第四次分生討論課問題四整合課件

1、 主要分以下幾個方面進(jìn)行闡述 （1）對資料gene bank 中的基因的分析 （2）cDNA的獲取 （3）cDNA的擴(kuò)增 （4）cDNA后續(xù)處理以下是查找到的全長基因序列 利用利用TRIZOL 發(fā)抽提雌性小鼠的卵細(xì)胞中的所有發(fā)抽提雌性小鼠的卵細(xì)胞中的所有RNA得到得到以下圖示結(jié)果：以下圖示結(jié)果： 5m7Gppp - AAA 3(抽提的抽提的mRNA）5m7Gppp - AAA 3 （mRNA） - （cDNA）5m7Gppp - AAA 3 （mRNA） - TTT （cDNA） -AAA3 -TTT5RNase H DNA-pol 緩沖液緩沖液 首先我們必須得設(shè)計(jì)好引物，本次實(shí)驗(yàn)的目的是擴(kuò)增

2、出133-1941位中的核苷酸鏈。因此在擴(kuò)增之前必須得先設(shè)計(jì)primer 設(shè)計(jì)引物的方法： 走 以下是設(shè)計(jì)引物的一個過程： -3 5- forward primer Reverse primer -3 -5 獲得高濃度的cDNA分子之后，由于末端擴(kuò)增出的片段與表達(dá)載體并不匹配，因此為了更好的進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，因此我們還需要對獲得懂得cDNA進(jìn)行后續(xù)的處理。 以下為擴(kuò)增后的cDNA分子處理： -AAA3 -TTT5 -AAA3 -TTT5修齊末端37 10min目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞植物的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法電擊法注射法化學(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化花粉管通

3、道法轉(zhuǎn)基因動物 （受精卵原核）顯微注射法 迄今較為普遍最有成效（小鼠、綿羊、豬、大鼠、兔、牛、魚.）導(dǎo)入的外源基因片段可長達(dá)導(dǎo)入的外源基因片段可長達(dá)50kp，且無需載體。且無需載體。難以控制整合率，檢測必須等難以控制整合率，檢測必須等到子代出生。到子代出生。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 (小鼠、家禽)逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸 單鏈RNA 反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞核基因組 雙鏈DNA 整合率高 100% 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對于多細(xì)胞轉(zhuǎn)化的優(yōu)越性（培育轉(zhuǎn)基因禽類研究中有廣泛應(yīng)用，目前制備轉(zhuǎn)基因禽類最有效和最成功的方法） 只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(10kb) 潛在的致癌性重組重組整合整合胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem c

4、ells）法 外源基因直接導(dǎo)入ES細(xì)胞篩選、富集被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞注入受體囊胚腔移入假孕個體獲得轉(zhuǎn)基因動物能在細(xì)胞水平進(jìn)行篩選和確定性別能隨機(jī)整合和同源重組整合 基因打靶能加入、剔除或替換某個基因（小到一個或幾個核苷酸）目前ES細(xì)胞僅在小鼠、雞和人的早期胚胎中分離出來ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件苛刻、技術(shù)要求高,成本大目的基因的篩選與鑒定 制作人-莫思凡 目的：篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴(kuò)增。 首先：篩選出帶有載體的克隆 其次：篩選出帶有重組體的克隆 最后：篩選出帶有特異DNA序列的克隆 方法： 遺傳學(xué)方法 核酸雜交法 酶切鑒定 PCR技術(shù) 免疫學(xué)方法 遺傳學(xué)方法 （一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法（插入滅

5、活法） 在基因工程中使用的所有載體分子,都至少含有一個選擇標(biāo)記。載體常有抗生素抗性基因,如氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）。 （二）-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（-互補(bǔ)） -半乳糖苷酶基因的顯色反應(yīng),將重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化子同非重組的載體轉(zhuǎn)化子區(qū)別開來.（一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法（一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法檢測外源檢測外源DNADNA插入作用的一種通用方法是插入失活效應(yīng)。插入作用的一種通用方法是插入失活效應(yīng)。1.1.以真核表達(dá)載體為例以真核表達(dá)載體為例（1 1）真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體應(yīng)具有的特性應(yīng)具有的特性 在真核表達(dá)載體上有兩個

6、抗生素基因，Ampr基因內(nèi)有一個Pst限制性核酸內(nèi)切酶的唯一識別位點(diǎn)，Tetr基因內(nèi)有BamH和Sal兩種限制性核酸內(nèi)切酶單一識別位點(diǎn)。（一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法（一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法1.1.以真核表達(dá)載體為例以真核表達(dá)載體為例（2 2）篩選重組體的原理篩選重組體的原理 在在Ampr和和Tetr這兩個基因內(nèi)的任一插入作用，都會導(dǎo)致這兩個基因內(nèi)的任一插入作用，都會導(dǎo)致Ampr基基因因或或Tetr基因基因出現(xiàn)功能性出現(xiàn)功能性失活失活，于是，所形成的重組質(zhì)粒都將具有，于是，所形成的重組質(zhì)粒都將具有AmpsTetr或或Amprtets的表型。的表型。 當(dāng)當(dāng)外源外源DNADNA片段插入片段插

7、入真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體DNADNA的的BamH或或Sal位點(diǎn)時，位點(diǎn)時，抗四抗四環(huán)素基因失活環(huán)素基因失活（Tetr Tets ），重組體轉(zhuǎn)化子必定具有），重組體轉(zhuǎn)化子必定具有AmprTets表型表型。因此，。因此，將轉(zhuǎn)化菌先涂布在含有將轉(zhuǎn)化菌先涂布在含有Amp的瓊脂平板上的瓊脂平板上，并將存活的，并將存活的Ampr菌落菌落原位影印原位影印到另一個含有到另一個含有Tet的瓊脂平板上的瓊脂平板上，凡是在，凡是在Amp平板上生長平板上生長，而，而不在不在Tet平板上平板上生長的菌落生長的菌落，就，就必定是必定是已經(jīng)插入了外源已經(jīng)插入了外源DNA片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆.

8、.如下圖所示如下圖所示同樣同樣, ,在真核表達(dá)載體的在真核表達(dá)載體的AmpAmpr r基因序列中基因序列中, ,利用利用PstPst限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn), ,插入外源插入外源DNADNA片段片段, ,也也能應(yīng)用插入失活作用檢測重組質(zhì)粒能應(yīng)用插入失活作用檢測重組質(zhì)粒, ,當(dāng)然當(dāng)然, ,所挑選所挑選的菌落就應(yīng)該是具有的菌落就應(yīng)該是具有AmpAmps sTetTetr r的表型的表型（一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法（一）抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法載體載體載體AmprTetrAmprTetrAmprTets+ +菌落原位影印菌落原位影印Amp瓊脂平板瓊脂平板Tet瓊脂平板瓊脂平

9、板圖圖 應(yīng)用抗生素抗性基因插入失活篩選重組體應(yīng)用抗生素抗性基因插入失活篩選重組體（二）（二）- -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法1.1.乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)阻遏蛋白阻遏蛋白- -半乳半乳糖苷酶糖苷酶- -半半乳糖苷乳糖苷透過酶透過酶- -半乳糖半乳糖苷乙酰基苷乙?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶mRNAmRNAlacAlacYlacZlacOPZYAlacIPIRNA聚聚合酶合酶（二）（二）- -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法2.2.- -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法原理半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法原理 有許多質(zhì)粒載體具有有許多質(zhì)粒載體具有- -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)的檢測功

10、能半乳糖苷酶顯色反應(yīng)的檢測功能. . 應(yīng)用這些載體系列，當(dāng)外源應(yīng)用這些載體系列，當(dāng)外源DNADNA插入插入到它的到它的lacZlacZ基因基因上時，上時，可造成可造成- -半乳糖苷酶的失活效應(yīng)半乳糖苷酶的失活效應(yīng)，就可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌，就可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加落在添加X-gal-IPTGX-gal-IPTG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中的顏色變化顏色變化鑒別出重組子和非重鑒別出重組子和非重組子。組子。（二）（二）- -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法3.3.舉例舉例 pUC質(zhì)粒質(zhì)粒：帶有：帶有- -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列）的調(diào)控序列和和- -半乳糖

11、苷酶半乳糖苷酶N N端端146個氨基酸的編碼序列個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多種限制性核酸酶單。這個編碼區(qū)中插入了一個多種限制性核酸酶單一識別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，但并一識別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，但并沒有破壞沒有破壞lacZ的閱讀框架。的閱讀框架。 大腸桿菌菌株：大腸桿菌菌株：帶有帶有- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。端部分序列的編碼信息。 在各自獨(dú)立的情況下，在各自獨(dú)立的情況下，pUC質(zhì)粒和大腸桿菌編碼的質(zhì)粒和大腸桿菌編碼的- -半乳半乳糖苷酶片段都沒有活性。糖苷酶片段都沒有活性。（二）（二）- -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法3. 3. 舉例舉例 當(dāng)

12、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后, ,可形成可形成具有酶活性具有酶活性的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì), ,它在生色底物它在生色底物X-gal的存在下被的存在下被IPTG( (異丙基異丙基- -D-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)形成硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落藍(lán)色菌落。當(dāng)外。當(dāng)外源片段源片段插入插入到到pUC質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后，則會導(dǎo)致質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后，則會導(dǎo)致讀碼框架改變讀碼框架改變，表達(dá)蛋，表達(dá)蛋白白失活失活，因此，在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能，因此，在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成形成白色菌落白色菌落。因此，根據(jù)這種。因此，根據(jù)這種- -半乳糖苷酶的

13、顯色反應(yīng)，可將重組質(zhì)粒半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體與自身環(huán)化的載體DNADNA分開。分開。將噬菌體感染形成的噬菌斑影印在硝將噬菌體感染形成的噬菌斑影印在硝酸纖維膜上變性酸纖維膜上變性 帶有目的基因的放射性帶有目的基因的放射性DNADNA或或cDNAcDNA作探針進(jìn)行雜交作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影放射性自顯影 雜交信號（雜交信號（黑點(diǎn)）黑點(diǎn)）對應(yīng)的噬菌斑對應(yīng)的噬菌斑即為陽性即為陽性克隆克隆。核酸分子雜交檢測法（1 1）菌落印跡原位雜交）菌落印跡原位雜交 菌落印跡原位雜交的菌落印跡原位雜交的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是：適于是：適于高密度高密度菌落的篩選菌落的篩選, ,對對于噬菌斑平板于噬菌斑

14、平板, ,它可以連續(xù)影印幾張同樣的硝酸纖維濾膜它可以連續(xù)影印幾張同樣的硝酸纖維濾膜, ,獲得獲得數(shù)張同樣的數(shù)張同樣的DNA印跡。因此，能夠進(jìn)行印跡。因此，能夠進(jìn)行重復(fù)篩選重復(fù)篩選，效率高效率高，可可靠性強(qiáng)靠性強(qiáng)，而且可以連續(xù)使用，而且可以連續(xù)使用兩種兩種或或數(shù)種探針數(shù)種探針篩選篩選同一套同一套重組體重組體DNADNA，是一種最常規(guī)的檢測手段。，是一種最常規(guī)的檢測手段。(2) (2) 核酸分子雜交：核酸分子雜交：.Southern.Southern雜交分析：雜交分析：由英由英國國SouthernSouthern（19751975）發(fā)明，）發(fā)明，將瓊將瓊脂糖中脂糖中DNADNA轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到尼龍膜尼

15、龍膜進(jìn)行進(jìn)行DNADNA分子雜交分子雜交分析的方法。分析的方法。篩選基因庫得到篩選基因庫得到陽性克隆陽性克隆將限制性酶酶切與將限制性酶酶切與SouthernSouthern雜交雜交結(jié)合結(jié)合繪制限制性酶圖譜繪制限制性酶圖譜。.Northern.Northern雜交分析：雜交分析： 與與SorthernSorthern雜交的原理和雜交的原理和程序相同。程序相同。用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，平，檢測檢測mRNAmRNA的存在的存在。 物理檢測法(酶切鑒定)重組質(zhì)粒的快速提取與酶切鑒定重組質(zhì)粒的快速提取與酶切鑒定 經(jīng)過遺傳篩選得到的陽性克隆還

16、必須進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，經(jīng)過遺傳篩選得到的陽性克隆還必須進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，酶酶切鑒定切鑒定是最常用的方法之一。是最常用的方法之一。 通過提取通過提取“陽性克隆陽性克隆”的質(zhì)粒，酶切分析的質(zhì)粒，酶切分析“陽性克隆陽性克隆”中中質(zhì)粒的質(zhì)粒的大小大小和和酶切圖譜酶切圖譜，通過這種方法鑒定載體中是否含有外，通過這種方法鑒定載體中是否含有外源源DNADNA片段，載體中是否含有正確的目的片段，載體中是否含有正確的目的DNADNA片段。這種方法判片段。這種方法判斷的斷的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)是目的是目的DNADNA分子和載體的分子大小及酶切圖譜。分子和載體的分子大小及酶切圖譜。Mr12345678910Mr:DNA分子分子Marker; ;1 1: :目的目的DNA片段片段; ;2 2: :目的目的DNA片段片段EcoR酶切酶切; ;3 3: :空載體空載體EcoR酶切酶切; ;4-104-10: :為不同為不同”陽性克隆陽性克隆”質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ec