(nóng)藥 、有機(jī)磷、有機(jī)磷 農(nóng)藥農(nóng)藥 、除蟲菊等、除蟲菊等2 2、致癌物質(zhì)、致癌物質(zhì) ：硝基呋喃及其代謝物、霉：硝基呋喃及其代謝物、霉 素素 、亞硝胺、苯并芘等、亞硝胺、苯并芘等3 3、水質(zhì)分析：內(nèi)分泌污染物等、水質(zhì)分析：內(nèi)分泌污染物等4 4、其它、其它

10、1 1、蛋白質(zhì)分析、蛋白質(zhì)分析2 2、肽類的分析、肽類的分析3 3、核酸、核酸4 4、氨基酸、氨基酸 5 5、其它、其它1 1、新藥研發(fā)：目標(biāo)物的檢測(cè)、純度等、新藥研發(fā)：目標(biāo)物的檢測(cè)、純度等2 2、藥品的預(yù)處理：片劑，油膏，水劑等、藥品的預(yù)處理：片劑，油膏，水劑等3 3、體液：血、尿、脊椎液、唾液等、體液：血、尿、脊椎液、唾液等4 4、抗菌素、抗菌素 ：青霉素：青霉素 、甾族、甾族( (激素激素) )等等 5 5、其它、其它進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑泵混合器溶劑柜溶劑柜真空脫氣機(jī)真空脫氣機(jī) G1322A四元泵四元泵 G1311A裝有高分子膜裝有高分子膜的真空容器。的真空容器。溶解氣體的分溶解

11、氣體的分子尺寸較小，子尺寸較小，與高分子膜有與高分子膜有更強(qiáng)的親和力更強(qiáng)的親和力。 只有一個(gè)泵，配只有一個(gè)泵，配有比例閥，能夠有比例閥，能夠在不同時(shí)間吸取在不同時(shí)間吸取不同溶劑不同溶劑自動(dòng)進(jìn)樣自動(dòng)進(jìn)樣100100樣品盤樣品盤/ /機(jī)器手機(jī)器手/ /自動(dòng)洗針自動(dòng)洗針機(jī)械手樣品盤柱溫箱外掛架UV/VisUV/Vis雙燈，全波長(zhǎng)檢測(cè)，需選擇目標(biāo)分析物的特征波長(zhǎng)即可，兼顧強(qiáng)度與噪聲水平雙燈，全波長(zhǎng)檢測(cè)，需選擇目標(biāo)分析物的特征波長(zhǎng)即可，兼顧強(qiáng)度與噪聲水平檢測(cè)器鎢燈鎢燈耦合透鏡耦合透鏡氘燈氘燈光源透鏡光源透鏡(消色差透鏡消色差透鏡)氧化鈥濾光片氧化鈥濾光片支撐透鏡支撐透鏡Flow cell光譜透鏡光譜透鏡

12、光柵光柵陣列陣列狹縫狹縫MSDMSD進(jìn)樣器高壓泵流動(dòng)相色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理反相反相HPLC 極性極性:固定相固定相 流動(dòng)相流動(dòng)相 固定相固定相 - 極性強(qiáng)極性強(qiáng) 流動(dòng)相流動(dòng)相(己烷己烷, 庚烷庚烷)- 極性極性弱弱 極性物質(zhì)后出峰極性物質(zhì)后出峰正相色譜正相色譜 20%反相色譜反相色譜80%正相色譜正相色譜 20%反相色譜反相色譜80%與固定相與固定相極性相近極性相近tR長(zhǎng)長(zhǎng)主流類型類型性質(zhì)性質(zhì)色譜分離方式色譜分離方式烷基C8非極性反相、離子對(duì)烷基C18非極性反相、離子對(duì)苯基非極性反相芳硝基弱極性反相或正相氰基極性正相（反相）氨基極性正相（反相、陰離子交換）色譜柱的類型及適用范圍色譜柱的類型及適

13、用范圍常用溶劑：乙腈、甲醇、水等乙腈、甲醇、水等等度洗脫：流動(dòng)相比例恒定流動(dòng)相比例恒定梯度洗脫：逐步提高有機(jī)溶劑比例逐步提高有機(jī)溶劑比例實(shí)際使用：甲醇甲醇- -水水/ /乙腈乙腈- -水混合體系水混合體系進(jìn)樣前，必須檢測(cè)樣品進(jìn)樣前，必須檢測(cè)樣品pH值，允許范圍值，允許范圍27樣品必須經(jīng)過樣品必須經(jīng)過0.45m或或0.22m的的濾膜過濾濾膜過濾進(jìn)進(jìn)HPLC的樣品需要嚴(yán)格控制樣品的濃度范圍，防止系統(tǒng)污的樣品需要嚴(yán)格控制樣品的濃度范圍，防止系統(tǒng)污染及平頭峰的出現(xiàn)。染及平頭峰的出現(xiàn)。連接色譜柱時(shí)，應(yīng)注意連接方向，防止反接、反沖色譜柱。連接色譜柱時(shí)，應(yīng)注意連接方向，防止反接、反沖色譜柱。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，

14、應(yīng)使色譜柱內(nèi)充滿純有機(jī)溶劑。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)使色譜柱內(nèi)充滿純有機(jī)溶劑。HPLC流動(dòng)相的所有溶劑至少需經(jīng)過流動(dòng)相的所有溶劑至少需經(jīng)過G4砂芯漏斗的過濾，砂芯漏斗的過濾，且需要超聲脫氣且需要超聲脫氣 HPLC流動(dòng)相的溶劑至少應(yīng)為流動(dòng)相的溶劑至少應(yīng)為HPLC級(jí)級(jí)/色譜級(jí)并與填料相色譜級(jí)并與填料相匹配，水應(yīng)為高純水（在夏季應(yīng)每天更換）匹配，水應(yīng)為高純水（在夏季應(yīng)每天更換） 嚴(yán)禁長(zhǎng)時(shí)間以純水作為流動(dòng)相嚴(yán)禁長(zhǎng)時(shí)間以純水作為流動(dòng)相 最好用流動(dòng)相溶樣最好用流動(dòng)相溶樣緩沖液的緩沖液的pH值，在填料的允許范圍（一般為值，在填料的允許范圍（一般為pH2-8）內(nèi)）內(nèi)若需要使用緩沖液，也應(yīng)控制濃度，一般使用若需要使用緩沖液，也應(yīng)控制